植物組織培養(yǎng)

1、植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)報(bào)告學(xué)院：生命科學(xué)學(xué)院班級(jí)：2014級(jí)生科一班姓名：郭濤學(xué)號(hào)：2014506063植物組織培養(yǎng)摘要：植物組織培養(yǎng)是根據(jù)植物細(xì)胞全能性理論發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)無(wú)性繁殖新技術(shù)，又稱為離 體培養(yǎng)。廣義的組織培養(yǎng)是指從植物體分離出符合需要的組織、器官或細(xì)胞、原生質(zhì)體等， 在無(wú)菌條件下接種在含有各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及植物激素的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)以獲得再生的完整 植株或生產(chǎn)具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的其他產(chǎn)品的技術(shù)。狹義是指組培指用植物各部分組織，如形成層、 薄壁組織、葉肉組織、胚乳等進(jìn)行培養(yǎng)獲得再生植株，也指在培養(yǎng)過(guò)程中從各器官上產(chǎn)生愈 傷組織的培養(yǎng)，愈傷組織再經(jīng)過(guò)再分化形成再生植物。關(guān)鍵詞：植物組織培養(yǎng)、細(xì)胞全能性

2、、初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)前言新興的植物組織培養(yǎng)技術(shù)其優(yōu)點(diǎn)也較多，例如組織培養(yǎng)占用空間小，不受地區(qū)、季節(jié)限 制，培養(yǎng)周期短，可短時(shí)間內(nèi)大量繁殖某種植物，投資少，經(jīng)濟(jì)效益高等等。植物組織培養(yǎng) 還可用于拯救瀕危植物，用組培中的愈傷組織制取特殊的生化制品，解決有些植物產(chǎn)種子少 或無(wú)的難題等很多的領(lǐng)域。掌握組織培養(yǎng)的基本技術(shù)是很有必要的。實(shí)驗(yàn)原理1.1植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)是把植物的器官，組織以至單個(gè)細(xì)胞，應(yīng)用無(wú)菌操作使其在人工條件下， 能夠繼續(xù)生長(zhǎng)，甚至分化發(fā)育成一完整植株的過(guò)程。植物的組織在培養(yǎng)條件下，原來(lái)已經(jīng)分 化停止生長(zhǎng)的細(xì)胞，又能重新分裂，形成沒(méi)有組織結(jié)構(gòu)的細(xì)胞團(tuán)，即愈傷組織。這一過(guò)程稱 為“脫

3、分化作用”，已經(jīng)“脫分化”的愈傷組織，在一定條件下，又能重新分化形成輸導(dǎo)系 統(tǒng)以及根和芽等組織和器官，這一過(guò)程稱“再分化作用”。1.2植物細(xì)胞的全能性植物細(xì)胞的全能性即是每個(gè)植物的本細(xì)胞或性細(xì)胞都具有該植物的全套遺傳基因，在一 定培養(yǎng)條件下每個(gè)細(xì)胞都可發(fā)育成一個(gè)與母體一樣的植株。1.3組織的分化與器官建成外植體誘導(dǎo)出愈傷組織后，經(jīng)過(guò)繼代培養(yǎng)，可以在愈傷組織內(nèi)部形成一類分生組織即具 有分生能力的小細(xì)胞團(tuán)，然后，再分化成不同的器官原基。有些情況下，外植體不經(jīng)愈傷組 織而直接誘導(dǎo)出芽、根。1.4培養(yǎng)基的組成培養(yǎng)基中各成分的比例及濃度與細(xì)胞或組織的生長(zhǎng)或分化所需要的最佳條件相近，似成 功地使用該培養(yǎng)基

4、進(jìn)行組織培養(yǎng)的主要條件。營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基一般由無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)、碳源和能源、維 生素、植物激素(生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑)和包括有機(jī)氮、酸和復(fù)雜物質(zhì)的添加劑組成。材料、試劑和儀器2.1材料：胡蘿卜、李子花、李子的莖段、李子葉片2.2試劑：70%酒精、0.1%升汞、MS培養(yǎng)基、蒸餾水、NaOH、蔗糖、瓊脂等。2.3儀器：高壓滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、烘箱、培養(yǎng)皿、鑷子、記號(hào)筆、剪刀、酒精燈等。實(shí)驗(yàn)步驟3.1培養(yǎng)基母液的配制分別配制好各種母液包括大量元素、CaCl2.2H2O、微量元素、有機(jī)物、以及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物 質(zhì)如 NAA、2，4-D、6BA。3.2培養(yǎng)基的配制將稱好的瓊脂加入容器內(nèi)加入蒸餾水，加熱溶解至完全，再加入蔗糖溶解，隨后

5、加入各種母液，混合均勻后調(diào)節(jié)PH值至5.8 6.0。3.3高壓蒸汽滅菌具體步驟為：進(jìn)水一放進(jìn)培養(yǎng)基一蓋緊鍋蓋一關(guān)上放汽閥一檢查安全閥一接上加熱源一待壓力升至 0.05MPa時(shí)排鍋內(nèi)冷空氣，關(guān)上放氣閥一0.11MPa(121C)下滅菌2025分鐘，保持穩(wěn)定壓力 一除熱源一逐漸打開(kāi)放氣閥一鍋內(nèi)空氣排除完后一開(kāi)放鍋蓋一稍冷后取出培養(yǎng)基。3.4初代培養(yǎng)3.4.1準(zhǔn)備打開(kāi)超凈工作臺(tái)，將鑷子酒精燈放如超凈工作臺(tái)中，用紫外燈照20min后關(guān)閉紫外燈， 同時(shí)將植物組織用自來(lái)水沖20min。走進(jìn)工作臺(tái)后，用酒精棉球搽拭雙手，特別是指甲處， 并搽拭工作臺(tái)面。點(diǎn)燃超凈工作臺(tái)的酒精燈，適當(dāng)灼燒鑷子，剪刀，刀片等工具。

6、將滅菌溶 液，無(wú)菌水，等放入超凈工作臺(tái)。3.4.2滅菌在超凈工作臺(tái)上取經(jīng)浸泡處理的豌豆，先用酒精倒入種子瓶中約2 / 3消毒一次(1-2s) 接著用無(wú)菌水沖洗一次。再用酒精搖晃清洗清洗3次，每次5分鐘，清洗完后用無(wú)菌水沖洗一次。而后用HgCI泡5min，處理2次，每次3分鐘。后用無(wú)菌水搖晃清洗4-5次。3.4.3接種將滅菌處理好的材料在超凈工作臺(tái)上用鑷子靠近酒精燈的外焰放入向下傾斜的培養(yǎng)瓶 中，每個(gè)瓶?jī)?nèi)裝34塊植物組織，接種過(guò)程中培養(yǎng)瓶口應(yīng)一直保持向下傾斜，直到接種完 畢蓋上蓋子。接種完畢后要清理干凈工作臺(tái)。3.4.4標(biāo)記接種完畢后，給培養(yǎng)瓶貼上標(biāo)簽，放入培養(yǎng)架上。3.5繼代培養(yǎng)從初代培養(yǎng)物中

7、選取愈傷組織分化較好無(wú)污染的材料，在超凈工作臺(tái)中將其接種至繼代 培養(yǎng)基中，并標(biāo)記，置于黑暗中培養(yǎng)。隔一定時(shí)間觀察愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)。結(jié)果與討論4.1培養(yǎng)結(jié)果如下：2016.4.20初代培養(yǎng)一周后:胡蘿卜2016.04.27繼代培養(yǎng)記錄：2016.05.11繼代培養(yǎng)觀察:2016.05.27繼代培養(yǎng)觀察:時(shí)間問(wèn)題反饋2016.4.20初代培養(yǎng)一周后觀察（1）初代培養(yǎng)一周后，花、莖段均受到污染，葉片無(wú)明顯長(zhǎng)勢(shì)， 只有胡蘿卜長(zhǎng)勢(shì)較好，有愈傷組織產(chǎn)生。（2）當(dāng)以花為外植體進(jìn)行接種時(shí)，應(yīng)取花的完整結(jié)構(gòu)，不應(yīng)只取 一片花瓣。且最好是未開(kāi)放的花朵，這樣的花受污染更少，更易接 種成功。（3）對(duì)于莖段的接種，由于消毒

8、不夠到位，造成嚴(yán)重的褐化現(xiàn)象。2016.04.27繼代培養(yǎng)記錄由于花、莖段的培養(yǎng)都受到了污染，葉片無(wú)明顯長(zhǎng)勢(shì)，所以選 取了長(zhǎng)勢(shì)較好的胡蘿卜作為繼代培養(yǎng)的材料，接種了兩瓶繼代培養(yǎng) 物。2016.05.11繼代培養(yǎng)觀察繼代培養(yǎng)沒(méi)有受到污染，愈傷組織增殖情況較好，呈現(xiàn)不規(guī)則形狀， 其顏色有明顯的變化：橙紅色一淺黃色一乳白色。2016.05.27繼代培養(yǎng)觀察在后期的觀察中由于傾斜培養(yǎng)皿而使外植體移位，影響了外植 體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，長(zhǎng)勢(shì)呈下降趨勢(shì)。4.2討論通過(guò)此次實(shí)驗(yàn)，我自己又總結(jié)了一些實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)：（1）實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前要自己認(rèn)真的了解實(shí)驗(yàn)過(guò)程以及每一步的原理，這樣，既不會(huì)再步驟中出 錯(cuò)，而且，可以大大減少

9、每一步中出現(xiàn)的差錯(cuò)或者意外因素對(duì)實(shí)驗(yàn)造成的影響。（2）實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要靜下心來(lái)，細(xì)心仔細(xì)地完成每一步。（3）此次試驗(yàn)中很重要的一步即是對(duì)外植體的滅菌過(guò)程，既不能滅菌時(shí)間過(guò)長(zhǎng)對(duì)外植體早 成傷害，又不能時(shí)間過(guò)短，滅菌不完全，而且可以搭配集中滅菌試劑，綜合使用。在接種的 過(guò)程中也要格外注意無(wú)菌操作，這些都是實(shí)驗(yàn)成功地基本前提。本次實(shí)驗(yàn)有成功之處，亦有不足之處。在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)，因?yàn)椴僮魃系牟粐?yán)謹(jǐn)性 等多種原因?qū)е陆Y(jié)果不理想，但在繼代培養(yǎng)時(shí)，我深刻體會(huì)到了實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)的重要性，因此， 繼代培養(yǎng)初期，取得了較好的結(jié)果，但還是由于粗心大意，使外植體的長(zhǎng)勢(shì)出現(xiàn)了下降趨勢(shì)。 通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)，我深刻認(rèn)識(shí)到了嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度的重要性，理論與實(shí)踐是不可分割的，在理 論學(xué)習(xí)的同時(shí)，還需要認(rèn)真的進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。參考文獻(xiàn).李浚明，朱登云.植物組織培養(yǎng)（第3版）.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社.2005