痰液細菌學檢驗的標準化操作程序

1、.：.；痰液細菌學檢驗的規(guī)范化操作程序盧先雷前言 眾所周知，傳統(tǒng)習慣程序的痰標本細菌學檢驗其臨床符合率并不高,其緣由是多方面的。除了痰標本采集不規(guī)范導致的不合格標本帶來的培育結(jié)果與病人感染不相符外，還由于微生物和人體的相關(guān)性本身就具有復雜性：源自細菌的致病與條件致病的辨證性，如致病菌能夠為正常攜帶，而細菌在肺通氣功能異常病人的下呼吸道的可以發(fā)生單純定植或感染，要證明培育結(jié)果與感染的相關(guān)性是醫(yī)學微生物學所面臨的難題，這也使得不斷以來在對于痰培育的規(guī)范化進展非常緩慢，以致在各版上也未提出相應(yīng)詳細可行的令全國同行公認的一致規(guī)范的規(guī)范化操作程序SOP和完好的痰液培育的質(zhì)量控制方法。習慣程序的痰標本細菌

2、學檢驗的緩慢也很不順應(yīng)臨床診斷治療的迫切性。故而，建立規(guī)范而快速的痰液細菌學檢驗的SOP對于提高呼吸系統(tǒng)感染病的診治程度和控制抗生素的濫用等問題均有重要的作用痰培育陽性率普遍教低，臨床符合率差的關(guān)鍵要素是痰標本采集不規(guī)范，不合格痰標本將直接導致病原菌被分別的時機降低，大量正常菌群也會抑制病原菌的生長或干擾病原菌的檢出，降低了臨床符合率；再有就是操作程序的不規(guī)范，不注重直接涂片，檢驗過程控制的不嚴密也是導致臨床符合率低的重要緣由。他們經(jīng)過SOP的臨床運用情況的分析，痰培育陽性率和臨床符合率均能夠被提高，并且細菌分布統(tǒng)計結(jié)果顯示本文與國外文獻所報道的情況根本一致。對于直接涂片的意義，在于判別標本中

3、微生物有無、類型、染色特性、形狀特征，標本的污染情況，還可對痰標本中能夠的病原菌初步診斷(根據(jù)人體被病原菌感染后的炎性滲出包裹和白細胞吞噬反響)，判別能否存在復數(shù)菌感染，動態(tài)察看處于治療過程中不同時期所送檢的標本中病原菌情況的變化好像種病原菌數(shù)量的增減，機體的免疫反響，菌群的交替。甚至可以推斷臨床治療療效和病人病情的變化和轉(zhuǎn)歸，醫(yī)院內(nèi)感染的發(fā)生等，具有重要意義。為了滿足高質(zhì)量需求，對首代分別培育基應(yīng)該進展嚴厲的質(zhì)量控制。另外，對首代分別培育基的選用和搭配的合理化也需求進展討論。為了縮短鑒定時間，在細菌鑒定中可采用酶法鑒定：所謂酶法鑒定：國外八十年代中一些微生物學家在研討中發(fā)現(xiàn)由于細菌在生長分裂

4、過程中細胞內(nèi)集聚了大量的與物質(zhì)代謝相關(guān)的各種酶類，可在短時間內(nèi)釋放到胞外稱胞外酶可迅速分解相應(yīng)底物。故而，當在高靈敏微量生化反響培育基中參與大量濃重的菌液時，那么無須細菌繁衍就能在短時間內(nèi)產(chǎn)生反響。根據(jù)這一實際采用高靈敏微量生化反響單元與數(shù)值分類法相結(jié)合而成的酶法生化編碼鑒定系統(tǒng)可對細菌進展快速鑒定如API rapid E/NH n、Sensititre AP、MicroScan Rapid Neg ID、Vitek GNI+、RapID onE、超聲波輔助快速酶法革蘭陰性桿菌鑒定系統(tǒng)，鑒定時間可縮短至小時。但鏈球菌由于首代分別生長慢，菌落細小，不能搜集充足菌量，暫不能采用酶法鑒定，其鑒定仍沿

5、用常規(guī)生化反響鑒定或免疫學方法鑒定. 規(guī)范化操作程序.標本接納挑選方案：目測：黃色、灰色、血性、鐵銹色，渾濁、 稠厚，呈現(xiàn)團塊狀的標本為合格標本；而無色透明、有灰白片狀物或黑色小點，有明顯食物渣滓、紙屑灰塵的為不合格標本。顯微鏡下挑選：對經(jīng)過目測挑選的標本，在洗滌前還須再經(jīng)過顯微鏡下挑選：取約 .ml痰液黃豆大小用接種環(huán)均勻涂布成cm大小的涂膜，在顯微鏡下，凡膿細胞/LP且鱗狀上皮/LP的標本為合格標本，可進入下一步程序；而膿細胞+或鱗狀上皮/LP的標本為不合格標本，應(yīng)拒收。. 標本預處置：按第版相關(guān)章節(jié)，采用先用ml生理鹽水洗滌兩次，經(jīng)過ml生理鹽水稀釋后，參與%的PH.的胰蛋白酶溶液消化m

6、in后接種。并同時在洗滌后制造原始痰涂片，進展染色鏡檢。. 讀片：根據(jù)人體對細菌/真菌感染在早期主要以非特異性免疫的細胞免疫為主的特點，結(jié)合呼吸系統(tǒng)生理病理特點，論述痰液構(gòu)成過程和排出過程，他們可以得知，在下呼吸道中感染中構(gòu)成的炎性滲出、包裹物中存在與感染直接相關(guān)的病原菌，在自然排痰的過程中會被上呼吸道的正常菌群所污染，但污染菌位于炎性包裹物之外，且人體對正常菌群具有共生性維護因此不會產(chǎn)生吞噬景象，借此實際，他們將選擇痰標本中膿細胞成團塊狀分布，集中而不稠密，且周圍無鱗狀上皮細胞或無大量成團狀分布的細菌球的區(qū)域為讀片區(qū)，仔細收尋個視野中膿細胞聚集處的膿細胞胞漿中有無吞噬的細菌及細菌的染色陳列特

7、征，菌體特征如粗細、長短、扭曲并作記錄，將此作為確定病原菌的實際根據(jù)。.標本的接種培育：普通情況接種BA、Choc含萬古霉素mg/L、麥康凱/MecK(即“分科瓊脂NBIIA)、CHROMagar，BA、Choc置%CO、潮濕環(huán)境培育，麥康凱/MecK、CHROMagar置普通環(huán)境培育；疑心為軍團菌的加種BCYE-培育基，疑心為百日咳的加種Boudet-Gengou培育基，疑心為肺結(jié)核的加種羅-瓊氏培育基或采用商品化專門的分枝桿菌培育基培育；疑心為肺炎支原體感染的加種Hayflick雙相培育基或采用免疫學及分子生物學方法檢測，肺炎衣原體須用免疫學或分子生物學方法。.讀碟：經(jīng)過h隔夜培育，但孿生

8、球菌、營養(yǎng)缺陷鏈球菌以及分枝桿菌那么需延伸培育時間. G+菌：BA生長、Choc不生長、MecK不生長，Gram染色：分G+co革蘭陽性球菌 ,G+ b革蘭陽性桿菌. G+co依托溶血特征，菌落形狀、菌落顏色、菌體形狀區(qū)分:葡萄球菌：淡黃色/白色，中等大小，較凸，規(guī)那么圓形，/溶血，較潮濕，除金黃色葡萄球菌外，普通不具有臨床意義；微球菌：黃色/白色/橙色，中等大小，較凸，規(guī)那么圓形，不溶血，較枯燥，不易乳化較葡萄球菌生長緩慢，該菌普通無臨床意義；鏈球菌：白色/灰白色、凸起小菌落，溶血為溶血型鏈球菌；灰白隆起中心扁平或凹陷，.-.mm大小的寬大溶血為肺炎鏈球菌，該菌是最常見的肺部感染病原菌，在社

9、區(qū)獲得性感染中有重要的位置；細如針尖，白色凸起溶血的為草綠色鏈球菌，自然咯痰標本中的草綠色鏈球菌普通不具有臨床意義；腸球菌：灰白，低凸，.mm左右之溶血菌落，較潮濕，但普通不具有臨床意義；口腔球菌：白色凸起較大菌落，不溶血，黏著，接種針挑之那么整個菌落挑起，瓊脂上不留痕跡。該菌偶爾可引起肺部的嚴重感染，普通好發(fā)生于COPD病人和肺氣腫病人；孿生球菌：白色、凸起細小菌落，溶血，生長慢h僅.mm，在含羊血的MH瓊脂上不生長。該菌是上呼吸道的正常菌群組成之一，普通不導致肺部感染；. G+ b依托溶血特征，菌落形狀、菌落大小、菌體形狀區(qū)分：棒狀桿菌：白色.-.mm左右大小，較枯燥，不溶血/狹窄溶血的為

10、白喉或普通棒狀桿菌；小而潮濕，灰白/無色，半透明的為J-K棒狀桿菌；灰白細小，溶血的能夠為假結(jié)核、化膿放線菌、溶血分泌桿菌；除白喉桿菌外，假結(jié)核、化膿放線菌、溶血分泌桿菌是稀有的咽喉部病源菌，棒狀桿菌普通不導致肺部感染；乳桿菌：細小，白色凸起溶血菌落，有特殊的酸臭味，口腔正常菌群，無臨床意義；芽孢桿菌：灰白大菌落，外表粗糙如毛玻璃狀、蠟狀、邊緣不規(guī)那么，不同種類菌落形狀差別宏大，寬大溶血。延伸培育時間，菌落從潮濕變得枯燥，邊緣呈放射狀分散，構(gòu)成葉狀、掌狀、雪花狀、齒輪狀等，經(jīng)常為痰培育的污染菌；BA生長、Choc生長、MecK不生長，Gram染色：G+co平面球菌、藻球菌：血瓊脂上為溶血，.-

11、.mm大小，在Choc上呈現(xiàn)金屬色澤，無臨床意義。 . G-菌：根據(jù)形狀分為G- b革蘭陰性桿菌 、G-co革蘭陰性球菌 、以及根據(jù)對特殊營養(yǎng)的需求對苛養(yǎng)性G- b進一步分類，常見的如嗜血桿菌，軍團菌等：. BA生長、Choc生長、MecK生長，Gram染色：G- b氧化酶、分科瓊脂顏色腸桿菌：氧化酶-，分科瓊脂上黃色潮濕大菌落；弧菌：氧化酶+，分科瓊脂上淡黃色扁平大菌落；非發(fā)酵菌：氧化酶+/-，分科瓊脂上藍色/無色透明小菌落鮑曼不動桿菌為中等大小，菌落聚集處產(chǎn)不分散黃色色素，分別菌落為蘭色；. BA生長、Choc生長、MecK不生長，Gram染色：G-co氧化酶+、觸酶+奈瑟菌：白色/黃色中

12、等大小菌落，該類細菌為口腔常見正常菌群，該菌在痰培育中含量的高低反響了標本采集形狀的合格程度，大量出現(xiàn)提示培育結(jié)果將是不可信的； 卡他莫拉菌：白色小菌落h內(nèi)，菌落有脆性，用接種環(huán)推之可移，是兒科和老年病人常見的下呼吸道病原菌；. BA不生長/細小、Choc生長、MecK不生長，Gram染色：G-b、菌體細小或呈扭曲之長絲狀嗜血桿菌：灰色/無色，半透明，.-.mm的多為流感嗜血桿菌，該菌為最常見的肺部感染病原菌，可發(fā)生于各個年齡層次，其高攜帶與COPD發(fā)病有較強的相關(guān)性；灰色略黃，不透明，.-.mm的多為副流感嗜血桿菌。普通副流感嗜血桿菌不導致肺部感染，大量出現(xiàn)提示培育結(jié)果將是不可信的；. BA

13、不生長、Choc不生長、MecK不生長、BCYE-生長/或在含有L-半胱氨酸、鐵離子、復合抗生素選擇劑的強化血瓊脂上生長Gram染色：G-b、菌體細、長絲狀提示能夠為軍團菌：該菌在BCYE-上 h為中等大小扁平菌落，灰白色，較粘著；該菌具有較強的生物危險性，其中嗜肺軍團菌可傳染；.真菌及奴卡菌：BA、Choc、分科瓊脂、CHROMagar均生長Gram染色形狀、生長速度真菌：酵母樣真菌，菌落中等大小，生長快，多數(shù)可在CHROMagar上顯色；大多為口腔咽喉正常菌群，普通不導致肺部感染，但免疫缺陷、糖皮質(zhì)激素、長期大劑量的抗生素運用可添加該類微生物時機感染的能夠性；煙曲霉菌，絲狀真菌菌落，培育h

14、時菌落為白色泛綠，h后菌落迅速轉(zhuǎn)為褐色，中心粉末狀反面為黃褐色如煙熏狀，該菌為肺部最常見的條件致病菌，感染時患者病癥重，預后非常差；奴卡菌：小菌落，生長慢，菌落皺褶，呈顆粒狀，有時產(chǎn)生褐色、黃色、黑色等色素，該類細菌可導致肺膿腫，標本膿性，有硫磺顆粒者應(yīng)高度疑心該菌；.肺炎支原體：固體培育基上，低倍鏡或解剖顯微鏡下為典型“荷包蛋樣菌落，在Hayflick雙相培育基的液體中使培育基變黃，該類微生物是最常見的非典型性肺炎的病原體，在社區(qū)獲得性感染中有著很高的比例。. 細菌鑒定：在痰標本的直接涂片鏡檢結(jié)果的指點下進展分別鑒定：根據(jù)痰液涂片直接鏡檢結(jié)果中被炎性包裹及膿細胞吞噬的細菌的革蘭染色后的形狀特

15、征為指引，閱讀平皿中菌落形狀并作菌落細菌的革蘭染色，選擇與鏡檢結(jié)果一致的細菌該步驟應(yīng)該在閱歷豐富的高資歷微生物檢驗教師的帶著下進展，必要時進展純培育，再根據(jù)該細菌在各種不同培育基上的生長情況及相應(yīng)菌落特征進展初步鑒定和分群，隨后在細菌革蘭氏染色鏡檢特點、觸酶、氧化酶等簡單實驗的進一步鑒定和分群到相關(guān)的科或?qū)俸蟛捎孟鄳?yīng)的編碼鑒定系統(tǒng)鑒定手工或自動化鑒定，對溶血性鏈球菌及肺炎鏈球菌在生化反響的同時采用乳膠試劑作為補充。為了縮短鑒定時間還可采器具有培育鑒定一體化作用的多功能培育基、配合快速酶法編碼鑒定系統(tǒng)進展鑒定。. 藥敏實驗：按CLSI相關(guān)規(guī)定進展藥敏實驗。尚可采用特殊的藥敏實驗察看計算方法如自動

16、化儀器采用的光電濁度速率法、熒光速率法等縮短藥敏時間。也可按文獻提供的方法，及時向臨床提供一份快速的初步報告。. 結(jié)果報告：常規(guī)痰培育報告應(yīng)包括完好的病人信息、臨床診斷、抗生素運用情況由臨床醫(yī)生在懇求單上注明、未染色標本直接涂片結(jié)果有無膿細胞、膿細胞數(shù)量、上皮細胞數(shù)量、二者比例、有無真菌孢子菌絲、有無寄生蟲等、Gram染色鏡檢結(jié)果包括膿細胞數(shù)量、上皮細胞與胞外正常菌群數(shù)量與污染程度、膿細胞胞內(nèi)吞噬細菌真菌孢子的情況，炎性包裹物內(nèi)細菌和真菌的存在情況、膿細胞和炎性包裹物內(nèi)的細菌真菌的染色特征、形狀特征和陳列特征、所分別細菌的鑒定結(jié)果、耐藥監(jiān)測結(jié)果、普通藥敏結(jié)果、該檢驗結(jié)果與臨床診斷和治療相關(guān)性的

17、評述和建議。. 質(zhì)量控制：為保證細菌學檢驗結(jié)果的快速準確和臨床符合率，應(yīng)對全過程進展嚴厲的質(zhì)量控制。痰標本細菌學檢驗質(zhì)量控制包括二大部分：. 標本的質(zhì)量控制：主要包括向臨床醫(yī)護人員講授痰標本的正確性的采集方法、送檢時限和本卷須知，不定時的到臨床調(diào)查規(guī)范化采集的執(zhí)行情況，定期反響統(tǒng)計信息；堅持對所送標本進展外觀和鏡下的初篩；堅持標本的直接涂片鏡檢包括不染色標本的高倍/低倍鏡濕片鏡檢、%KOH透明后鏡檢、革蘭染色后的油鏡鏡檢。. 檢驗過程的質(zhì)量控制，這部分又包括了以下方面和步驟：. 培育基質(zhì)量控制：主要是各種首代分別培育基的效果控制：包括不同培育基配制過程的規(guī)范化、質(zhì)控菌株生長情況控制應(yīng)包括GI指

18、數(shù)測定、菌落特征典型程度、而選擇性培育基還應(yīng)監(jiān)控抑菌選擇效果、菌落顯色培育基還應(yīng)察看菌落顯色能否靈敏和鮮明，以及培育基從臨床標本中分別出目的菌才干的測定。. 鑒定程度質(zhì)量控制：主要是采用典型質(zhì)控菌株對生化反響培育基、鑒定卡和微量生化管等試劑進展定期測試：測試工程：典型陰陽性反響、靈敏度、鑒定符合率和反復性。另外還應(yīng)對技術(shù)人員的技術(shù)程度的進展不延續(xù)的再培訓和不定期測試。. 藥敏實驗質(zhì)量控制：包括對MH培育基、藥敏紙片或MIC卡的質(zhì)量控制，方法參照CLSI相關(guān)規(guī)定。對于MRS、ESBL、HLAR、AMPC、金屬-內(nèi)酰胺酶等特殊耐藥表型應(yīng)堅持在小時察看后繼續(xù)培育至小時或小時MRS后復查一次。另外，在

19、藥敏實驗的同時還運用接種環(huán)挑取一環(huán)菌液作劃線接種，可對所配菌液進展純培育的驗證，并可同時監(jiān)控菌液濃度。. 采用全程質(zhì)控觀念對標本進展控制：采用標本直接涂片鏡檢結(jié)果推斷病原菌，指點分別鑒定方向；采用細菌培育特征營養(yǎng)要求高低、不同選擇選擇性培育基生長情況及菌落特征指點鑒定及對鑒定結(jié)果進展核對；采用鑒定結(jié)果對藥敏結(jié)果進展控制或采用藥敏的特殊譜型對鑒定結(jié)果進展控制即利用知菌對某種藥物的天然耐藥或天然敏感特征-；采用對臨床病歷的抽樣調(diào)查察看臨床治療效果，借以反響檢驗結(jié)果與臨床的符合率。 參考文獻. 過祥豹. 微生物學快速診斷法. 徐秀華主編. 臨床醫(yī)院感染.長沙：湖南科學技術(shù)，.-. . Karen C

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