基于正交實驗優(yōu)化創(chuàng)傷弧菌金屬蛋白酶融合蛋白的表達

1、基于正交實驗優(yōu)化創(chuàng)傷弧菌金屬蛋白酶交融蛋白的表達【摘要】目的：對創(chuàng)傷弧菌金屬蛋白酶交融蛋白表達條件進展優(yōu)化，從而獲得高效穩(wěn)定的金屬蛋白酶原核表達系統(tǒng)。方法：質粒pET-32a-vvp轉化E.liBL21/DE3后,針對誘導過程中對工程菌表達蛋白產生影響的4個因素誘導時間、誘導溫度、誘導劑濃度以及誘導時搖菌的轉數,運用統(tǒng)計學軟件進展正交實驗設計，對結果進展直觀分析及方差分析，并對實驗得出的最正確搭配誘導條件進展驗證。結果：直觀分析說明搖菌轉數的R值最大，其次為誘導時間和誘導溫度，誘導劑IPTG濃度的R值最??；方差分析說明搖菌轉數的P值小于0.05，而時間因素、溫度及IPTG濃度的P值均大于0.0

2、5。結論：搖菌轉數為主要因素其為250r/時,表達程度最高，其次為誘導時間，而誘導溫度和誘導劑IPTG濃度對實驗結果影響不明顯。本實驗的最正確搭配誘導條件為搖菌轉數250r/、誘導時間4h、誘導溫度37、誘導劑IPTG濃度1l/L。在此誘導條件下，金屬蛋白酶的表達量高達40.67%?！娟P鍵詞】創(chuàng)傷弧菌；金屬蛋白酶；正交設計；直觀分析；方差分析Abstratbjetive:TptiizetheexpressinfrebinantetallprteasefVvibrivulnifiusinE.liBL21/DE3induedbyIPTG.ethd:TheplasidfpET-32a-vvp/E.l

3、iBL21asnstrutedbyurlabratry.Furdifferentfatrs,inludingtie,teperature,agitatinspeedandnentratinfIPTG,erestudiedbyrthgnalexperientaldesign.ThedataereanalyzedbydiretalulatinandANVAethd.Results:TheRvaluefagitatinrateresultingfrdiretalulatinashighestangfurfatrs.ThePvaluefagitatinrateaslerthan0.05.ThePval

4、uefthetherfatrserehigherthan0.05.nlusins:Theexpressinlevelisrearkableaffetedbytheagitatinrate.TheexpressinlevelfVVPprtEinishighesthenagitatinrateis250rp.Therefreehaveestablishedaethdfrhigh-levelexpressinfVVP-furhurs-induingtie,37-induingteperature,1l/LnentratinfIPTGandagitatinratein250rp.Keyrdsvibri

5、vulnifius;etallprtease;rthgnalexperientaldesign;diretanalysis;analysisfvariane(ANVA)很多臨床病例及動物實驗已經證明，進食被創(chuàng)傷弧菌Vibrivulnifius,Vv污染的食物或者皮膚破損接觸Vv均可引起Vv感染，主要表現為嚴重的蜂窩組織炎和敗血癥13。一旦出現敗血癥，其死亡率高達50%以上46。因其病情兇險,故對創(chuàng)傷弧菌感染的臨床早期快速診斷尤為重要。目前,Vv的致病機制尚未明了。但有研究說明該菌分泌的金屬蛋白酶VVP具有增加血管通透性，引起出血性損傷的作用，已被證實是創(chuàng)傷弧菌的主要毒力因素之一79，并且vvp

6、基因在不同創(chuàng)傷弧菌菌株之間具有高度保守性。故金屬蛋白酶可作為創(chuàng)傷弧菌感染重要的臨床實驗室檢測靶標。而要制備以VVP為靶標的Vv免疫檢測試劑盒，首先必須獲得作為足量高純度的VVP抗原來制備抗體。但是金屬蛋白酶作為創(chuàng)傷弧菌種特征性的外毒素，其自然分泌產量并不高,且由于方法學的限制,采用常規(guī)生化方法獲得足量高純度溶細胞素相當困難。而通過基因工程的方法，我們可以在一個適宜的系統(tǒng)中，使外源基因高效表達，從而消費有價值的蛋白質，對其應用或進展功能的研究。但是外源基因在工程菌中的誘導表達受很多因素的影響，例如，誘導時間、誘導溫度、誘導劑濃度及搖菌的轉數等。因此，如何得到一種最正確的誘導條件組合，從而使蛋白高

7、效穩(wěn)定的表達是我們研究的基矗1材料與方法1.1材料1.1.1菌株和質粒原核表達載體pET-32a-vvp由本課題組構建；宿主菌E.liBL21/DE3由南方醫(yī)科大學公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學學院吳昆博士惠贈。1.1.2誘導劑IPTG和挑選用氨芐青霉素購自鼎國生物制品。1.2方法1.2.1實驗設計針對誘導過程中對菌體表達蛋白產生影響的4個因素誘導時間、誘導溫度、誘導劑濃度以及誘導時搖菌的轉數,運用SPSS11.5統(tǒng)計學軟件進展正交實驗設計。因素及程度見表1。表1因素程度表略1.2.2誘導質粒pET-32a-vvp轉化E.liBL21/DE3后,挑取單菌落接種于含氨卞青霉素(100g/L)的LB培養(yǎng)基中,

8、37活化過夜,次日按1:100的比例轉接,37培養(yǎng)至D600約0.8時即根據不同誘導條件進展誘導,誘導條件見實驗設計。離心搜集菌體,做SDS分析,考馬斯亮藍染色、脫色后觀察。掃描后運用圖像分析軟件Quantityne得出各不同誘導條件下交融蛋白VVP的表達濃度。1.2.3正交試驗直觀分析法分別計算每個因素各程度下的平均收率，用各因素各個程度平均收率的極差R(極差=平均收率的最大值-平均收率的最小值)來反映各因素的程度變動時對試驗結果影響的大小10。1.2.4方差分析運用SPSS11.5統(tǒng)計學軟件對正交設計資料進展分析。1.2.5結果驗證在由上述方法得出的最正確誘導條件下，對轉化了質粒pET-3

9、2a-vvp的E.liBL21/DE3進展誘導，并對結果進展SDS分析，以驗證此組合的誘導條件的誘導表達效果。并設置轉化空載體組及未誘導組進展對照。2結果2.1SDS結果取16組經不同誘導條件誘導的菌液作組間平行SDS,經Quantityne對染色凝膠做圖像分析,來確定交融蛋白VVP表達的相比照例。SDS結果見圖1，圖上方的數字代表組別。經掃描得到各組VVP的表達比例見表2。2.2優(yōu)化結果2.2.1正交試驗直觀分析法運用正交試驗直觀分析法得出的條件優(yōu)化結果見表2和圖2，K1、K2、K3、K4分別表示每個因素各程度下的蛋白表達量的均值10。由極值R的大小推知,各因素的重要性依次為誘導搖菌轉數、誘

10、導時間、誘導溫度、誘導劑IPTG濃度。本實驗的最正確搭配誘導條件為搖菌轉數250r/、誘導時間4h、誘導溫度37、誘導劑IPTG濃度1l/L。表2實驗設計與結果分析略2.2.2方差分析運用SPSS11.5統(tǒng)計學軟件對進展正交設計資料進展方差分析得出的條件優(yōu)化結果見表3。搖菌轉數的P值小于0.05,即該因素對試實驗結果影響顯著；而時間、溫度及IPTG濃度的P值均大于0.05。表3方差分析表略2.2.2結果的驗證在誘導條件為搖菌轉數250r/、誘導時間4h、誘導溫度37、誘導劑IPTG濃度1l/L的情況下，VVP的表達量到達了40.67%。而其它4組對照組均無表達，見圖3。3討論正交試驗設計是一種

11、安排多因素多程度試驗,并利用普通的統(tǒng)計分析方法來分析試驗結果的一種試驗設計方法10。對于多因素多程度的問題,通常都希望通過試驗找出因素的主次關系和最優(yōu)搭配條件。用正交設計合理地安排試驗,可以做到省時、省力、省錢,同時又能得到根本滿意的試驗效果10。因此在本研究中，我們運用這種實驗設計方法對交融蛋白VVP在工程菌中的誘導表達條件進展優(yōu)化，旨在獲得穩(wěn)定高效表達的VVP蛋白，從而為VVP的致病機理研究以及Vv免疫檢測試劑盒制備奠定基矗目的基因在大腸桿菌中的誘導培養(yǎng)方式主要有兩種，即化學物質誘導和溫度誘導，pET32a載體帶有啟動子T7la，可采用化學物質IPTG進展化學誘導11。要實現蛋白產物的高表

12、達，需要考慮重組菌生長和產物表達的最適環(huán)境條件，包括誘導時間、誘導溫度、搖菌的轉數及最適誘導劑濃度等。細菌在誘導后，大量能量會消耗在外源蛋白的表達上，使細菌的生長提早進入衰亡期，過度誘導會造成溶菌。因此需要對誘導時間進展控制，找到能使外源蛋白充分表達而又不會導致溶菌的適當誘導時間，我們在實驗中設計了3個連續(xù)的時間程度1h、2h、3h。在誘導溫度上，不同的蛋白對溫度有不同的要求。有研究說明，有些外源蛋白在低溫下才能大量表達12；而本實驗中的工程菌大腸桿菌的最適生長溫度是37?？紤]到這兩方面的要求，我們在實驗中設計了3個溫度程度：20、30、37。搖菌的轉數對細菌的生長也是極為重要的。體系溶解氧是

13、影響菌體代謝的重要參數,外源基因在高效轉錄和翻譯時需要大量能量,及時給予飽和需氧量對高效表達有意義13。參加誘導劑后通過改變攪拌轉數(r/in)來改變氧傳遞推動力和液相體積氧傳遞系數,以到達調節(jié)體系溶解氧的目的。通常攪拌轉數愈大液相體積氧傳遞系數愈大,但當r/in很大時,體系產生不可防止的泡沫而阻止了氧的傳遞;同時r/in過大那么產生較大的剪切力,亦對菌體生長不利11。我們在實驗中設計了3個r/in程度：100、180、250。誘導劑IPTG的濃度對外源蛋白的表達程度有較大影響，濃度過高會對宿主菌造成損害，過低那么影響誘導劑的效用。因此實驗中設計了4個濃度程度:0.1/L、0.5/L、1/L、

14、2/L。本實驗設計的因素程度不等，因此在對正交設計資料進展直觀分析時，我們運用平均蛋白表達量K1、K2、K3值的大小來反映各因素的不同程度對實驗結果(蛋白表達量)影響的大小,并以此確定實驗的最正確搭配。用各因素各個程度蛋白平均表達量的極差R來反映各因素的程度變動時對實驗結果影響的大校極差大的就表示該因素的程度變動時對實驗結果的影響大,極差小的就表示該因素的程度變動時對實驗結果的影響校本實驗中，我們得到因素的主次順序為誘導搖菌轉數、誘導時間、誘導溫度、誘導劑IPTG濃度。主要因素應取較好的程度，而次要因素,那么可根據對本錢、時間、收益等方面的統(tǒng)籌考慮而選取適當的程度。正交試驗的直觀分析法簡便、直

15、觀、計算量小,但不能估計試驗誤差，即不能區(qū)分是由于各因素的程度變化而導致試驗結果的差異,還是由于試驗的隨機波動而導致試驗結果的差異。為解決此問題,可對試驗結果做方差分析。由表3可知，搖菌轉數的P值小于0.05，而時間、溫度及IPTG濃度的P值均大于0.05。按方差分析法的觀點，只須對有顯著意義的因素確定好程度,而其它對試驗結果沒有什么影響的因素,那么可按實際需要來確定適當的程度。方差分析的結果與直觀分析方法得到的結果一樣。并且這一結果也通過VVP的高表達(表達濃度到達了40.67)得到了驗證。由此得本研究的試驗最正確組合為搖菌轉數250rp、誘導時間4h、誘導溫度37、誘導劑IPTG濃度1l/

16、L?！緟⒖嘉墨I】1LeeT,Aar,SanjuanE,etal.IdentifiatinfDNAsequenesspeififrVibrivulnifiusbitype2strainsbysuppressinsubtrativehybridizatin.ApplEnvirnirbil,2022，71(9):55935597.2BisharatN,AgnV,FinkelstEinR,etal.linial,epideilgial,andirbilgialfeaturesfVibrivulnifiusbigrups3ausingutbreaksfundinfetinandbateraeiainIs

17、rael.IsraelVibriStudyGrup.Lanet,1999，354(9188):14211424.3鄭晶，申洪，陳清.海水環(huán)境創(chuàng)傷弧菌感染的病理學研究.中華創(chuàng)傷雜志，2022，23(11):874878.4hatzidaki-Livanis,JnesK,rightA.GenetivariatinintheVibrivulnifiusgrup1apsularplysaharidepern.JBateril，2022ar;188(5):19871998.5apbellS,rightA.Real-TiePRAnalysisfVibrivulnifiusfrysters.ApplEnvi

18、rnirbil，2022，69(12):71377144.6鄭晶,申洪,陳清.創(chuàng)傷弧菌經食管感染小鼠的致病性.世界華人消化雜志，2022，13(7):860863.7liverJD,earJE,ThiasB,etal.PrdutinfextraellularenzyesandyttxiitybyVibriVulnifius.DiagnirbilInfetDis,1986,5(2):99111.8iyshiS.EffetsfVibriVulnifiusetallprteasentheapillaries:pathlgialatinsandinativatinbyalpha-arglbulin.YakugakuZasshi,2000，120(11):11491157.9iyshiS,NarukaaH,ThikaK,etal.AtinsfVibrivulnifiusetallprteasenhuanplasaprteinase-prteinaseinhibitrsystes:aparativ