芍藥甙對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用

1、芍藥甙對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用【關(guān)鍵詞】芍藥甙；缺氧；海馬神經(jīng)元；抗氧化劑Neurprtetiveeffetfpaeniflrinnanxiallyulturedrathippapalneurns【Abstrat】AI:Tinvestigatehetherpaeniflrinhastheneurprtetiveeffetnanxiallyulturedrathippapalneurns.ETHDS:Hippapalneurnseretakenandgrnfr1014d,thendividedrandlyint4grupsardingtdifferentultureediusaddedith5

2、l/Lnidipine,40r80l/Lpaeniflrin,rnanyediine(asntrlgrup).Auteanxiadelasinduedith950L/LN2+50L/L2ixturegases.Theviableellsereuntedbytrypanblueethd.Theapptsisrateanddeathratefhippapalneurnsastestedbyflytetry(F).ThententsfDAandNandtheativitiesfSDinthesupernatantsfellultureeredeterinedbybiheialethds.RESULT

3、S:Inparisniththentrlgrup,paeniflrinsignifiantlyinreasedtheativitiesfSDanddereasedthententsfDAandNintheulturesupernatants(P0.01)anddereasedtheapptsisratefhippapalneurns,hihshedadseeffetrelatinship.NLUSIN:Thepaeniflrinhastheneurprtetiveeffetnhippapalneurnsagainstanxiinjury.Theehanisunderlyingthiseffet

4、fpaeniflrinaybeediatedbyeliinatingthefreeradials,byinreasingtheativitiesfantixidativeenzyestinhibitthexidativedaagesausedbyanxia.【Keyrds】paeniflrin;anxia;hippapalneurns;antixidants【摘要】目的：觀察缺氧對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元的影響及芍藥甙的保護(hù)作用.方法：采用細(xì)胞培養(yǎng)方法獲取1014d的海馬神經(jīng)元,將藥物參加到培養(yǎng)液中，4h后建立950L/LN2+50L/L2混合氣體急性缺氧模型,臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞計(jì)數(shù)并做流式細(xì)胞儀檢測(cè),以及

5、酶法測(cè)定抗氧化酶超氧化物岐化酶SD的抗氧化才能及丙二醛DA，N的含量.結(jié)果：離體條件下芍藥甙組較對(duì)照組SD活性升高,DA及N含量降低P0.01，且成量效比例關(guān)系,同時(shí)細(xì)胞凋亡率顯著降低.結(jié)論：芍藥甙在體外有抗缺氧損傷的作用,其作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡,進(jìn)步抗氧化酶的活力,去除自由基而發(fā)揮作用.【關(guān)鍵詞】芍藥甙；缺氧；海馬神經(jīng)元；抗氧化劑0引言腦缺血時(shí)機(jī)體產(chǎn)生大量的氧自由基,且N在體內(nèi)部分濃度升高,與周圍的氧自由基等反響而生成活性氮氧化合物,是一種強(qiáng)氧化劑,也可啟動(dòng)脂質(zhì)過(guò)氧化.自由基醫(yī)學(xué)的研究說(shuō)明,神經(jīng)元的損傷、凋亡、壞死等與脂質(zhì)過(guò)氧化親密相關(guān),而抗氧化劑可通過(guò)去除自由基,進(jìn)步抗氧化酶等途

6、徑有效地阻斷或防止這一過(guò)程1.芍藥甙是芍藥的主要成分之一,可以抑制花生四烯酸的代謝,具有抗血栓的作用,以及抗氧化和抗驚厥作用2.但對(duì)其在神經(jīng)細(xì)胞中的作用及機(jī)制研究甚少.本試驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元,建立急性氣體缺氧模型,用臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞計(jì)數(shù),流式細(xì)胞儀檢測(cè)以及酶法測(cè)定抗氧化酶超氧化物岐化酶的抗氧化才能及丙二醛(AD),一氧化氮(N)的含量,討論芍藥甙是否有抗缺氧損傷的作用,以尋求預(yù)防和治療腦缺血的藥物.1材料和方法1.1材料新生13dister大鼠,雄性,32只,第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供.芍藥甙(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物所);尼莫地平(德國(guó)拜耳公司);DE,馬血清(Gib公司);胎牛血清(杭州四

7、季青生物材料工程公司);超氧化物歧化酶(SD),AD,N(南京建成生物工程研究所);多聚賴氨酸(Siga公司).2細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備),垂直單向流型YJ超凈工作臺(tái)蘇州市干凈技術(shù)研究所.1.2方法1.2.1海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)和分組按已有的細(xì)胞培養(yǎng)方法3,取大鼠消毒,斷頭,別離出雙側(cè)海馬,剪碎成13的組織塊,參加1.25g/L胰酶消化30in,用含有100L/L胎牛血清及100L/L馬血清的種植培養(yǎng)液終止胰酶的作用.制成細(xì)胞懸液1109/L接種到6孔板中(2L/孔),置于3750L/L2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,更換維持培養(yǎng)液50L/L胎牛血清,100L/L馬血清,以后每3d半量換液1次,第45

8、日參加阿糖胞苷,終濃度為5g/L(25L/皿).接種1014d的海馬神經(jīng)元隨機(jī)分為4組,即對(duì)照組,尼莫地平5L/L組,芍藥甙40L/L組,芍藥甙80L/L組.每組4個(gè)6孔板：將所用藥物參加到細(xì)胞培養(yǎng)液中進(jìn)展孵育.1.2.2尼氏染色鑒定神經(jīng)元將培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元經(jīng)0.02l/LPBS(pH7.4)漂洗12次,40g/L多聚甲醛溶液固定1h,PBS漂洗后,10g/L甲苯胺藍(lán)染液染色20in,950L/L乙醇分色,37枯燥,二甲苯透明,中性樹(shù)脂封片.1.2.3缺氧模型的制備44h后將已分組給藥的培養(yǎng)板移入37恒溫密閉容器中,連續(xù)充以950L/LN2+50L/L2混合氣體,流速為20L/in,持續(xù)1h.

9、1.2.4海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)將上述處理過(guò)的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,1000r/in離心10in,去上清,PBS沖洗,700L/L乙醇固定,400目的篩網(wǎng)過(guò)濾,加PI染液,上流式細(xì)胞儀檢測(cè).1.2.5海馬神經(jīng)元上清液中SD,DA和N的測(cè)定按試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求先求出樣本的最正確加樣量,海馬神經(jīng)元經(jīng)上述同樣處理后,取細(xì)胞上清液,按試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求操作,測(cè)定各樣本的吸光度,并依以下公式計(jì)算出SD,DA和N的含量.SD活力(U/L)=(對(duì)照管吸光度-測(cè)定管吸光度)/對(duì)照管吸光度/50%反映體系的稀釋倍數(shù)樣本測(cè)試前的稀釋倍數(shù)DA含量(l/L)=(測(cè)定管吸光度-測(cè)定空白管吸光度)/(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-標(biāo)準(zhǔn)

10、空白管吸光度)標(biāo)準(zhǔn)品濃度(10l/L)樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)N含量(l/L)=(測(cè)定管吸光度-空白管吸光度)/(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-空白管吸光度)標(biāo)準(zhǔn)品濃度(100l/L)樣品測(cè)試前稀釋倍數(shù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用xs表示,用簡(jiǎn)明統(tǒng)計(jì)(s2000)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果先進(jìn)展正態(tài)分布,方差齊性檢驗(yàn),假設(shè)方差不齊,那么進(jìn)展F檢驗(yàn);假設(shè)方差齊,那么進(jìn)展F檢驗(yàn).2結(jié)果2.1海馬神經(jīng)元的存活率別離出的海馬細(xì)胞在接種之前,制備1109/L細(xì)胞懸液,用2L/L的臺(tái)盼藍(lán)染色,計(jì)數(shù)著色細(xì)胞和未著色細(xì)胞數(shù),活細(xì)胞數(shù)為97%.光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)海馬神經(jīng)元胞質(zhì)淡藍(lán)色,尼氏體及核仁明顯呈深藍(lán)色.2.2海馬神經(jīng)元SD活性及DA,N的含量對(duì)照

11、組SD含量最低(P0.01),DA及N含量那么明顯最高(P0.01);尼莫地平及芍藥甙低、高劑量組SD活性依次升高,DA及N的含量那么依次降低(表1).表1各組海馬細(xì)胞抗氧化酶活性及DA,N的含量(略)aP0.05vs對(duì)照,bP0.01vs尼莫地平.DA:丙二醛.2.3海馬神經(jīng)元凋亡率流式細(xì)胞儀測(cè)定PI熒光強(qiáng)度,分析各組細(xì)胞的凋亡率,對(duì)照組細(xì)胞凋亡率明顯高于其他各組.對(duì)照組海馬細(xì)胞凋亡率為3.07%,尼莫地平組為0.49%,40l/L和80l/L芍藥甙組分別為0.44%,0.28%.3討論腦缺血或腦缺氧的研究中,人們發(fā)現(xiàn)海馬是腦內(nèi)對(duì)缺血、缺氧最為敏感的部位之一.我們采用新生大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)

12、模型,該模型可直接研究藥物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞缺氧損傷的機(jī)制.通過(guò)參加阿糖胞苷,可有效地抑制膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng),保證神經(jīng)元的純度5.本試驗(yàn)別離的細(xì)胞經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色檢查,成活率達(dá)95%以上.尼氏體(Nisslbdies)常被稱為嗜色小體或虎斑,主要成分由RNA和蛋白質(zhì)組成.由于含有RNA,易被某些堿性苯胺染料所染色,如甲苯胺藍(lán).由此用來(lái)證明所培養(yǎng)的細(xì)胞中神經(jīng)元占90%以上,可以認(rèn)為是相對(duì)純的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)6.腦缺血是臨床上常見(jiàn)的一種疾病,細(xì)胞凋亡無(wú)論是在短暫性腦缺血,還是在永久性腦缺血中均是神經(jīng)細(xì)胞死亡的主要形式7-8.本實(shí)驗(yàn)采用PI單染法,通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn),對(duì)照組細(xì)胞凋亡率較其余3組升高.說(shuō)明缺氧可以引起

13、細(xì)胞凋亡,而芍藥甙可以抑制這種缺氧所引起的凋亡.正常情況下體內(nèi)產(chǎn)生少量自由基屬生理范圍,可被抗氧化防御系統(tǒng)去除,使自由基的產(chǎn)生及去除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài).當(dāng)急性缺氧時(shí),此平衡狀態(tài)被打破,自由基積蓄從而造成腦損傷.其中DA含量的上下就可以反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度和細(xì)胞損傷的程度.試驗(yàn)中,對(duì)照組的含量最高,給藥組那么依次降低P0.01,說(shuō)明缺氧損傷了細(xì)胞,這與文獻(xiàn)9報(bào)道一致,而芍藥甙有抗缺氧損傷的作用.機(jī)體的防御系統(tǒng)中主要有SD,其活力上下間接反映了機(jī)體去除氧自由基的才能,常與DA相配對(duì)作為檢測(cè)機(jī)體氧化程度的指標(biāo).試驗(yàn)中,對(duì)照組中SD明顯降低,其余3組那么依次升高P0.01,說(shuō)明缺氧抑制了SD的活性

14、.這與DA的結(jié)果相一致,說(shuō)明芍藥甙可通過(guò)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化發(fā)揮抗缺氧損傷的作用.N在腦缺血損害中所起的作用,一直是研究的重點(diǎn).近來(lái)研究發(fā)現(xiàn),在腦缺血損傷過(guò)程中神經(jīng)細(xì)胞中的N合酶NS過(guò)度表達(dá),可催化產(chǎn)生N,有超氧陰離子自由基(2-)存在時(shí),迅速與其反響生成氧化毒性更強(qiáng)的過(guò)氧亞硝基(N2-)引起脂質(zhì)過(guò)氧化反響,在損傷早期起關(guān)鍵作用10.本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明,芍藥甙組的N含量明顯低于其他各組P0.01,這說(shuō)明缺氧損傷細(xì)胞造成N升高,而芍藥甙可明顯抑制其含量從而來(lái)保護(hù)細(xì)胞免受缺氧損傷.【參考文獻(xiàn)】1王平,顧振綸,周文軒,等.心腦通膠囊對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦缺血的保護(hù)作用J.中成藥,2000,22(9):636.2RyuG,Pa

15、rkEK,JJH,etal.Aneantixidantnterpeneglyside,alphabenzylxypaeniflrinfrPaeniasuffrutisaJ.ArhPharRes,2001,24(2):105-108.3談冶雄,李萬(wàn)亥,陶學(xué)斌.一種缺氧條件下的神經(jīng)元培養(yǎng)方法J.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),1997,18(2):181-183.4gaaN.FreeradialsandneuralelldaageJ.RinshShinkEigaku,1994,34(12):1266-1268.5申軍現(xiàn)，金衛(wèi)林，鞠躬.低密度體外培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)觀察J.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2022,24(

16、6):489-491.6angFZ,DingAS,LiuZ.Effetfginsensides,againstanxidaagefhippapalneurnsinultureJ.AtaPharalSinia,1995,16(5):419-422.7urakaiK,NivzheH,angT,etal.AdvanesinapptsisresearhJ.BrainRes,1997,751:160-165.8NitatriT,SatN,aguriS,etal.DelayedneurnaldeathintheA1pyraidalelllayerfthegerbilhippapusfllingtransientisheiaisapptsisJ.JNeurs