醫(yī)學細胞生物學-第二章-細胞生物學研究方法

1、第二章 細胞生物學的研究方法第一節(jié) 顯微鏡技術一、光學顯微鏡技術二、電子顯微鏡技術表一、幾種介質的折射率表二、不同光線的波長(二)熒光顯微鏡:熒光：特定物質可以在紫外線激發(fā)后，發(fā)射出更長波長的可見光，即熒光。暗背景，強反差，彩色圖像（熒光染料）熒光分子：在激發(fā)后可發(fā)射熒光的物質即熒光分子 。 （由于熒光分子可以使被檢樣品呈現(xiàn)不同的染色，因此可做熒光染料用,熒光分子也可以稱作熒光染料。）熒光顯微鏡的應用定性、定位和定量的研究組織內的熒光標記物質。對活細胞內分子的動態(tài)變化進行實時觀察。 活細胞的微細結構和變化、分裂和運動等。相差顯微鏡觀察培養(yǎng)中的HeLa細胞(四)暗視野顯微鏡通過散射光成像應用：分

2、辨率不高。用于觀察未經染色、無色透明的物體的輪廓和運動以及活細胞的質膜、纖毛、細胞核等結構。原理：散射光成像。聚光鏡中央有擋光片，照明光線不直接進人物鏡，只允許被標本散射的光線進入物鏡，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。(五)顯微電影攝影技術記錄細胞或細胞器的運動過程 原理：用顯微電影攝影術或電視錄像以一定時間間隔拍攝。應用：準確記錄細胞或細胞器的運動過程和速度。 （六）共聚焦激光掃描顯微境 Laser confocal scanning microscope, LCSM特點：高清晰可形成被檢物體的三維圖像結構：普通熒光顯微鏡（a）與激光共聚焦顯微鏡（b）的成像比較 二、電子顯微技術 以

3、電子束作為光源， 波長短，分辨率高電子顯微鏡分辨率 理論值：0.002nm 實際值：0.1nm 電鏡下觀察到的結構稱為超微結構或亞顯微結構 (一)透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM ）光學顯微鏡與透射電子顯微鏡的比較原理：通過電子束穿透標本后成像。 應用：用來觀察細胞的超微結構。透射電鏡及其圖像（二）掃描電子顯微鏡SEM原理：通過電子束照射在標本表面上散射的二次 電子成像應用：用來觀察標本的表面結構。分辨率：較低，為3-10nm。掃描電鏡及其圖像 瘧疾破壞的兩個紅細胞顯微鏡分辨率光源透鏡真空成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可

4、見光（400-700nm） 紫外光（200nm)電子束（0.01-0.9nm）玻璃透鏡電磁透鏡不要求真空要求真空利用樣品對光的吸收形成明暗反差和顏色變化利用樣品對電子的散射和透射形成明暗反差（三）電鏡與光鏡的比較電鏡與光鏡區(qū)別主要在于： （1）光源不同 光鏡為可見光或紫外線,電鏡為電子束 （2）透鏡不同 光鏡為玻璃；電鏡為電磁透鏡 （3）電鏡要求真空 （4）電鏡分辨力高(具體） (5) 成像原理不同（具體） 第二節(jié) 細胞的分離與培養(yǎng)細胞分離的第一步是要將細胞從組織中分離出來，制備出單細胞懸液。細胞分離操作的原則： 等滲 低溫 無菌操作 根據(jù)不同細胞的特征采用不同的細胞分離方法。 細胞分離方法離

5、心方法 流式細胞術 免疫磁珠法 激光捕獲顯微切割技術 (一)離心方法 利用細胞的密度特性可有效分離不同的細胞。如血漿白細胞和紅細胞的分離。 二、細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)(cell culture)：從機體中取出組織或細胞，模擬體內的生理環(huán)境，使之能夠繼續(xù)生存、生長和增殖的一種方法。1.條件 營養(yǎng)條件：培養(yǎng)基：RPMI-1640、DMEM。 血清。 5%CO2 無菌環(huán)境 2.細胞培養(yǎng)的主要方式是原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)原代培養(yǎng)（primary culture）：直接從體內獲取的組織和細胞進行的首次培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)（secondary culture）：原代培養(yǎng)的細胞經過增殖達到一定密度后，將細胞分散，從一個培養(yǎng)

6、器以一定比例移到另一個或幾個容器中的擴大培養(yǎng)。3.來源于體內的細胞可在體外建系（細胞系）細胞系（cell line）：在培養(yǎng)的細胞中產生“不死”的 變異細胞，這種細胞可以無限繁殖、傳代。細胞系的來源取材于腫瘤組織的原代培養(yǎng)細胞（Hela細胞系）培養(yǎng)過程中發(fā)生轉化的正常細胞細胞株（cell strain）：用細胞克隆化的方法進一步改 善細胞系的均一性，即分離出單個細胞使之增殖 形成的細胞群。 單克隆抗體技術正常淋巴細胞（如小鼠脾細胞）具有分泌抗體的能力，但不能長期培養(yǎng)，瘤細胞（如骨髓瘤）可以在體外長期培養(yǎng)，但不分泌抗體。于是英國人Kohler和Milstein 1975將兩種細胞雜交而創(chuàng)立了單克隆抗體技術，獲1984年諾貝爾獎。第三節(jié) 細胞組分的分離 一、細胞裂解在細胞組分分離前，首先破碎細胞，制備細胞裂解液方法： 低滲透壓； 超聲振蕩； 強制通過微孔； 機械破碎及研磨； 反復凍融 沉降順序：細胞核線粒體（混有少量溶酶體與過氧化物酶體）微粒體（主要是內質網，少量高爾基體）核糖體。二、細胞器及細胞組分的分級離心 (一)差速離心（differential centrifugation）方法：從低速到高速逐級沉降。分離對象：體積、質量差別較大的顆粒 。勻漿離心1 000g 20分鐘細胞核線粒體等離心15 000g 120分鐘微粒體離心0