色譜分析平面色譜法

色譜分析平面色譜法第五章平面色譜法第一節(jié)概述1938年俄國人首先實現(xiàn)了在氧化鋁薄層上分離一種天然藥物。1965年德國化學家出版了“薄層色譜法”一書，推動了這一技術(shù)的發(fā)展。因TLC法設(shè)備簡單，分析速度快，分離效率高，結(jié)果直觀，很快被用作定性和半定量的方法。70年代中后期發(fā)展了高效薄層色譜。80年代以后發(fā)展了薄層色譜光密度掃描儀，和各步操作的儀器化，并實現(xiàn)了計算機化。第2頁,共30頁，2024年2月25日，星期天Thin-layerchromatographyofstandardPLsamplesFig.1Description:Thethermo-stabilityofphospholipidsandlysophospholipidswasdeterminedbyonedimensionalthin-layerchromatography(TLC).Achloroform-methanol-28%aqueousammoniasolventsystem(65:35:8,v/v)providedclearseparationofmajorphospholipids(PL)andtheirlysoforms.The5%(w/v)dodecamolybdophosphoricacidsolutioninethanolwasusedassprayreagent.ThethermostabilityofphospholipidswasevaluatedbycomparethespotsdensityandareaofPLsampleswithvaryingheattreatment.Rapiddeterminationofthermo-stabilityofphospholipidsbyTLC第3頁,共30頁，2024年2月25日，星期天第五章平面色譜法定義：平面色譜法(planechromatography)是在平面上進行分離的一種色譜方法。

一、平面色譜法的分類和原理分類紙色譜法：濾紙為載體，纖維素的羥基與水結(jié)合形成液-液分配色譜固定相，展開劑由于毛細作用沿濾紙向上運動。---分配色譜薄層色譜法：將吸附材料均勻固定在載板上，由于吸附劑顆粒間的毛細作用，展開劑（流動相）上行。-----吸附色譜薄層電泳法：荷電組分樣品負載于惰性支持介質(zhì)（紙、纖維素、聚丙烯酰胺凝膠等），在電場作用下進行分離。第4頁,共30頁，2024年2月25日，星期天二、平面色譜法的基本流程確定樣品的預(yù)處理方法選擇吸附劑和展開劑制備層析用薄板點樣層析分離顯色定性或定量分析分析結(jié)果，給出結(jié)論第5頁,共30頁，2024年2月25日，星期天三、平面色譜法參數(shù)（一）定性參數(shù)1.比移值Rf(retardationfactor;Rf)溶質(zhì)移動的距離與流動相移動距離之比

Rf范圍：

0<Rf<1Rf=0.2~0.8（常用）

Rf=0.3~0.5（最佳）第6頁,共30頁，2024年2月25日，星期天Lds1ds2圖18－1第7頁,共30頁，2024年2月25日，星期天2.相對比移值Ris

討論參考物與被測組分在完全相同條件下展開可以消除系統(tǒng)誤差，大大提高重現(xiàn)性和可靠性；參考物可以是后加入純物質(zhì)，也可是樣品中已知組分相對比移值Ris與組分、參考物性質(zhì)及色譜條件有關(guān)，范圍可以大于或小于1第8頁,共30頁，2024年2月25日，星期天（二）面效參數(shù)1、理論塔板數(shù)N=16(ds/W)2ds:原點到斑點中心的距離

W：組分斑點的縱向?qū)挾?、塔板高度H=ds/N=(Rf

L)/Nds：原點到展開劑前沿的距離

N越大，H越小。與展開劑的速率常數(shù)、組分在展開劑中的擴散系數(shù)、吸附劑的平均粒徑及其粒度分布等因素有關(guān)。第9頁,共30頁，2024年2月25日，星期天（三）容量因子k’與比移值Rf的關(guān)系容量因子：k’=ts/tmts

、tm分別為組分在固定相和展開劑中的保留時間保留值的定義：第10頁,共30頁，2024年2月25日，星期天（四）分離參數(shù)1、分離度(resolution;R)兩相鄰斑點中心的距離與兩斑點平均寬度的比值

R=2(ds2-ds1)/(W1+W2)=2d/(W1+W2)ds1

、ds2:分別為原點至兩半斑點中心的距離，W1、W2斑點的寬度。第11頁,共30頁，2024年2月25日，星期天2.分離數(shù)(separationnumber;SN)定義：相鄰斑點分離度為1.177時，在Rf=0(原點)到Rf=1(溶劑前沿)之間能容納的色譜斑點數(shù)。

W(1/2)0,W(1/2)1為實驗測得的某組分色譜峰的半峰寬對ds作圖外推至在原點處和溶劑前沿處的半峰寬。

一般薄層板的分離數(shù)為7~10，高效薄層板可達10~20。SN是衡量分離容量的重要參數(shù)。第12頁,共30頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)薄層色譜法一、主要類型二、吸附劑與展開劑三、操作方法四、定性與定量分析五、高效薄層色譜法六、薄層掃描法七、應(yīng)用實例ThinLayerchromatographyTLC第13頁,共30頁，2024年2月25日，星期天概述1．TLC定義：將固定相均勻涂布在表面光滑的平板上，形成薄層而進行色譜分離和分析的方法2．操作過程：鋪板→活化

→點樣

→

展開

→定位(定性)/洗脫(定量)3．分離機制：吸附*、分配*、離子交換、空間排阻4．特點；分離能力強、靈敏度高、展開時間較短、顯色方便。5．應(yīng)用：藥物雜質(zhì)檢查、純度測定、定性及定量等。第14頁,共30頁，2024年2月25日，星期天第15頁,共30頁，2024年2月25日，星期天一、主要類型（一）吸附薄層色譜

固定相為吸附劑的薄層色譜。利用吸附劑對不同組分的吸附能力差異而實現(xiàn)分離.經(jīng)過吸附、解吸、再吸附、再解吸……最后混合物得到分離.K大，Rf值小，移動慢；K小，Rf大，移動快。（二）分配薄層色譜

固定相為液體，吸留在載體上的薄層色譜。利用被分離組分在固定相與流動相中的分配系數(shù)不同而被分離。常用的是反相薄層色譜法，固定相是烷基化學鍵合相，展開劑是水及與水相溶的有機溶劑。第16頁,共30頁，2024年2月25日，星期天二、吸附劑與展開劑(一）吸附劑1.硅膠：硅膠H------不含黏合劑硅膠G------含煅石膏（13-15%）硅膠F254---既含煅石膏，又含熒光指示劑2.氧化鋁：可分為中性（pH7.5)、堿性（pH9.0）和酸性（pH4.0）（二）展開劑常用的有：

石油醚<環(huán)己烷<二硫化碳<四氯化碳<三氯乙烷<苯<甲苯<二氯甲烷<乙醚<氯仿<乙酸乙酯<正丁醇<丙酮<乙醇<甲醇<吡啶<酸<水第17頁,共30頁，2024年2月25日，星期天吸附劑與展開劑的選擇展開劑的選擇：根據(jù)被測組分、吸附劑和展開劑本身的極性吸附劑的選擇：根據(jù)被測物極性和吸附劑的吸附能力

被測物極性強——弱極性吸附劑

被測物極性弱——強極性吸附劑圖18－3第18頁,共30頁，2024年2月25日，星期天三、操作方法定性分析——窄條定量分析——10×20cm硅膠G——自含粘和劑硅膠H——不含粘和劑，鋪板時另加入CMC硅膠FH254——含熒光劑，254nm紫外光照發(fā)綠光硅膠FH365——含熒光劑，365nm紫外光照發(fā)光（一）薄層板的制備（二）點樣：用毛細管或微量注射器，幾微升，2~4mm（三）展開：見續(xù)頁（四）顯色方法：日光、紫外光(254、365nm)顯色劑等第19頁,共30頁，2024年2月25日，星期天連續(xù)展開：層析缸，預(yù)飽和，防止邊緣效應(yīng)浸入展開劑深度0.51.0cm，展開至整板3/4距離,標記。1,2樣品3標準品前沿原點

???1.5-2.0cm2.0cm123展開方式第20頁,共30頁，2024年2月25日，星期天展開方式二維展開——在兩個垂直的方向上進行展開。將樣品點在薄層板的一個角上，展開適當距離后，揮干溶劑，再將薄層板以與原展開方向成90

的方向進行展開。原點12第21頁,共30頁，2024年2月25日，星期天四、定性和定量分析定性分析利用保留值測定Rf值測定相對Rf值，即Ris值。利用二維色譜（改變色譜條件，比較Rf值是否一致）sb1b2b2sb1sb1b2點樣第一次展開第二次展開第22頁,共30頁，2024年2月25日，星期天定量分析1.目視比較半定量2.測量斑點面積3.洗脫法4.薄層掃描法第23頁,共30頁，2024年2月25日，星期天五、高效薄層色譜法高效薄層色譜法（highperformancethinlayerchromatography；HPTLC)所用的吸附劑顆粒很小（5μm或10μm），用噴霧法制成高效薄層板。常用的有硅膠、氧化鋁、纖維素和化學鍵合相預(yù)制薄層板。第24頁,共30頁，2024年2月25日，星期天六、薄層掃描法薄層掃描法是用一定強度光束照射薄層上的斑點，用儀器測量照射前后光束強度的變化，從而求得物質(zhì)含量的方法。檢測方法

紫外-可見吸收測定法和熒光測定法測量方法

投射法和反射法掃描方式

單波長和雙波長影響薄層掃描定量的因素

均勻度展開距離隨行標準及點樣次序顯色均勻度及穩(wěn)定性第25頁,共30頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)紙色譜法以紙做載體的色譜法，分離原理屬于液-液分配色譜法，操作與薄層法類似。選紙→點樣

→

展開

→顯色(定性)/洗脫(定量)固定相：紙纖維吸附的水流動相：與水不互溶的有機溶劑（水飽和正丁醇）分離機制：同液-液分配色譜定性參數(shù)：討論：Rf與組分性質(zhì)、流動相及溶解度有關(guān)極性組分→易保留，Rf小（流動相極性↑，Rf↑）非極性組分→易流出，Rf大（流動相極性↑，Rf↓）第26頁,共30頁，2024年2月25日，星期天本章小結(jié)掌握:平面色譜法的基本分離原理及相關(guān)參數(shù)的計算（比移值、相對比移值，分離度）；薄層色譜法的特點；吸附薄層色譜中吸附劑和展開劑的選擇原則。熟悉:薄層色譜法的主要操作步驟。了解:薄層掃描法的應(yīng)用及技術(shù)；