分子生物學(xué)檢驗(yàn)：基因組結(jié)構(gòu)與特征-病毒基因組

1、第三節(jié) 基因組結(jié)構(gòu)與特征（二） 病毒基因組病毒的結(jié)構(gòu)與成份病毒粒子四種基本結(jié)構(gòu)成份：由一種核酸(DNA或RNA)組成的病毒基因組。由病毒基因組編碼的衣殼蛋白組成的衣殼。來(lái)源于宿主細(xì)胞質(zhì)膜系統(tǒng)（細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜或高爾基體膜）的包膜。病毒顆粒中的其它內(nèi)容物，包括酶、核酸結(jié)合蛋白及金屬離子等。病毒基因組的一般特征病毒基因組的大小及堿基組成病毒基因組大小變化很大，變化范圍在1.5103 6106 bp之間，可編碼5數(shù)百個(gè)基因。 乙型肝炎病毒基因組僅有3.2 kb，僅編碼6個(gè)蛋白質(zhì)。存在重疊基因及由前體mRNA逐漸剪接成多個(gè)編碼片段的現(xiàn)象。病毒基因組有4種核酸類型：雙鏈DNA單鏈DNA雙鏈RNA單鏈RN

2、A只含一個(gè)核酸分子，或含數(shù)個(gè)核酸分子（分段基因組）線狀分子或環(huán)狀分子 根據(jù)國(guó)際病毒分類委員會(huì)（The International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV）分類： 第一組：雙鏈DNA病毒（dsDNA Viruses）第二組：?jiǎn)捂淒NA病毒（ssDNA Viruses）第三組：雙鏈RNA病毒（dsRNA Viruses） 第四組：正鏈RNA病毒（ (+)ssRNA Viruses） 第五組：負(fù)鏈RNA病毒（ (-)ssRNA Viruses）第六組：RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒（RNA Reverse Transcribing Viruses）第七組：DN

3、A逆轉(zhuǎn)錄病毒（DNA Reverse Transcribing Viruses）、亞病毒因子（Subviral Agents）、衛(wèi)星（Satellites） 、類病毒 （Viroids）等病毒基因組的組成和分類根據(jù)基因組復(fù)制和表達(dá)機(jī)制不同而劃分的病毒類型描述病毒基因組：核酸的性質(zhì)（DNA或RNA）核酸鏈的數(shù)量及大小鏈末端的結(jié)構(gòu)核苷酸序列編碼能力（即能編碼的蛋白質(zhì)數(shù)）調(diào)控元件（操縱元件、啟動(dòng)子和終止子）病毒基因組的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)（一）帽子和poly（A）尾結(jié)構(gòu) 大多數(shù)真核生物病毒的正鏈RNA、雙鏈RNA病毒的正鏈RNA，其病毒mRNA都具有5端有帽子、3端有poly(A)尾的結(jié)構(gòu)。 有些病毒的mRNA

4、沒(méi)有5端帽子結(jié)構(gòu)，但能利用5端非編碼區(qū)的RNA形成的空間結(jié)構(gòu)作為增強(qiáng)子，參與蛋白翻譯。 5端帽子與3端poly(A)尾對(duì)RNA有保護(hù)作用，參與蛋白翻譯且與病毒的感染性有關(guān)。 （二）末端重復(fù)序列結(jié)構(gòu) 1.粘性末端病毒基因組雙鏈DNA分子兩端具有能夠互補(bǔ)的單鏈DNA部分，帶粘性末端的病毒雙鏈DNA基因組形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)或二聚體。2.末端正向重復(fù)序列又稱末端冗余（terminal redundancy），指雙鏈DNA兩端所存在的相同核苷酸序列，經(jīng)過(guò)外切酶處理，就能形成多聯(lián)體分子，進(jìn)一步切割退火處理，能產(chǎn)生雙連環(huán)狀DNA分子。 轉(zhuǎn)座子的兩端的宿主序列由于IS的3.末端反向重復(fù)序列（inverted ter

5、minal repeat，ITR） 4. 長(zhǎng)末端重復(fù)序列（long terminal repeat，LTR） 見(jiàn)于逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組RNA在逆轉(zhuǎn)錄后生成的雙鏈DNA中，5端的LTR包含特定的基因表達(dá)調(diào)控區(qū)域，3端的LTR具有轉(zhuǎn)錄終止的作用。LTR中既含有重復(fù)序列也含有單一序列。ITR指病毒基因組兩端的反向互補(bǔ)重復(fù)序列，可能與病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及整合有關(guān)。 （三）高效基因組1.重疊基因（overlapping gene） 一段DNA序列有兩個(gè)或兩個(gè)以上的開(kāi)放閱讀框（Open Reading Frame，ORF) ，可以編碼兩種或兩種以上的多肽鏈。 2.少間隔區(qū) （四）分段基因組（segmented

6、genome） 分段基因組多見(jiàn)于正鏈RNA病毒、負(fù)鏈RNA病毒及雙鏈RNA病毒。 分段基因組的病毒一般感染效率較低，只有全部基因組核酸片段存在時(shí)，病毒才具有感染能力。 分段基因組易發(fā)生重配，病毒容易變異。病毒之間核酸片段交換，基因組各片段在子代病毒中隨機(jī)分配，稱基因重配。噬菌體X174的重疊基因DNA病毒基因組DNA病毒基因組又分為單鏈DNA和雙鏈DNA兩種，以線狀或環(huán)狀分子存在。該病毒本身不攜帶以DNA為模板的RNA聚合酶，其轉(zhuǎn)錄依賴于核轉(zhuǎn)錄酶。 雙鏈DNA病毒基因組 絕大多數(shù)動(dòng)物DNA病毒基因組為雙鏈DNA 1雙鏈線狀DNA病毒 如：皰疹病毒科、腺病毒科和痘病毒科等。2雙鏈環(huán)狀DNA病毒

7、如：乳頭瘤病毒科等嗜肝DNA病毒科（如：HBV）的DNA聚合酶具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，因而ICTV把其歸為逆轉(zhuǎn)錄病毒。 HBV的基因組的特點(diǎn) 乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）屬嗜肝DNA病毒科 HBV基因組是已知可感染人類,又能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的雙鏈DNA病毒中最小和最高效的, 長(zhǎng)約3.2kb。 （一）HBV基因組的不完全雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)2/3為雙螺旋結(jié)構(gòu)，1/3為單鏈，長(zhǎng)鏈為負(fù)鏈，短鏈為正鏈。短鏈的長(zhǎng)度長(zhǎng)約1.62.8kb,約為長(zhǎng)鏈的2/3。 重疊的基因序列比較多已確定的ORF有4個(gè),分別編碼病毒的核殼（C）和包膜（S）蛋白，病毒復(fù)制酶（聚合酶)及一種與病毒基因表達(dá)有關(guān)的蛋白質(zhì)X

8、。Pre-C區(qū)編碼一個(gè)信號(hào)肽，在組裝和分泌病毒顆粒以及在HBeAg的分泌中起重要作用。兩個(gè)功能未確定的ORF,即ORF-5和ORF-6，與X基因重疊。ORF6是由正鏈DNA編碼。（二）HBV基因組編碼基因Pre-S1、Pre-S2、 S 3種表面抗原蛋白基因 C核心抗原蛋白基因 P逆轉(zhuǎn)錄酶基因(DNA多聚酶） X激活蛋白基因調(diào)節(jié)序列位于基因內(nèi)部，這是HBV節(jié)約使用遺傳物質(zhì)的一種方式。與HBV基團(tuán)組復(fù)制有關(guān)的序列：DR1和DR2和U5序列。DR1和U5位于Pre-的ORF中，是合成DNA長(zhǎng)鏈的起始部位，DR2位于聚合酶基因與X基因重疊處，是DNA短鏈合成的起始部位。 （三）HBV基因組中的調(diào)控序

9、列HBV屬于逆轉(zhuǎn)錄DNA病毒，由于逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏校正功能，使病毒基因組的復(fù)制容易發(fā)生突變。pre-C區(qū)1896位核苷酸GA，使密碼子TGG（編碼色氨酸）變?yōu)榻K止密碼子，導(dǎo)致HBeAg的表達(dá)提前終止，此時(shí)HBeAg陰性并不代表HBV的清除或復(fù)制水平降低。Pre-C區(qū)1862位核苷酸GT，使該位點(diǎn)的纈氨酸變?yōu)楸奖彼?，?dǎo)致HBeAg前體過(guò)量堆積在肝細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致重癥肝炎。 Pre-S/S區(qū)的突變往往引起HBsAg的抗原性發(fā)生改變，導(dǎo)致免疫逃逸及疫苗接種失敗，并造成HBsAg的漏檢。（四）HBV基因組序列的多變性特點(diǎn)： 5和3端均有回文序列（反向重復(fù)序列），可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。 能夠產(chǎn)生兩種不同極性的單鏈D

10、NA，其成熟的病毒顆粒或含正鏈或含負(fù)鏈DNA。 來(lái)源于同種病毒的不同病毒顆粒的正負(fù)ssDNA能夠退火形成雙鏈分子。單鏈DNA病毒基因組細(xì)小病毒基因組-5和3端均有回文序列，可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。RNA病毒基因組 RNA病毒基因組為線狀單鏈或雙鏈，有的只含一個(gè)RNA分子（單一分子基因組），有的則含數(shù)個(gè)RNA分子（即分段基因組）。單鏈RNA病毒 正鏈RNA（+RNA）病毒： 基因組序列與mRNA相同，可直接作為蛋白質(zhì)合成的模板。負(fù)鏈RNA（-RNA）病毒： 基因組序列與mRNA互補(bǔ)，只有在其核衣殼蛋白的轉(zhuǎn)錄酶存在下，才具有侵染能力。雙鏈RNA病毒 dsRNA鏈分+鏈和-鏈，兩條鏈都有產(chǎn)生互補(bǔ)鏈的功能，但

11、只有+鏈mRNA具有編碼能力。 正鏈RNA病毒基因組均為線狀RNA分子 1單一分子基因組 2分段基因組1） 占已知病毒總數(shù)的70以上；2） 復(fù)制精確性較差，突變比例高于DNA病毒；3） 正鏈RNA可直接翻譯蛋白質(zhì)；4） 經(jīng)提純的裸露RNA對(duì)敏感宿主細(xì)胞具有侵染性； 5） 5帽子，3尾; 6） 冠狀病毒為最長(zhǎng)的正鏈RNA病毒 2730kb正鏈RNA病毒基因組SARS病毒的生物學(xué)特征冠狀病毒（Coronavirus）是有包膜的單鏈（+）RNA病毒，其基因組為單鏈單一分子（+）RNA。 冠狀病毒曾分為三組：第一、二組包括各種哺乳動(dòng)物及人冠狀病毒（human CoV，HCoV），第三組為鳥(niǎo)類冠狀病毒（

12、Avian CoV）。SARS-CoV不屬于已知冠狀病毒中的任何一種，而是僅與之輕度相關(guān)。 認(rèn)為SARS-CoV是一種新型的冠狀病毒，很可能來(lái)源于一個(gè)獨(dú)立的冠狀病毒亞型。新型冠狀病毒（類SARS病毒），與SARS病毒屬同一病毒科，但基因有區(qū)別。 Virion Structure（SARS）N: NucleocapsidM: Membrane glycoproteinS: Spike glycoproteinE: Small envelope glycoproteinSARS-CoV基因組結(jié)構(gòu)模式圖 1單一分子基因組 2分段基因組基因組較大，編碼更多的遺傳信息；僅丁肝病毒（HDV）的基因組為負(fù)鏈

13、RNA環(huán)狀分子，其余的負(fù)鏈RNA病毒基因組均為線狀分子；普遍存在分段基因組；經(jīng)提純的病毒基因組RNA都不具有侵染性。 雙鏈RNA病毒基因組 僅球狀真菌病毒科的基因組為單一的RNA雙鏈，其他雙鏈RNA病毒基因組均為分段基因組。 如呼腸孤病毒科，其基因組有1012個(gè)雙鏈RNA片段。 負(fù)鏈RNA病毒基因組流感病毒的結(jié)構(gòu)特征流感病毒的分型流感病毒屬正粘病毒（Orthomyxoviridae）科，根據(jù)病毒核衣殼蛋白（NP）及基質(zhì)蛋白（M）的特征，可分為甲（A）、乙（B）和丙（C）型。根據(jù)病毒顆粒表面的血凝素（HA）和神經(jīng)酰胺酶（NA）的抗原性差別，甲型流感病毒又可分為不同的亞型。甲型流感病毒能夠感染人、

14、豬、馬和禽類，丙型流感病毒主要感染人和豬，乙型流感病毒僅感染人類，是引起人類流感的重要病原。 流感病毒基因組結(jié)構(gòu)特征基因組為分段的單鏈（）RNA。甲型流感病毒基因組8個(gè)RNA片段，共編碼10種蛋白?？乖疲╝ntigen shift）：由于RNA聚合酶缺乏校讀功能，使流感病毒RNA基因組的復(fù)制常發(fā)生點(diǎn)突變。這種由自發(fā)點(diǎn)突變引起的小幅度變異，積累到一定的程度引起抗原性的變異。表現(xiàn)為季節(jié)性流感病毒，人類對(duì)于發(fā)生抗原漂移的流感病毒具有一定的免疫力?？乖D(zhuǎn)變：流感病毒較大幅度突變，或毒株之間發(fā)生基因重配而產(chǎn)生新亞型。如：甲型H1N1流感病毒、上世紀(jì)出現(xiàn)的的流感大流行病毒，人類對(duì)其不具備免疫力。禽流感

15、的病原體是甲型流感病毒H5N1亞型病毒。H5N1型禽流感病毒是人與動(dòng)物共患的流感病原體，由于病毒多變異，導(dǎo)致甲型流感反復(fù)發(fā)生，難以徹底根除。 H1N1流感病毒（SIV）基因組結(jié)構(gòu)及蛋白組成 SIV的基因組結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)組成與普通流感病毒基本相同。 SIV屬于單鏈負(fù)鏈RNA病毒，基因組大約為13.6kb，由大小不等的8個(gè)獨(dú)立片段組成。共編碼11種蛋白（ PB2，PB1，PB1-F2，PA，HA，NP，NA，M1，M2，NS1，NS2 ）SIV宿主的分子生物學(xué)特性豬流感病毒對(duì)禽流感病毒受體（為唾液酸2,3半乳糖苷），及人流感病毒的受體（唾液酸2,6半乳糖苷）均具有親和性,豬的呼吸道黏膜上也同時(shí)具有這

16、兩種受體。豬流感病毒HA序列受體結(jié)合位點(diǎn)具有與兩種類型受體相似的結(jié)合潛能，決定了豬流感病毒不僅可以感染豬，同時(shí)也具有感染鳥(niǎo)類和其他哺乳動(dòng)物的可能性。豬充當(dāng)了“混合器”的作用，國(guó)際學(xué)術(shù)界已普遍認(rèn)為，通過(guò)豬可以產(chǎn)生引起流感大流行的病毒株。SIV基因的起源和進(jìn)化-SIV的基因重配逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組逆轉(zhuǎn)錄病毒（Reverse Transcribing Viruses） DNA逆轉(zhuǎn)錄病毒（DNA Reverse Transcribing Viruses） RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒（RNA Reverse Transcribing Viruses）（傳統(tǒng)意義的逆轉(zhuǎn)錄病毒Retrovirus ） 所有發(fā)現(xiàn)的RNA腫瘤

17、病毒均屬RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒的共同特點(diǎn)：能夠攜帶或編碼逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase, RT）。病毒感染細(xì)胞后，先以其RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成前病毒DNA（provirus DNA），再整合到宿主細(xì)胞染色體DNA中，隨細(xì)胞基因組的復(fù)制和細(xì)胞分裂。在宿主細(xì)胞RNA聚合酶的作用下，前病毒DNA又能重新轉(zhuǎn)錄成子代病毒基因DNA。 能與宿主基因發(fā)生重組，干擾宿主基因的表達(dá)。逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組結(jié)構(gòu)和組成 gag基因編碼核心蛋白，即DNA結(jié)合蛋白 pol基因編碼病毒復(fù)制所需的酶類（逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶、RNaseH） env基因編碼包膜蛋白 R1080base（不同病毒）的正向重復(fù)順序 U3 與轉(zhuǎn)錄終止和加polyA有關(guān) U5含強(qiáng)啟動(dòng)子，起始轉(zhuǎn)錄RNA。 PBS 反轉(zhuǎn)錄時(shí)tRNA引物的3端結(jié)合位點(diǎn) 基因組內(nèi)部的腺苷酸殘基常有6-甲基化（m6A），有的還具有序列特異性。 5 端結(jié)構(gòu)區(qū)依次為R、U5、PB、先導(dǎo)序列（Leader） 3端為PP、U3、R 這些末端結(jié)構(gòu)序列是病毒基因組進(jìn)行復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、整合和包裝的重要識(shí)別信號(hào)。 逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)錄病毒基因復(fù)制的特點(diǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒顆