實驗二血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳

1、關(guān)于實驗二血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳第一張，PPT共十六頁，創(chuàng)作于2022年6月一、實驗?zāi)康呐c要求了解電泳技術(shù)的一般原理學(xué)習(xí)醋酸纖維素薄膜電泳操作技術(shù)測定人血清中各種蛋白質(zhì)的相對百分含量第二張，PPT共十六頁，創(chuàng)作于2022年6月二、實驗原理1.電泳 是指帶電粒子在電場中向本身所帶電荷相反的電極移動的現(xiàn)象。 在一定pH條件下，不同的蛋白質(zhì)由于具有不同的等電點而帶不同性質(zhì)的電荷，因而在一定的電場中它們的移動方向和移動速度也不同，即它們的電泳遷移率不同，因此，可使它們分離2. 影響電泳遷移率的因素： 內(nèi)在因素：蛋白所帶凈電荷的量、蛋白的大小和形狀 外界因素：電場強度、溶液的pH值、溶液的離子強度和

2、電滲現(xiàn)象3.醋酸纖維素溶于有機溶劑（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均勻的薄膜則成為醋酸纖維素薄膜。該膜具有均一的泡沫狀的結(jié)構(gòu)，厚度約為120 m，有很強的通透性，對分子移動阻力很小。該薄膜電泳具有微量、快速、簡便、分辨力高，對樣品無拖尾和吸附現(xiàn)象等優(yōu)點第三張，PPT共十六頁，創(chuàng)作于2022年6月4. 經(jīng)醋酸纖維素薄膜電泳可將血清蛋白按電泳速度分為5條區(qū)帶，從正極端依次為清蛋白、1球蛋白、2球蛋白、球蛋白及球蛋白，經(jīng)染色可計算出各蛋白質(zhì)的百分含量。第四張，PPT共十六頁，創(chuàng)作于2022年6月三、實驗器材1. DYY-6C型 雙穩(wěn)定時電泳儀和DYY-型電泳槽，均為北京市六一儀器廠生

3、產(chǎn)2. 醋酸纖維薄膜（2 cm8cm）3. 培養(yǎng)皿：一排桌子公用5套，包括平衡、染色各用一套，漂洗用3套。 4. 點樣器5. 濾紙 6. 載玻片7. 鑷子8. 玻棒第五張，PPT共十六頁，創(chuàng)作于2022年6月四、實驗試劑巴比妥-巴比妥納緩沖液(pH8.6，0.07mol/L，離子強度0.06) 稱取1.66g巴比妥(AR)和12.76g巴比妥納(AR)，置于三角燒瓶中，加蒸餾水約600ml，稍加熱溶解，冷卻后用蒸餾水定容至1000ml，置4保存，備用。2. 血清蛋白染色(1)染色液(0.5氨基黑10B)：稱取0.5g氨基黑10B，加蒸餾水40ml，甲醇(AR)50ml，冰乙酸(AR)10ml，

4、混勻溶解后置具塞試劑瓶內(nèi)貯存。(2)漂洗液：取95乙醇(AR)45ml，冰乙酸(AR)5ml，和蒸餾水50ml，混勻置具塞試劑瓶中貯存。第六張，PPT共十六頁，創(chuàng)作于2022年6月五、測試材料未溶血的人或動物血清第七張，PPT共十六頁，創(chuàng)作于2022年6月電泳儀由電泳槽和穩(wěn)壓電源兩部分組成，兩者之間有專門的連線連接。穩(wěn)壓電源用于調(diào)節(jié)電壓和通電時間。當(dāng)電泳槽和穩(wěn)壓電源連接好后，將點好樣的醋酸纖維薄膜搭在濾紙橋上，蓋上蓋子，通電，調(diào)整好電壓，進行電泳。注意電泳槽的電極方向，負極應(yīng)與醋酸纖維薄膜上的點樣原點在同一側(cè)。目前，該電泳儀已改進為數(shù)顯式的DYY-6C型。 浸泡：將28 cm醋酸纖維薄膜迎著光

5、辨別光澤面和無光澤面。在無光澤面距短邊一端1.5 cm處用鉛筆輕輕畫一條點樣線，將之置于盛有緩沖液的平皿中，浸泡30 min方可用于點樣。點樣：用鑷子取出浸透的薄膜，夾在兩層粗濾紙內(nèi)吸干多余的緩沖液，然后平鋪在玻璃板上（無光澤面朝上）。在另一 載玻片上滴一滴血清，點樣器（用蓋玻片的一邊）在血清上蘸一下（可來回移動一次），再將點樣器輕印在加樣線上，使血清滲透到薄膜內(nèi)，形成均勻的直線。操作指南：第八張，PPT共十六頁，創(chuàng)作于2022年6月六、操作步驟 1. 醋酸纖維素薄膜的潤濕與選擇 將醋酸纖維素薄膜完全浸泡于緩沖液中約30min后，每組取醋酸纖維素薄膜1張，取時用鑷子夾住薄膜一端，放在折疊的濾紙

6、中，并用它吸干表面液體。2. 電泳槽的準(zhǔn)備 電泳槽有兩個互相隔離的槽，各自裝有緩沖液，接不同的電極，紅色為正極，黑色為負極。每個槽上都有一根可移動的橫桿，濾紙或紗布的一頭搭在橫桿上，另一頭浸入緩沖液中，形成了濾紙橋。兩桿之間的距離調(diào)節(jié)到略小于醋酸纖維薄膜的長度，點好樣的醋酸纖維薄膜就搭在濾紙橋上。第九張，PPT共十六頁，創(chuàng)作于2022年6月第十張，PPT共十六頁，創(chuàng)作于2022年6月3.點樣： 點樣時，先將毛細血管插入血清中，封住上端，在載玻片的一端均勻涂過，使樣品連續(xù)、均勻、適量，把載玻片在薄膜毛面上輕而溫和地印一下。點樣區(qū)距陰極端1.5cm處（見圖）。此步是實驗的關(guān)鍵。醋酸纖維素薄膜規(guī)格及

7、點樣位置示意圖（虛線處為點樣位置）第十一張，PPT共十六頁，創(chuàng)作于2022年6月4.電 泳 將點樣端的薄膜平貼在陰極電泳槽支架的濾紙橋上（點樣面朝下），另一端平貼在陽極端支架上(見下圖)。要求薄膜緊貼濾紙橋并繃直，中間不能下垂。 連接好電泳儀。在室溫下電泳，打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電流強度0.3mA/cm膜寬度（24片薄膜則為14.4mA）。通電5min后，調(diào)節(jié)電流強度0.5mA/cm膜寬度（24片薄膜則為24mA） ，電泳時間50min。電泳后，調(diào)節(jié)旋鈕使電流為零，關(guān)閉電泳儀切斷電源。第十二張，PPT共十六頁，創(chuàng)作于2022年6月5.染色： 電泳完畢后將薄膜取下, 放在含氨基黑10B染色液的培養(yǎng)皿

8、中浸泡5 min6.漂洗： 將薄膜從染色液中取出后移置漂洗液中漂洗數(shù)次，直至背景藍色脫盡，條帶清晰為止，可得到色帶清晰的電泳圖譜 。第十三張，PPT共十六頁，創(chuàng)作于2022年6月7.記錄和分析實驗結(jié)果漂洗完畢后將薄膜取出, 放在濾紙上。將薄膜上的5條色帶根據(jù)其顏色深淺、形狀、大小及相對位置進行描述、記錄在預(yù)習(xí)本上，并判斷分析其結(jié)果。8.整理好桌面上的儀器和試劑，并注意清潔自己的操作臺，請老師驗收，實驗報告當(dāng)場交給老師。第十四張，PPT共十六頁，創(chuàng)作于2022年6月七、注意事項1、薄膜的浸潤與選膜是電泳成敗的關(guān)鍵之一。2、點樣時，應(yīng)將薄膜表面多余的緩沖液用濾紙吸去，吸水量以不干不濕為宜。3、點樣時，動作要輕、穩(wěn)，用力不能太大，以免損壞膜片或印出凹陷影響電泳區(qū)帶分離效果。4、點樣應(yīng)點在薄膜的毛面上，點樣量要適量，不宜過多或過少。5、電泳時應(yīng)將薄膜的點樣端置于電泳