生物化學A（上）-6酶

1、蛋白質(zhì)-酶2014年3月24日1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能2肌紅蛋白(Myoglobin) 肌紅蛋白是一個只有三級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，有8段 螺旋結(jié)構(gòu)，分別成為A B C D E F G H肽段。整條多肽鏈折疊成緊密球狀分子，氨基酸殘基上的疏水側(cè)鏈大都在分子內(nèi)部，富極性及電荷的則在分子表面，因此水溶性較好。Mb分子內(nèi)部有個袋形空穴，血紅素居于其中。His E7 and F8 are the only polar groups inside3His F8 (His93)Heme中Fe與O2配位結(jié)合4蛋白-配體的可逆相互作用P + L PLAssociation constant: Ka = PL/PLDisso

2、ciation constant: Kd = 1/Ka蛋白上配體結(jié)合的比率： = PL/(PL+P) = L/(L+Kd)當 =0.5時，L=KdMyoglobin上氧氣的結(jié)合比率： =pO2/(pO2+P50),P50:O20.5 時的氧分壓肌紅蛋白的P50=0.13KPa(1mmHg) 當在體內(nèi)毛細血管中氧分壓大于30mmHg，組織中Mb幾乎全與O2結(jié)合而達到飽和肌紅蛋白是很好的儲氧物質(zhì)。5血紅蛋白(Hemoglobin) 血紅蛋白具有四個亞基組成的四級結(jié)構(gòu)，每個亞基中間有一個疏水局部，可攜帶一個血紅素并攜帶一分子氧，因此1分子Hb共結(jié)合四分子氧。Hb各亞基的三級結(jié)構(gòu)與Mb極為相似。Hb亞

3、基之間通過八對鹽鍵，使四個亞基緊密結(jié)合而形成親水的球狀蛋白。6肌紅蛋白(Mb)和血紅蛋白(Hb)的氧解離曲線7 協(xié)同效應(cooperativity) 定義：一個寡聚體蛋白質(zhì)的一個亞基與其配體結(jié)合后，能影響此寡聚體中另一個亞基與配體結(jié)合能力的現(xiàn)象，稱為協(xié)同效應。 如果是促進作用則稱為正協(xié)同效應 (positive cooperativity)如果是抑制作用則稱為負協(xié)同效應 (negative cooperativity)8 定義：別構(gòu)效應亦稱變構(gòu)效應，是指一個蛋白質(zhì)與它的配體結(jié)合后，蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生變化,使它更適合于功能的需要，這一類變化稱為別構(gòu)效應。 別構(gòu)蛋白（allosteric prot

4、ein）：是指具有別構(gòu)效應的蛋白質(zhì)或酶.如血紅蛋白 別構(gòu)劑： 亦稱效應劑,是指凡能觸發(fā)蛋白質(zhì)分子發(fā)生別構(gòu)效應的物質(zhì)。如O2 變構(gòu)效應（allosterism effect）9 T態(tài)轉(zhuǎn)變成R態(tài)是逐漸結(jié)合氧氣完成的，在脫氧Hb中，F(xiàn)e2+半徑比卟啉環(huán)中間的孔大，因此高出卟啉環(huán)平面0.075nm,而靠近F8位組氨酸殘基。當?shù)谝粋€O2與血紅素結(jié)合后，使Fe2+的半徑變小，進入到卟啉環(huán)中間的小孔中，引起F肽段等一系列微小的移動，同時影響附近肽段的構(gòu)象，造成兩個亞基間鹽鍵斷裂，使亞基間結(jié)合松弛，可促進第二個亞基與O2結(jié)合，依此方式可影響第三、四個亞基與O2結(jié)合最后四個亞基全處于R態(tài)。10HbO2Hb +

5、nO2=(pO2)n(pO2)n + P50lg1-= n lg pO2 lg P50The Hill equationThe hill coefficient n is a measure of the degree of cooperativity.11當nH=1，配體結(jié)合沒有協(xié)同性；當nH1，配體結(jié)合正協(xié)同；當nHpI，帶負電荷；pH k2時，此時酶和底物的分離遠比產(chǎn)生酶和產(chǎn)物的速度快得多；KM KES = k-1/k1=ES/ES即當k-1 k2時，KM 等于ES復合物的解離常數(shù);在這個條件下：KM高，結(jié)合弱；KM低，結(jié)合強。 KM是酶的特征性常數(shù)之一=Kmk1k2k-1+121米氏常

6、數(shù)KM的意義（續(xù)）Km值越小, 底物與酶的親和力越強, 反應越迅速122123定義：Vmax是酶完全被底物飽和時的反應速度，與酶濃度成正比。意義：Vmax=k2 E0如果酶的總濃度已知，可從Vmax計算酶的轉(zhuǎn)換數(shù)(turnover number)，即動力學常數(shù)k2。Vmax的意義124kcat 和 specificity constantkcat :當酶被底物充分飽和時，單位時間內(nèi)每個酶分子催化底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的分子數(shù)。也叫 turnover number轉(zhuǎn)換數(shù)kcat /Km :專一性常數(shù), 用來比較不同酶作用于同一底物, 或同一種作用于不同底物的催化效率;數(shù)值接近109為佳。125酶的轉(zhuǎn)換數(shù)

7、Turnover number (kcat)意義：可用來比較每單位酶的催化能力。The Kcat is a direct measure of the conversion of substrate to product under optimum conditions, i.e. saturated enzyme.The number of substrate molecules turned over per enzyme molecule per second, hence “turnover number”.The overall rate of a reaction is limit

8、ed by its slowest step. Hence, the Kcat will be equal to the rate constant for the slowest step.In the case of the Michaelis-Menten system this will be k2 E + S ESE + Pk1k-1k2126127specificity constant: kcat/KMThe ratio kcat/KM is a convenient measure of enzyme efficiencyA good enzyme has a high kca

9、t/KM ratioThis could result from:Large kcatSmall KM128同一個酶對不同的底物可以有不同的米氏常數(shù)胰凝乳蛋白酶129同一個酶對不同的底物可以有不同的米氏常數(shù)胰凝乳蛋白酶130米氏方程作圖131Taking the reciprocal of both sides can giveThis is in the general form y = m x + ci.e. a plot of 1/v against 1/S will give straight lineThis is a Lineweaver-Burk plot132Lineweave

10、r-Burk plot(雙倒數(shù)作圖) 1/v = Km/Vmax *1/S + 1/Vmax 1/V1/S-1/KM1/VmaxKM/Vmaxslope =Lineweaver-Burk plot133Eadie-Hofstee plotHanes plot請從米氏方程推導134Cornish-Bowden plotDixon plot135雙底物的米氏方程136三聚物模式(ternary complex)乒乓式(ping-pong)兩種不同模式的雙底物反應137雙底物反應的米氏方程當P1, P2 = 0 時太復雜了！ Forget it!138二、酶濃度對反應速度的影響當SE，反應速度與酶濃

11、度成正比。關(guān)系式為：V = K2 E0 V E 139雙重影響最適溫度 (optimum temperature)：酶促反應速度最快時的環(huán)境溫度。低溫的應用三、溫度對反應速度的影響酶活性0.51.02.01.50 10 20 30 40 50 60 溫度 C 140四、 pH對反應速度的影響 最適pH(optimum pH)：酶催化活性最大時的環(huán)境pH。0酶活性 pH胃蛋白酶 淀粉酶 膽堿酯酶 246810141五、抑制劑對反應速度的影響酶的抑制劑(inhibitor)凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白變性的物質(zhì)統(tǒng)稱為酶的抑制劑。區(qū)別于酶的變性抑制劑對酶有一定選擇性，而變性的因素對酶沒有選擇

12、性142抑制作用的類型不可逆性抑制 (irreversible inhibition)可逆性抑制 (reversible inhibition)：競爭性抑制 (competitive inhibition)非競爭性抑制 (non-competitive inhibition)反競爭性抑制 (uncompetitive inhibition)143不可逆性抑制作用* 概念抑制劑通常以共價鍵與酶活性中心的必需基團相結(jié)合，使酶失活，不能用透析、超濾等方法予以除去。 * 舉例有機磷化合物 羥基酶解毒 - - - 解磷定(PAM)重金屬離子及砷化合物 巰基酶解毒 - - - 二巰基丙醇(BAL) 144

13、有機磷化合物對羥基酶的抑制+E-OHROPOXROROPOO-ERO+ HXE-OHORPOORNCH3CHNOH+NCH3CHNO+有機磷化合物磷酰化酶羥基酶酸解磷定145重金屬離子及砷化合物毒性路易士氣失活的酶巰基酶失活的酶酸BAL二巰基丙醇巰基酶BAL與砷劑結(jié)合物146可逆性抑制作用概念：抑制劑以非共價鍵與酶或酶-底物復合物可逆性結(jié)合，使酶的活性降低或喪失；抑制劑可用透析、超濾等方法除去。類型：競爭性抑制非競爭性抑制反競爭性抑制 1471. 競爭性抑制作用抑制劑與底物的結(jié)構(gòu)相似，能與底物競爭酶的活性中心，從而阻礙酶底物復合物的形成，使酶的活性降低。148競爭性抑制149I與S結(jié)構(gòu)類似，競

14、爭酶的活性中心；抑制程度取決于抑制劑與酶的相對親和力及S；動力學特點：Vmax不變，表觀Km。競爭性抑制的特點抑制劑 無抑制劑 1/v 1/S 150琥珀酸琥珀酸脫氫酶FADFADH2延胡索酸舉例1：丙二酸對琥珀酸脫氫酶的抑制151舉例2：磺胺藥對細菌二氫葉酸合成酶的抑制Glu +H2NCOOH +FH2FH4H2NSO2NHRPABAFH2合成酶二氫蝶呤氨甲蝶呤磺胺藥FH2還原酶1522. 非競爭性抑制抑制劑與酶活性中心外的必需基團結(jié)合，底物與抑制劑之間無競爭關(guān)系。153非競爭性抑制154非競爭性抑制的特點抑制劑與酶活性中心外的必需基團結(jié)合；抑制程度取決于I；動力學特點：Vmax，表觀Km不

15、變。抑制劑 1/v 1/S 無抑制劑 1553. 反競爭性抑制抑制劑僅與酶和底物形成的中間產(chǎn)物結(jié)合，使ES的量下降。156反競爭性抑制157抑制劑只與ES結(jié)合；抑制程度取決與I及S；動力學特點：Vmax，表觀Km。反競爭性抑制的特點抑制劑 1/V 1/S 無抑制劑 158各種可逆性抑制作用的比較 作用特征競爭性抑制非競爭性抑制反競爭性抑制與I結(jié)合的組分EE、ESES表觀Km增大不變減小Vmax不變降低降低159不同類型抑制作用的米氏方程160I競爭性抑制反競爭性抑制非競爭性抑制161六、激活劑對反應速度的影響激活劑(activator)使酶由無活性變?yōu)橛谢钚曰蚴姑富钚栽黾拥奈镔|(zhì)。 必需激活劑

16、(essential activator) 非必需激活劑 (non-essential activator)162七、酶活性測定和酶活性單位酶的活性單位：在規(guī)定條件下，酶促反應在單位時間（s、min或h）內(nèi)生成一定量（mg、g、mol等）的產(chǎn)物或消耗一定數(shù)量的底物所需的酶量。163酶活性單位國際單位(IU)在特定的條件下，每分鐘催化1 mol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量為一個國際單位催量單位(katal)催量(kat)是指在特定條件下，每秒鐘使mol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量kat與IU的換算： 1 IU=16.6710-9 kat164酶的分離純化165Can be used to compare

17、 different methodologies for purification of the same proteinCan be used to standardize the purification of proteins in different laboratoriesProtein Purification Schemes166比活（specific activity）：酶單位數(shù)/mg 蛋白質(zhì)酶的分離純化過程中一定要隨時追蹤酶的活性167Total protein. The quantity of protein present in a fraction is obtaine

18、d by determining the protein concentration of a part of each fraction and multiplying by the fractions total volume. Total activity. The enzyme activity for the fraction is obtained by measuring the enzyme activity in the volume of fraction used in the assay and multiplying by the fractions total volume. Specific activity. This parameter is obtained by dividing total activity by total protein. Yield. This parameter is a measure of the activity retained after each purification step as a percentage of the activity in the crud