免疫組化講稿

1、關于免疫組化第一張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 一 免疫組織（細胞）化學的概念 免疫組織化學（Immunohistochemistry，IHC） 又稱免疫細胞化學（immunocytochemistry， ICC），組織化學的分支。 利用抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使連接在抗體/抗原上的標記物的顯色來確定組織細胞內(nèi)抗原/抗體，對其進行定位、定性及定量的研究技術。 第二張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 應用 凡是組織細胞內(nèi)具有抗原性的物質(zhì)（肽類、蛋白質(zhì)、細胞因子、受體、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、核酸、表面抗原）或抗體均可用免疫組織化學方法顯示而進行定性、定位分析或定量研究

2、，進而深入研究其功能。 解決三大問題： 有沒有？ 在哪里？ 多與少？第三張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 特點 優(yōu)點 特異性強，定位準； 結果直觀； 形態(tài)學改變與功能和代謝相結合； 組織標本可用石蠟保存進性回顧性研究。 缺點 步驟多，影響實驗成敗的因素多； 以定位、定性和半定量研究為主，絕對定量 分析尚需標準化。 第四張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 二 免疫組化技術的基本步驟1.制片 組織切片(石蠟切片、冰凍切片) 細胞爬片 組織印片 血液涂片2.抗原抗體反應標記物的顯色（反應）3.指標檢測分析 采集圖像數(shù)據(jù)測量結果分析 第五張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月石蠟

3、切片細胞爬片第六張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 三 免疫組化的分類（1）根據(jù)標記物的性質(zhì) 必要性：組織細胞內(nèi)AgAb結合反 應一般是不可見的，若在鏡下檢測，則必須具有顏色的標記物。第七張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 酶 原理：基于酶與底物發(fā)生反應并產(chǎn)生不溶性有色產(chǎn)物。 特點：不需要特殊的顯微鏡； 染色后的標本可長期保存； 可以進行復染，使形態(tài)更明確； 可根據(jù)酶和底物的不同而顯示不同的顏 色，易進行雙重或多重染色。 第八張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 常用酶辣根過氧化物酶（ Horseradise peroaidase，HRP) 底物：DAB(四鹽酸二氨基聯(lián)苯

4、胺)，產(chǎn)物為棕褐色。堿性磷酸酶（Alkatine phasphotase, AP） 底物：NBT（四氮唑藍），產(chǎn)物為紫藍色。葡萄糖氧化酶（glucoseoxdase,GOD） 底物：葡萄糖，產(chǎn)物為藍色。注意：DAB有潛在的致突變作用第九張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 熒光素 原理：吸收特定范圍波長的光而激發(fā)其自身發(fā)出另一范圍波長（顏色）的光。 特點：需要熒光顯微鏡觀察結果； 標本不能長期保存； 敏感性高，背景低； 標本可以用多種熒光素標記。 第十張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 常用熒光素異硫氰酸熒光素 (fluoresceinisothiocyanate, FITC)，

5、最大吸收光波長為490495nm，最大發(fā)射光波長為520530nm，呈明亮的黃綠色。四乙基羅丹明 (rhodamine, RB200），最大吸收光波長為 570nm，最大發(fā)射光波長為595600nm，呈橘紅色。藻紅蛋白（P-phycoerythrin，PE），最大吸收波長約490nm，最大發(fā)射約為677nm，呈紅色。第十一張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月(2) 按抗體、抗原與標記物的作用方式 直接法： 特異性抗體（一抗）與抗原結合； 標記物直接連接在一抗上。組織抗原第一抗體標記物第十二張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月特點： 方法簡單、省時，專一性強； 非特異染色輕； 敏感性

6、差； 一種標記抗體只能檢測一種抗 原。第十三張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月間接法 一抗與待檢測的抗原結合； 二抗與一抗結合（一抗作為二抗的抗原）； 標記物連接在二抗上。組織抗原第一抗體第二抗體標記物第十四張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月特點： 敏感性高； 一種標記抗體（二抗）能用于同一中物種中多種抗原的檢測； 樣本1：兔（VEGF） 樣本2：人（P53） 一抗：小鼠抗兔（IgG） 一抗：小鼠抗人（IgG) 二抗：HRP標記山羊*抗*小鼠IgG 費時，非特異染色稍重。 第十五張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 四 抗體的選擇及保存和反應條件（1）抗體的種屬來源（宿主

7、） 樣本，一抗，二抗來自于不同種屬 樣本：大鼠 樣本：人 一抗：兔 一抗：小鼠 二抗：山羊 二抗：兔（2）反應特異性 該抗體適合檢測哪些種屬動物體內(nèi)的抗 原，不同種屬間可能存在反應差異。第十六張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（3）類型 單克隆抗體(小鼠來源),多克隆抗體。 （4）應用范圍 IHC,WB,FC,ELISA,IP； 石蠟切片(IHCP),冰凍切片(IHCFr), 甲醛固定冰凍切片（IHC-FoFr）。 (5)與抗原結合的部位 亞型， C-或N-，胞外區(qū)域或胞內(nèi)區(qū)域。 （6）公司，價格。第十七張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月國外主要抗體試劑公司 第十八張，PPT共

8、二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（7）抗體的保存與孵育條件 保存的條件 一抗：用前分裝，20； 使用后，4 。 標記二抗: 用前放于4 ； 長期不用，20； 解凍后，4 。 避免反復凍融。第十九張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月孵育的溫度與時間 一抗：4過夜（ 室溫 30min1h） 37 ， 1-2h。 二抗:室溫或37， 30min1h 。 濃度 每次使用新抗體前應當對其工作濃度 進行稀釋測試，使陽性染色強而無背 景染色。第二十張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月抗體稀釋度的棋盤稀釋測定法注：括號內(nèi)為背景染色第二十一張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 五 封閉血清的選擇

9、（1）原因：樣本里高電荷成分非特異性吸收抗 體；樣本里可能含F(xiàn)c受體而與抗體恒定區(qū) 結合。（2）來源： 與二抗同一來源的正常動物血清, 非一抗來源的動物(牛，馬)的血清, 2%牛血清白蛋白（BSA）。 加一抗前，室溫或37，10-30min。 處理完后直接加一抗，不洗滌。 第二十二張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 六 內(nèi)源性酶滅活的問題（1）原因： 在以酶做標記物時，內(nèi)源性酶和生物素易與底物競爭結合而引起非特異性染色。（2）方法： a:去除一般性酶 3%H2O2 ,10min； 0.3%H2O2-甲醇 ，1030min。 現(xiàn)用現(xiàn)配，避光,干燥處保存。 第二十三張，PPT共二十九頁，創(chuàng)

10、作于2022年6月 b:去除內(nèi)源性生物素 0.01卵白素，20min。 c:去除堿性磷酸酶 加入24mg/mL的左旋咪唑于底物液中， pH維持在7.6-8.2。 d:去除酸性磷酸酶 加入50mmol/L的酒石酸于底物液中。第二十四張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 七 對照染色設計(1)陽性對照:用已證實含靶抗原的標本與待 檢標本同時做同樣染色處理。 (2)陰性對照：用證實不含靶抗原或缺少免 疫試劑的同步處理和標記染色的對照。 a.陰性組織對照 以確知不含靶抗原的組織（細胞）標 本片與待檢標本片同時染色。第二十五張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月b.陰性試劑對照 空白對照：用不加一抗的緩沖液（如 PBS）替代一抗。 替代對照：以第一抗體同源動物未免疫的正常血清或與本實驗無關的抗體代替一抗。 吸收試驗：第一抗體被過量的經(jīng)純化的抗原中和吸收，使其結合點全部被外源性抗原封閉。 抑制試驗：待檢標本先與未標記的特異性抗體反應，再與標記的特異性抗體結合，使染色結果明顯減弱或轉陰。 第二十六張，PPT共二十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 （3）自身對照