多肽及蛋白質(zhì)類藥物的發(fā)展過程

1、多肽和蛋白質(zhì)類藥物的發(fā)展過程藥物佐劑學(xué)隨著蛋白組學(xué)計(jì)劃的逐步深入，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系逐漸被*,近年來越來 越多的多肽及蛋白質(zhì)類物質(zhì)在診斷、治療或作為疫苗預(yù)防各種疾病方面發(fā)揮著重 要作用。與小分子藥物相比，多肽及蛋白質(zhì)類大分子藥物穩(wěn)定性差、易于被酷降 解、故生物半衰期短：而擴(kuò)散差、分配系數(shù)小，乂使其難以通過生物屏障及脂質(zhì) 膜1,所以，如何將這些生物技術(shù)類物質(zhì)有效地送達(dá)人體相應(yīng)部位，一直是制 劑研究面臨的重大課題。/i ekwwA54目前，生物技術(shù)類藥物大多以注射用溶液或凍干粉針劑應(yīng)用于臨床，但常需要頻 繁給藥，致使病人的順應(yīng)性較差，且治療費(fèi)用較高。而將大分子藥物通過可生物 降解微球系統(tǒng)給藥，不

2、僅能有效防止生物大分子在體內(nèi)很快被降解，還能將藥物 定向送達(dá)體內(nèi)有效部位，并通過可生物降解聚合物的降解達(dá)到緩釋長效目的?，F(xiàn) 已有的多肽及蛋白質(zhì)類藥物微球制劑主要有：注射用緩釋制劑，口服及鼻腔吸入 劑等。隨著對這類微球制劑研究的深入，制備過程中蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性差、包封率 低、載藥量小、且易于產(chǎn)生聚集而使其生物活性降低并可能引起免疫反應(yīng)、體外 釋放時(shí)具有明顯突釋效應(yīng)等問題嚴(yán)重影響著這類制劑的發(fā)展。本文將就目前多肽 及蛋白質(zhì)類微球制劑的應(yīng)用、制備方法、出現(xiàn)的問題及常用的各種增加穩(wěn)定性、 減少其突釋效應(yīng)的物理化學(xué)方法進(jìn)行綜述。？sBbe 0C?Ammll oS1、多肽及蛋白質(zhì)微球制劑的主要類型BV pR

3、k UC”注射劑？ YOSNYwE采用可生物降解聚合物為骨架材料，將多肽及蛋白質(zhì)藥物制成微球制劑用于肌肉 或皮下注射，給藥后隨著聚合物的降解，藥物以擴(kuò)散、溶蝕方式釋放，可達(dá)到緩 釋長效的目的2。 tu6Q7CjW8),肌肉注射后可緩釋1或2個(gè)月。這類制劑中，只有10個(gè)氨基酸的LHRH 類似物微球的研究最為成功，第一個(gè)多肽微球產(chǎn)品曲普瑞林于1986年問世, 隨后亮內(nèi)瑞林、布舍瑞林、高舍瑞林、那法瑞林等長效微球制劑相繼上市。2000 年美國Genentech公司推出了重組人生長激素(rhGH)PLGA微球(Nutropin p;V H g口服制劑 a:(.z?nM多肽及蛋白質(zhì)類藥物應(yīng)用于口服須克服

4、兩大隙礙，一是抑制胃腸道各種酶對其降 解，二是選用合適的制劑形式及載體材料使藥物透過生物屏障。粒徑范圍處于1 -1000nm的毫微粒制劑是目前研究最多的口服多肽制劑，但毫微粒的表面帶電 荷情況及聚合物疏水性能均影響多肽在小腸部位的吸收。s - H e近年來的研究主要在對亳微粒表面進(jìn)行修飾，如在亳微粒表面連接各種生物粘附 材料，如脫乙酰殼多糖、Carbopol等。Kawashima等研窕者3采用乳化溶劑 擴(kuò)散法在降鈣素的PLGA毫微粒表面覆蓋一層粘附材料脫乙酰殼多糖后，與原 PLGA毫微粒相比，雖然藥物擴(kuò)散形式?jīng)]有顯著改變，但能明顯降低血鈣水平， 且能維持48小時(shí)。Lubben等報(bào)道1,脫乙酰殼

5、多糖及其衍生物能有效提高親 水性大分子物質(zhì)的吸收，因其能增加細(xì)胞間的緊密連接的開放而有利于藥物的細(xì) 胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)。P-K? ks1Rt 6u01r-2、多肽及蛋白質(zhì)類藥物微球的制備P2S$Dk_X常用材料X=-a g3、存在問題%e c9,0A4S多肽及蛋白質(zhì)穩(wěn)定性 PDe*zZ復(fù)乳溶媒蒸發(fā)/萃取法制備微球時(shí)，蛋白質(zhì)易于在油水界面聚集而變性。傅立葉 變換紅外光譜（FTIR）顯示，蛋白質(zhì)均勻分散在微球空穴內(nèi)，其中大部分分布 在微球內(nèi)部孔穴壁上，這可能是在形成w/。型初乳時(shí)蛋白質(zhì)聚集在油水界面層所 造成的12。所以，形成穩(wěn)定的w/o型初乳、減少多肽或蛋白質(zhì)在油水界面間的 聚集是將這類藥物成功包封在微球

6、中的關(guān)犍。抑制蛋白質(zhì)聚集、提高蛋白質(zhì)在制 備過程中穩(wěn)定性的方法有：在內(nèi)水相加入各種穩(wěn)定劑（如表面活性劑、多元醇、 PEG等）、改進(jìn)制備工藝、改善內(nèi)水相pH和在外水相加入附加劑等。b_&;i4加入穩(wěn)定劑h &3*0在內(nèi)水相加入一定的非離子型表面活性劑（如PVA、Pluronic F68、Poloxamer 188和311、土溫20、司盤80等）能提高初乳的穩(wěn)定性，防止乳滴合并，同時(shí) 能抑制多肽或蛋白質(zhì)在油水界面聚集，并減少突釋效應(yīng)。但這種穩(wěn)定作用具有濃 度依賴性：即減少內(nèi)水相PVA濃度，藥物包封率減小，突釋效應(yīng)增大。這可能 是由于藥物與PVA的相互作用增加，從而防止了藥物溶解和擴(kuò)散至外水相13。

7、sp4J % 2b土溫20或土溫80在噴霧過程中，不僅占據(jù)霧滴的氣液界面，減小氣液界面張 力，而且減慢液體流向霧滴的速度，進(jìn)而減少蛋白質(zhì)與疏水界面接觸的時(shí)間，抑 制了不溶性蛋白質(zhì)的聚集，同時(shí)干燥和再水化時(shí)乂起到了保護(hù)作用，致使蛋白質(zhì) 穩(wěn)定性提高14, 15o -jc8 ku3*多元醇或糖類（如海藻糖、甘露醇、果糖、乳果糖、蔗糖等）在一定濃度下能抑 制多肽或蛋白質(zhì)在油水界面的聚集，有效防止其結(jié)構(gòu)和功能方面的變化和進(jìn)一步 失活16,將這類物質(zhì)分散在蛋白質(zhì)表面，通過其與水相互作用，增加水的表面 張力，提高體系自由能，蛋白質(zhì)變性則會(huì)進(jìn)一步增加這種熱力學(xué)的不穩(wěn)定性，因 而蛋白質(zhì)溶液在糖類存在下能保持穩(wěn)定

8、17。3:Aw. -,i海藻糖即使在很低的濃度下也能顯著提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，甘露醇能減少蛋白質(zhì) 單體的損失，但要求其最好以非結(jié)晶形式存在，并與相同的蛋白質(zhì)固態(tài)相結(jié)合， 防止其與蛋白質(zhì)相分離而不能提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性14。g U7 P 吸附動(dòng)力學(xué)研究表明18,在制備微球時(shí)，一旦初乳形成，PLGA和PEG就能 馬上吸附在油水界面。在內(nèi)水相中加入PEG400,能在形成初乳時(shí)置換油水界面 的多肽或蛋白質(zhì)，減少與有機(jī)相的接觸，從而提高其在制備過程中的穩(wěn)定性，且 不影響微球形態(tài)結(jié)構(gòu)。然而在微球固化時(shí)，PEG又會(huì)影響多肽或蛋白質(zhì)與PLGA 聚合物層的結(jié)合，相對增加了其在微球表面的含量，同時(shí)由于PEG的親水性特

9、 征，加大了多肽或蛋白質(zhì)微球在釋放初期的釋放量。；P9P2& c8c改進(jìn)制備工藝&uw j&-u?多肽或蛋白質(zhì)通過高速攪拌包合在海藻酸鈣鹽中而形成含藥微芯，再以可生物降 解聚合物用復(fù)乳溶媒萃取法制備微球。Zhou等利用該法制得的人血清白蛋白 PELA微球的包封率高、表面光滑、穩(wěn)定性高，第一天突釋效應(yīng)小于用傳復(fù)乳溶 媒萃取方法制備所得的微球19。adG=L9 n將多肽或蛋白質(zhì)類藥物包封在水凝膠中形成微粒，再通過一定方法制備微球。蛋 白質(zhì)被包封在水凝膠微粒中，既保護(hù)其在制備時(shí)免遭有機(jī)溶媒破壞，防化其向油 水界面擴(kuò)散，同時(shí)由于水凝膠微粒具有快速良好的溶脹性，能吸收大量含藥水溶 液，在釋放時(shí)也避免了與

10、疏水和周圍酸性微環(huán)境接觸，提高了蛋白質(zhì)在制備和釋 放時(shí)的穩(wěn)定性20。Woo等將牛血清白蛋白包封在羥乙基淀粉的丙烯酸酯（acHES）水凝膠中制成微粒，再與PLGA通過溶媒萃取/蒸發(fā)法制得的微球不 僅態(tài)圓整、表面光滑、包封率高，而且提高了蛋白質(zhì)活性，降低了突釋效應(yīng)21。 j9 zK=eG在w1/o/w2復(fù)乳法中，由于水相的存在，加速了蛋白質(zhì)擴(kuò)散至外水相而降低了 包封率，同時(shí)由于蛋白質(zhì)的兩親性，其在油水界面易于聚集，結(jié)構(gòu)易于伸展而發(fā) 生變性。因此，考慮用油相代替水相，將蛋白質(zhì)凍干粉直接混懸于聚合物有機(jī)溶 液（如乙睛、二氯甲烷）內(nèi)，然后滴入另一高速攪拌的有機(jī)溶媒（如棉籽油）中， 并用石油醛提取乙懵而制

11、得到微球；在蛋白質(zhì)混懸液中加入凝聚劑（如二甲基硅 氧烷），再用正庚烷固化成球22,23。Jiang等用這種。/。成球技術(shù)制得的微球, 由于蛋白質(zhì)以固體形式分散在有機(jī)溶媒中，減少了蛋白質(zhì)間的聚集和化學(xué)反應(yīng)， 蛋白質(zhì)包封率、穩(wěn)定性均得到顯著提高。Carrasquillo等用該法可顯著提高蛋白 質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，但所獲得的微球的突釋效應(yīng)明顯（大于60%）。SST1v zm!應(yīng)用超臨界技術(shù)+u1meh 3u超臨界流體（superc由ical fluids SF）是指溫度和壓力超過臨界溫度（Tc）和臨 界壓力（Pc）的氣體和液體。在超臨界狀態(tài)下，物質(zhì)既象氣體一樣容易擴(kuò)散， 乂具有液體的良好溶解能力。特

12、別是在臨界點(diǎn)附近，溫度和壓力的微小變化可以 顯著影響超臨界流體的密度和溶解能力。二十世紀(jì)八十年代以來，超臨界流體技 術(shù)在國際上得到了迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，涉及領(lǐng)域包括藥物提純、化學(xué)反應(yīng)、高 分子合成、藥物新劑型制備等。采用超臨界流體技術(shù)制備微粒制劑，能盡可能少 用有機(jī)溶媒，并在制備過程中能控制微粒性質(zhì)24。Winters等采用超臨界流體 技術(shù)制備得到的胰島素、胰蛋白兩、溶菌酶微球粒徑均勻，在不同溫度下能穩(wěn)定 一年以上，且蛋白質(zhì)失活降低25。D Pu ze*改變外水相pH及加入附加劑9 R uAv!l !7當(dāng)外水相pH接近所要包封蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，微球載藥量及藥物包封率最高，這 可能是當(dāng)外水相處于蛋

13、白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，其溶解度最小，從而使初乳中蛋白質(zhì)難以 滲出的緣故。-! uu t7Z|在外水相中加入一定量的電解質(zhì)（如NaCI）、糖類（如D山梨糖醇）有利于蛋 白質(zhì)包封，這可能是在第二次乳化時(shí)增加了蛋白質(zhì)從VWO初乳中擴(kuò)散至外水相 的分配系數(shù)和滲透壓，而阻礙了蛋白質(zhì)由初乳向外的擴(kuò)散。lAiJAZvx 3.1.5加入低溶解度無機(jī)堿鹽26,27 %Z +K_X9x蛋白質(zhì)在PLGA微球中不穩(wěn)定的主要原因是，而備時(shí)聚合物中少量殘留的水、 以及PLGA等聚合物降解時(shí)所形成較強(qiáng)的酸性環(huán)境。為了使聚合物降解時(shí)保持 近中性，考慮在制備時(shí)加入少量溶解度小的無機(jī)堿鹽，以中和聚合物降解時(shí)所形 成的酸性環(huán)境，從而提高蛋

14、白質(zhì)在微球中的穩(wěn)定性。該類無機(jī)堿鹽包括 Mg（OH）2 Zn（OH）2、Ca3（PO4）2 等。 cER7,y修飾蛋白質(zhì)tA0A He$Ot將蛋白質(zhì)與醋酸鋅結(jié)合形成比蛋白質(zhì)單體更穩(wěn)定的鋅一蛋白質(zhì)二聚體復(fù)合物，抵 抗在氣液界面的疏水作用，抑制蛋白質(zhì)聚集，在降低了比表面積同時(shí)，乂不會(huì)對 微球的大小和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，從而提高了蛋白質(zhì)在制備過程中的穩(wěn)定性 18。w9 I7plll突釋效應(yīng)及其解決方法人6!CM :f微球凍干后往往會(huì)導(dǎo)致微球表面形成許多小孔穴，這些孔穴使蛋白質(zhì)類水溶性物 質(zhì)易于從中釋放，從而表現(xiàn)為藥物的突釋效應(yīng)。此外在微球制備中，原聚集在油 水界面上的蛋白質(zhì)易快速溶出也是引起此類微球

15、中蛋白質(zhì)突釋的原因之一 10。%0e 1T（將多肽或蛋白質(zhì)與PEG結(jié)合形成PEG化的多肽或蛋白質(zhì)，抑制其在油水界面 的聚集，減少水不溶性聚合物的形成，增加其在溶液中結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性；同 時(shí)，PEG化后能延長蛋白質(zhì)在體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，延長其生物半衰期。由于蛋白質(zhì) 表面的PEG化使蛋白質(zhì)占有的空間體積增大，從而難以從小孔擴(kuò)散，也起到了 降低其突釋效應(yīng)的作用28, 29o Diwan等報(bào)道，將溶菌酶接上對甲氧基聚乙二 醇（mPEG5000）后,其生物活性不變（101.3+10.4%）,但對有機(jī)溶劑（如 二氯甲烷）和制備過程中攪拌的穩(wěn)定性大大增強(qiáng)，對空白PLGA微球的吸附作 用降低，相對于不接mPEG的溶菌根，其突程效應(yīng)大大減少（1小時(shí)