大黃蟲丸經(jīng)旁分泌途徑對(duì)早期肝纖維化的干預(yù)作用

1、大黃蟲丸經(jīng)旁分泌途徑對(duì)早期肝纖維化的干預(yù)作用【摘要】目的觀察大黃蟲丸經(jīng)旁分泌途徑對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞增殖及其表達(dá)TGF-1基因的影響。方法采用Nydenz別離液非連續(xù)密度梯度離心法同步別離急性l4損傷模型大鼠和正常大鼠肝的枯否細(xì)胞K和星狀細(xì)胞HS。在制備正常鼠血清和大黃蟲丸藥物血清的根底上，將它們分別參加K培養(yǎng)板內(nèi)作用48h后制備成正常鼠K條件培養(yǎng)液NK和損傷鼠K條件培養(yǎng)液K。將NK和K作用于活化的HS24h后，采用TT法和3H-TdR摻入法檢測(cè)HS增殖的變化；采用半定量RT-PR法擴(kuò)增TGF-1RNA以檢測(cè)HS表達(dá)TGF-1基因的情況。結(jié)果旁分泌組各組的HS增殖幅度及TGF-1基因的相對(duì)表達(dá)量較

2、正常對(duì)照組NK組均明顯增加P0.05或0.01。同時(shí)旁分泌組中，含藥血清作用的5%，10%和20%K組較無藥物血清作用的0%K組HS的增殖才能及TGF-1基因的相對(duì)表達(dá)量那么下降，且隨藥物濃度的升高逐漸降低，其組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0.05或P0.01。結(jié)論大黃蟲丸可明顯抑制經(jīng)旁分泌途徑活化的大鼠HS的增殖及TGF-1基因的表達(dá)，且其抗肝纖維化效應(yīng)與藥物劑量間存在一定的依賴關(guān)系?！娟P(guān)鍵詞】大黃蟲丸肝纖維化肝星狀細(xì)胞旁分泌Abstrat：bjetiveTbservetheeffetsfDahuangZhehngPillntheprliferatinfrathepatistellateells(H

3、Ss)ativatedbypararinepathayandtheexpressinftransfringgrthfatr-beta1(TGF-1)gene.ethdsThel4-injuredandnralratKupfferells(Ks),hepatistellateellsereseparatedbynn-ntinuusdensitygradiententrifugatinfNydenzediu.Afterthenratandthedrugseraprepared,theyereaddedrespetivelyintKupfferellultureplatesfrnralKupffer

4、ellsnditinedediu(NK)andinjuredratKupfferellsnditinedediu(K)after48h.ebservedthehangesfprliferativeHSsbytheethdsfTTand3H-thyidine(3H-TdR)inrpratinassay,andtheexpressinfTGF-1geneinHSsbysei-quantitativeRT-PRhenHSsereativedfr24hbythsenditinedediu.ResultsInallpararinegrups,theultipliatinfHSsandtherelativ

5、eexpressinfTGF-1geneereinreasedarkedlyparedtnralntrlgrup(P0.05rP0.01),andgraduallydereasedinalldrugandndrugserugrupsithelevateddrugnentratin.Therehadsignifiantdiferenesangallgrups.nlusinDahuangZhehngPillanbviuslyinhibittheprliferatinfratHSsativatedbypararinepathayandtheexpressinfTGF-1geneinHSsanddee

6、reasehepatifibrsisinanentratin-dependentanner.Keyrds：DahuangZhehngPill;Liverfibrsis;Hepatistellateell;Pararine肝纖維化是從各型慢性肝病轉(zhuǎn)化為肝硬化的一個(gè)重要病變過程，有效逆轉(zhuǎn)肝纖維化已成為防治肝硬化的重要手段。它是一個(gè)伴隨肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)E增多和沉積的瘢痕化過程，在細(xì)胞和分子程度上以HS的活化、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1transfringgrthfatr-beta1，TGF-1及其下游細(xì)胞調(diào)節(jié)因子活性異常為主要特征1。因此，抑制HS活化和減少肝組織內(nèi)TGF-1的表達(dá)是逆轉(zhuǎn)肝纖維化的中心環(huán)節(jié)。大黃蟲

7、丸DHZ具有緩中補(bǔ)虛、活血化瘀、通絡(luò)軟堅(jiān)等成效，以往的臨床和實(shí)驗(yàn)研究說明該藥在防治肝纖維化方面效果明顯2，3。本實(shí)驗(yàn)擬觀察大黃蟲丸對(duì)l4損傷大鼠肝組織內(nèi)經(jīng)旁分泌途徑活化的星狀細(xì)胞HS的增殖和TGF-1基因表達(dá)情況的影響，進(jìn)一步討論該藥抗肝纖維化的作用機(jī)制。1材料與儀器1.1動(dòng)物雄性SpragueDaleySD大鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量400500g，均由中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，普通飼料和普通飲水飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前禁食12h。1.2HS細(xì)胞株由北京大學(xué)人民醫(yī)院肝膽外科中心魏玉華教師惠贈(zèng)。1.3藥物大黃蟲丸藥粉為暗紫色粉末，由廣東陽江制藥廠惠贈(zèng)。1.4試劑和儀器鏈霉蛋白酶EPrnaseE、型膠原

8、酶Typellagenase、DNaseI、胰蛋白酶Trypsine、Nydenz原液、噻唑藍(lán)TT均購自Siga公司；四氯化碳l4、高純度瓊脂糖、核酸染料等生化試劑購自上海生物工程；199培養(yǎng)液標(biāo)準(zhǔn)型、DE干粉均購自Invitrgen公司產(chǎn)品；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清fetalbvineseru，F(xiàn)BS購自杭州四季青生物制品公司；總RNA提取試劑RNAisReagent、RT-PR試劑盒TaKaRaRNAPRKit(AV)Ver.3.0及100bpDNAarkers均購自寶生物工程大連；引物由上海英駿生物技術(shù)合成；氚-胸腺嘧啶核苷3H-TdR購自中國科學(xué)院上海原子核研究所等。LYPUSX31型倒置相差顯微

9、鏡LYPUS公司；HeraeusBifuge15R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)德國Heraeus公司；HeraeusBB16型2恒溫培養(yǎng)箱德國Heraeus公司；SDJ-SP三相單人程度層流干凈工作臺(tái)上海淀山湖凈化廠；FJ-211G雙道液體閃爍儀西安二六二廠產(chǎn)品；Bi-TekEL800型全自動(dòng)酶標(biāo)儀美國Bi-Tek公司產(chǎn)品；PER-PA300型電泳儀美國BI-RAD公司產(chǎn)品；JPT-100T型PR儀美國JRearh公司產(chǎn)品；BI-ATE5型紫外可見光分光光度計(jì)BI-ATE日本公司消費(fèi)等。2方法2.1含藥血清及正常鼠血清的制備參考文獻(xiàn)方法4給予SD大鼠灌胃服用大黃蟲丸藥粉每只每天2.7g。將上述藥粉用超

10、純水溶解，每天分兩次灌胃給藥，4l/次，連續(xù)給藥5d。空白對(duì)照組為正常大鼠組，灌胃等量超純水。采血時(shí)間為末次灌胃后1h，以乙醚麻醉大鼠，無菌狀態(tài)下翻開大鼠心臟，經(jīng)右心房抽血，2000r/in離心15in，血清經(jīng)56滅活30in后置于-20冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?.2造模采用SD雄性大鼠，皮下注射50%l45l/kg與植物油按11比例混合，5d后別離K。2.3K的別離參考文獻(xiàn)5并改良，別離培養(yǎng)損傷模型鼠和正常鼠的K，臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞活性，碳素墨汁吞噬實(shí)驗(yàn)鑒定細(xì)胞。正常大鼠的細(xì)胞得率為0.51071.0107/肝，損傷模型鼠的細(xì)胞得率為1.01071.5107/肝,純度均90%。2.4HS細(xì)胞株的培

11、養(yǎng)以5103ells/2接種于50l培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，參加含10%FBS的199培養(yǎng)液，每3天左右鋪滿單層后傳代。2.5條件培養(yǎng)液制備正常鼠K條件培養(yǎng)液NK的制備：參考文獻(xiàn)6并改良。K以1105ells/2密度接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)48h后吸棄培養(yǎng)液，再參加含20%正常鼠血清的DE培養(yǎng)液3l繼續(xù)培養(yǎng)，24h后搜集上清液，0.22微孔濾膜過濾，記為NK。同樣方法48h后再搜集1次，兩次的NK混合，置于-70冰箱中保存?zhèn)溆?。損傷鼠K條件培養(yǎng)液K的制備：方法同上，但參加的血清為藥物血清，濃度分別為含0%0%藥物血清+20%正常鼠血清，5%5%藥物血清+15%正常鼠血清，10%10%藥物血清+10%正常鼠血清

12、和20%20%藥物血清，無正常鼠血清，搜集的上清液分別記為0%，5%，10%和20%K。2.6實(shí)驗(yàn)分組對(duì)照組：將HS細(xì)胞株接種于培養(yǎng)板培養(yǎng)24h后，棄去培養(yǎng)液，參加NK，作用于HS24h后即可檢測(cè)。旁分泌組：包括0%，5%，10%，20%K組共4組。參加方法同對(duì)照組。2.7活化HS增殖的檢測(cè)采用TT法和3H-TdR摻入法檢測(cè)。TT法：稱取125gTT放入小燒杯中，加25lPBS0.01l/L，pH7.4攪拌15in，用0.22的微孔濾器除菌，分裝后4避光保存?zhèn)溆?。將鋪滿單層的HS用0.25%胰酶消化后，以103ells/孔密度接種于96孔板中。培養(yǎng)24h后，吸棄上清，分別參加NK，0%，5%，

13、10%，20%K各200l每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，用不同批次的重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。繼續(xù)培養(yǎng)至20h后，每孔參加TT溶液5g/120l，孵育4h棄上清液，PBS洗滌，然后每孔參加200lDS，小心振蕩10in，使結(jié)晶物充分溶解。選擇570n波長(zhǎng)，以酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔D值。3H-TdR摻入法：將HS以104ells/孔密度接種于24孔板中，培養(yǎng)24h后吸棄培養(yǎng)液，再參加方法同上，液體總量為500l/孔。培養(yǎng)至20h后，再每孔參加0.5i/l00l的3H-TdR，繼續(xù)培養(yǎng)4h后吸棄上清，胰酶消化，洗滌，超速離心過濾后將細(xì)胞搜集于玻璃纖維濾膜上，在60恒溫枯燥箱內(nèi)放置30in烘干，移至測(cè)量管內(nèi)，用液閃計(jì)數(shù)儀測(cè)定每孔HS

14、的放射活性即每分鐘脈沖數(shù)值p值。2.8活化HS表達(dá)TGF-1RNA的檢測(cè)采用半定量RT-PR兩步法和瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。以-Atin為內(nèi)參照，以GenBank庫內(nèi)TGF-1的最新RNA序列為準(zhǔn)，同源比擬后使用軟件PrierPreier5.0設(shè)計(jì)引物并合成引物序列：TGF-1的上游引物為5-GAAAAGAATTATG-3，下游引物為5-AGTGTATTGTTTT-3，產(chǎn)物片斷長(zhǎng)度為305bp；參照文獻(xiàn)7設(shè)計(jì)合成-Atin引物：上游引物為5-GGATTGATGAAGTA-3，下游引物為5-GGATAGTGATGATGA-3，產(chǎn)物片斷長(zhǎng)度為565bp。實(shí)驗(yàn)前將HS以106ells/孔密度接種于6

15、孔板中，培養(yǎng)24h后吸棄培養(yǎng)液，參加方法同上，液體總量為1.5l。繼續(xù)培養(yǎng)24h后吸棄，PBS洗滌，參加RNAis試劑1l/孔充分裂解細(xì)胞。按試劑盒說明操作，提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)量吸光度值D值。提取的總RNAA260/A280在1.61.8之間，符合實(shí)驗(yàn)要求，而后進(jìn)展逆轉(zhuǎn)錄反響。逆轉(zhuǎn)錄均采用隨機(jī)引物ligdT，40l體系，反響條件均為：4230in，995in，55in，4保存。PR反響體系為25l將試劑盒配量減半，上游和下游引物各加1l，內(nèi)參照-Atin和目的基因不在同一反響管反響。-Atin的反響條件為：94預(yù)變性5in，94變性30s，60退火30s，72延伸1in，30個(gè)

16、循環(huán)，最后72繼續(xù)延伸10in，4保存；TGF-1的反響條件為：94預(yù)變性5in，94變性30s，60退火45s，72延伸45s，34個(gè)循環(huán)，最后72繼續(xù)延伸10in，4保存。取PR產(chǎn)物各5l參加1%瓊脂糖凝膠上樣孔，置于1TAE緩沖液內(nèi)，80V電壓電泳40in。取出凝膠塊放入紫外分析儀數(shù)碼相機(jī)照相記錄結(jié)果，采用凝膠圖像分析軟件BandSan5.0分析DNA相對(duì)表達(dá)量，即目的基因TGF-1與內(nèi)參照-Atin的總灰度比值，以相比照值代表基因的相對(duì)表達(dá)量。2.9數(shù)據(jù)分析各組數(shù)據(jù)均使用s表示，多組計(jì)量資料均數(shù)比擬采用方差分析，組間兩兩比擬采用SNK-q檢驗(yàn)。使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件分析數(shù)據(jù)，

17、=0.05。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.3結(jié)果3.1條件培養(yǎng)液對(duì)活化HS增殖的影響旁分泌組和正常對(duì)照組對(duì)活化的HS作用24h后，TT法檢測(cè)各組的D值為：NK0.3750.056、0%K0.7570.087、5%K0.6370.079、10%K0.5670.108、20%K0.4910.121。由圖1可知，旁分泌組和正常對(duì)照組相比，D值均升高，除20%K組與NK組間無明顯差異外，其余組與NK組間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0.05或P0.01，n=9，說明與正常鼠NK相比，損傷鼠的K對(duì)活化的HS有促增殖作用，但當(dāng)?shù)竭_(dá)20%藥物血清濃度時(shí)，活化的HS幾乎恢復(fù)到正常鼠的靜止?fàn)顟B(tài)。此外，旁分泌組的D值隨著含藥血清

18、濃度的升高而出現(xiàn)明顯下降，其中含藥血清作用組5%K、10%K、20%K組和無藥物血清作用組0%K組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0.05或P0.01，說明含藥血清作用后的K可以抑制活化的HS增殖，且呈一定的濃度依賴關(guān)系。旁分泌組和正常對(duì)照組對(duì)活化的HS作用24h后，3H-TdR試驗(yàn)結(jié)果顯示各組的p值為：NK296156、0%K795105、5%K579138、10%K381124、20%K308135。由圖2可知，旁分泌組和正常對(duì)照組相比，p值均有升高，且旁分泌組中無含藥血清組0%K組及含藥血清組的5%K組和正常對(duì)照組間的差異顯著P0.01，n=9，而含藥血清組10%、20%K組和正常對(duì)照組間無明顯

19、差異P0.05；此外，旁分泌組組間比擬，隨著血藥濃度升高，p值逐漸降低，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0.05或P0.01。其意義同TT法一樣，且血藥濃度達(dá)10%時(shí)即已明顯抑制HS的增殖。3.2條件培養(yǎng)液對(duì)活化HS表達(dá)TGF-1基因的影響將各組條件培養(yǎng)液作用于活化的HS達(dá)24h后，各樣本的PR產(chǎn)物電泳圖如圖3，對(duì)照組和旁分泌組的活化HS表達(dá)TGF-1RNA的相對(duì)量檢測(cè)結(jié)果如圖4所示：NK2.3160.181、0%K2.6250.185、5%K2.5760.123、10%K2.4870.144、20%K2.4050.157。結(jié)果顯示，旁分泌組與對(duì)照組比擬，TGF-1基因的相對(duì)表達(dá)量均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

20、義P0.05或P0.01，n=9，說明TGF-1基因在早期的纖維化啟動(dòng)過程中就開場(chǎng)有表達(dá)。而旁分泌組中TGF-1基因的表達(dá)含藥血清組均比無藥物血清組明顯降低P0.05或P0.01，且隨藥物血清濃度的升高，降低越明顯，說明TGF-1的表達(dá)可能與藥物濃度存在依賴關(guān)系，進(jìn)一步證實(shí)了DHZ藥效與劑量間可能存在的關(guān)系。4討論肝損傷時(shí)，刺激HS活化的因素非常多，但涉及到細(xì)胞-細(xì)胞、間質(zhì)-細(xì)胞間互相作用的途徑不外兩條，即旁分泌途徑與自分泌途徑。研究證實(shí)，HS是肝纖維化的細(xì)胞學(xué)根底，也是產(chǎn)生E的主要細(xì)胞，而TGF-1那么是促肝纖維化的關(guān)鍵細(xì)胞因子1。肝損傷炎癥早期，肝K的旁分泌在啟動(dòng)HS活化中起著重要作用；后

21、期，活化的HS此時(shí)又稱為肌成纖維樣母細(xì)胞，F(xiàn)B那么分泌TGF-、作用于自身，并促使未轉(zhuǎn)化的HS向FB轉(zhuǎn)化，合成E。即使肝損害因子已祛除，F(xiàn)B的自分泌和旁分泌仍可繼續(xù)進(jìn)展下去。因此，目前的臨床和實(shí)驗(yàn)性抗肝纖維化治療藥物主要針對(duì)HS或FB、細(xì)胞因子包括TGF、PDGF、TGF等及其受體、活性氧自由基和膠原合成等。文獻(xiàn)報(bào)道，正常肝K對(duì)HS并無激活作用，而損傷后K激活作用明顯增加8。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，同時(shí)參加不含藥物血清的K條件培養(yǎng)液和正常鼠血清條件培養(yǎng)液后，前者的活化HS增殖明顯，在參加不同濃度的DHZ藥物血清后，那么抑制了這種作用，且隨著藥物濃度的升高，抑制效應(yīng)越強(qiáng)，呈現(xiàn)一定的藥物濃度關(guān)系，反響了該藥

22、物可通過抑制旁分泌途徑來抑制HS的進(jìn)一步活化。目前TGF-存在5種形式，哺乳動(dòng)物體內(nèi)主要存在TGF-1、TGF-2、TGF-3種形式，并分別有各自相應(yīng)的受體，在肝臟中含量最高且具有生物活性的是TGF-1。TGF-以自分泌和旁分泌方式參與HS的活化1，6，促進(jìn)HS合成各種膠原成分以及組織金屬蛋白抑制劑TIPs，同時(shí)可以抑制基質(zhì)金屬蛋白酶Ps的合成，引起E積聚而導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生9。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不含藥的K參加后活化HS不僅增殖明顯，TGF-1基因的表達(dá)也明顯增加，當(dāng)參加含藥K后那么抑制了活化的HS表達(dá)細(xì)胞因子TGF-1。實(shí)驗(yàn)還說明，當(dāng)藥物濃度到達(dá)20%時(shí)，活化的HS有可能恢復(fù)到靜止?fàn)顟B(tài)，TGF

23、-1的表達(dá)卻并未完全恢復(fù)，說明TGF-1不僅僅來源于HS的分泌，也可能來源于條件培養(yǎng)液。中醫(yī)理論認(rèn)為DHZ方中的大黃、桃仁可化血通瘀；地黃可養(yǎng)陰補(bǔ)血；白芍可養(yǎng)血柔肝，養(yǎng)陰清熱；大黃等還可清熱消炎；蟲、水蛭類藥那么可走竄入絡(luò)、活血軟堅(jiān)10。此外，大黃、地黃、甘草還可調(diào)節(jié)慢性肝炎及肝纖維化病人的免疫功能。研究說明，DHZ不僅可以改善肝炎肝硬化患者的臨床病癥和肝功能，還可以促進(jìn)肝纖維化病變的修復(fù)。本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞和分子程度,進(jìn)一步驗(yàn)證了DHZ可通過抑制旁分泌途徑以抑制活化HS增殖和細(xì)胞因子TGF-1的表達(dá)，到達(dá)抗肝纖維化的效應(yīng)。【參考文獻(xiàn)】1GressnerA,EiskirhenR.dernpathge

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