肝癌患者血漿RASSF1A異常甲基化檢測(cè)的意義

1、肝癌患者血漿RASSF1A異常甲基化檢測(cè)的意義【關(guān)鍵詞】肝腫瘤；RASSF1A基因；甲基化；血漿DiagnstivaluefdetetinfaberrantlyethylatedRASSF1Ainplasafpatientsithhepatellulararina【Abstrat】AI:TstudytheaberrantethylatinstatusfRasassiatindainfaily1A(RASSF1A)intheplasafpatientsithhepatellulararina(H)byethylatinspeifiPR(SP),andtexplrethevaluefirulart

2、urrelatedDNAindiagnsisfH.ETHDS:FreeDNAasextratedfrperipheralbldplasaf41Hpatients.Afterdifiedithsdiubisulfiteandpurified,theDNAasaplifiedusingpriersspeififrethylatedandunethylatedsequenesfRASSF1A.RESULTS:AberrantRASSF1Aethylatinasfundin41.5%(17f41)fplasaDNAinHpatients.NethylatedRASSF1Aasdetetedin10as

3、esfntrlplasasaples.linialdatainludingage,sex,linialstages,levelsfAFP,hepatitisstatus,nuberftur,invasin,etastasisandirrhsisshednrrelatinithaberrantethylatinfRASSF1AP0.05.AberrantlyethylatedRASSF1Aasalsdetetedin7f10plasasaplesfAFPnegativeases.NLUSIN:DetetinfaberrantethylatinfRASSF1Ainbldisfeasibletear

4、lydetetandsreenH,andisusefultestiatetheprgnsis.【Keyrds】liverneplass;Rasassiatindainfaily1A;ethylatin;plasa【摘要】目的：采用甲基化特異性PR法SP檢測(cè)41例原發(fā)性肝癌(H)患者血漿中游離Ras相關(guān)構(gòu)造域家族蛋白1A(RASSF1A)異常高甲基化情況，討論血漿RASSF1A檢測(cè)在肝癌診斷中的意義.方法：搜集患者血漿，提取游離DNA，亞硫酸氫鈉修飾并純化，以甲基化特異性引物及非甲基化引物進(jìn)展PR.結(jié)果：41例患者血漿中有17例RASSF1A呈現(xiàn)異常高甲基化41.5，對(duì)照血漿均為陰性.患者一般情

5、況、臨床病理資料等與血漿中RASSF1A異常高甲基化檢測(cè)結(jié)果無關(guān)P0.05；在10例AFP陰性的H患者中，有7例結(jié)果為陽性.結(jié)論：血漿RASSF1A甲基化檢測(cè)對(duì)肝癌的早期診斷及挑選有重要意義，并有助于判斷預(yù)后.【關(guān)鍵詞】肝腫瘤；RASSF1A基因；甲基化；血漿0引言發(fā)現(xiàn)相對(duì)特異性的腫瘤標(biāo)志物，尤其是可以起到早期挑選作用的標(biāo)志物，對(duì)進(jìn)步包括H在內(nèi)的腫瘤診斷及治療效果具有重要意義.肝癌組織中RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)pG島異常高甲基化可達(dá)100的檢測(cè)結(jié)果1-2.我們?cè)谇捌谘芯扛伟┙M織標(biāo)本中RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化的根底上，觀察患者血漿中RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化情況，以證實(shí)其

6、在肝癌診斷中的作用.1對(duì)象和方法1.1對(duì)象41例肝癌血漿全部搜集自第四軍醫(yī)大學(xué)附屬西京醫(yī)院202210/202203手術(shù)治療的患者，血漿于所有治療未介入時(shí)采集，全部配對(duì)標(biāo)本均經(jīng)術(shù)后組織學(xué)證實(shí)為原發(fā)性肝細(xì)胞癌，其中男36例，女5例，全組平均年齡50.2歲.10例安康對(duì)照血漿來自安康獻(xiàn)血者.亞硫酸氫鈉購(gòu)自Siga公司，DNA純化試劑盒購(gòu)自Prega公司.引物由上海華大基因公司合成3，序列如表1所示.1.2方法1.2.1分組標(biāo)準(zhǔn)按照EdndsnStEiner四級(jí)分法將標(biāo)本分為高/中分化組及低分化組；腫瘤分期按照國(guó)際抗癌聯(lián)盟TN分期標(biāo)準(zhǔn)分為/期、/期二組，HBV感染斷定參照臨床標(biāo)準(zhǔn)；血漿AFP檢測(cè)結(jié)果

7、按400ng/L，400ng/L分二組；病灶情況、血管累及、轉(zhuǎn)移及肝硬化按照術(shù)中記錄判斷.表1引物序列及PR反響條件略1.2.2DNA提取血漿DNA提取按照QIAapDNABldiniKit(QIAGEN)說明書進(jìn)展，每份樣本采用800L血漿，提取產(chǎn)物分光光度計(jì)定量后-20保存.1.2.3甲基化特異性PR(SP)檢測(cè)取5g血漿DNA，97變性6in，參加亞硫酸氫鈉3.5l/L及對(duì)苯二酚1l/L55處理16h，結(jié)果參照izardDNAleanupsystePrega說明純化，以NaH0.3l/L室溫處理10in，冰冷乙醇沉淀，重溶于去離子水，以亞硫酸氫鈉處理的基因組DNA為底物，參加上述引物對(duì)，

8、反響條件為：95預(yù)變性15in,繼以9550s,601in，721in共35個(gè)循環(huán),最后于72延伸10in.擴(kuò)增產(chǎn)物以30g/L瓊脂糖凝膠電泳，F(xiàn)R200A型紫外凝膠成像儀觀察結(jié)果并拍照.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS10.0軟件包進(jìn)展2檢驗(yàn)，P0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.2結(jié)果2.1血漿RASSF1A基因異常甲基化檢測(cè)采用SP法對(duì)41例患者血漿進(jìn)展RASSF1A基因呈現(xiàn)異常高甲基化檢測(cè)，結(jié)果17例為陽性，占總體41.5，對(duì)照10份來自安康對(duì)照的血漿中無陽性結(jié)果圖1，說明相對(duì)于正常對(duì)照，肝癌患者血漿中異常高甲基化的游離RASSF1A基因與肝癌自身有關(guān).進(jìn)一步將配對(duì)標(biāo)本的SP檢測(cè)結(jié)果已另文發(fā)表比照后

9、發(fā)現(xiàn)：血漿SP檢測(cè)結(jié)果陽性者全部為標(biāo)本SP陽性患者，符合率100，血漿檢測(cè)結(jié)果與其相應(yīng)的腫瘤組織二者關(guān)系親密，說明血漿RASSF1A異常甲基化能較好的反響其腫瘤來源特異性.2.2統(tǒng)計(jì)分析按照表2中臨床資料及血漿SP檢測(cè)結(jié)果，進(jìn)展統(tǒng)計(jì)學(xué)處理發(fā)現(xiàn)，血漿RASSF1A基因異常甲基化與患者年齡、性別，血清AFP、HBV感染，以及腫瘤惡性程度、分期、病灶的大孝數(shù)目、進(jìn)犯及轉(zhuǎn)移等均無關(guān)P0.05，然而在AFP陰性400ng/L的10例患者中，有7例血漿SP結(jié)果為陽性表3.41例血漿標(biāo)本中，AFP陽性率75.631/41,敏感性優(yōu)于RASSF1A，但分組結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在AFP檢測(cè)陰性的血漿標(biāo)本中RASSF1A異

10、常甲基化陽性率達(dá)707/10,提示血液循環(huán)DNA異常甲基化具有診斷學(xué)價(jià)值，如結(jié)合AFP陽性及RASSF1A異常甲基化陽性結(jié)果那么可使診斷敏感性上升至92.738/41.表2肝癌患者血漿游離RASSF1A異常甲基化檢測(cè)結(jié)果分析略3討論研究非侵入性腫瘤檢測(cè)及挑選方法的腫瘤特異性標(biāo)志物，是臨床腫瘤研究的重點(diǎn)，在此的過程中，有實(shí)驗(yàn)注意到起源于腫瘤的核酸可以在患者血液循環(huán)中檢測(cè)到，并因此循環(huán)核酸檢測(cè)有望成為一種早期檢查腫瘤的方法3.然而基因突變、雜合性喪失等，在腫瘤演進(jìn)中存在隨機(jī)的、個(gè)體化的特點(diǎn)，尚難以在其中找到共性的，適用于所有腫瘤或同類腫瘤的標(biāo)志物，有其局限性的一面；相對(duì)而言，異常甲基化在腫瘤中屬于

11、普遍現(xiàn)象，并可以在患者血液循環(huán)DNA中得到表達(dá).比擬RNA及蛋白類而言，DNA具有更大的穩(wěn)定性，因此腫瘤DNA異常甲基化現(xiàn)象為探究廣泛適用的腫瘤生物學(xué)標(biāo)志提供了契機(jī)4-5.RASSF1A基因在惡性腫瘤中有頻繁的甲基化，被廣泛應(yīng)用于腫瘤表遺傳學(xué)研究，研究結(jié)果顯示：腫瘤患者體液中亦存在RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化，并與相應(yīng)腫瘤組織檢測(cè)結(jié)果明顯相關(guān).如在50小細(xì)胞型肺癌患者痰液中、80以上的腎癌患者尿液中、23的乳腺癌患者血漿中、100的卵巢癌患者腹水中等，均可檢測(cè)到RASSF1A基因異常甲基化.體液檢測(cè)RASSF1A異常甲基化有希望成為腫瘤挑選的診斷方法6.本組實(shí)驗(yàn)在41例原發(fā)性肝癌患者血

12、漿進(jìn)展RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)pG島異常甲基化檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)其陽性率為41.5，而且在AFP陰性檢測(cè)的10例患者中有7例為陽性，通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)H患者外周血中腫瘤相關(guān)性游離DNA的存在，并證實(shí)通過SP法檢測(cè)血漿中DNA具有進(jìn)步H檢出率的重要作用.實(shí)驗(yàn)分組中各臨床病理資料均未顯示明確的相關(guān)性，那么說明H患者血漿中RASSF1A測(cè)定有早期預(yù)示腫瘤的作用，因早期診斷并采取進(jìn)一步的診斷和治療，直接影響到腫瘤的預(yù)后7-8，所以此項(xiàng)檢測(cè)具有深化研究的價(jià)值，另外，由于此項(xiàng)檢測(cè)的腫瘤特異性，對(duì)手術(shù)后的患者進(jìn)展血漿檢測(cè)可能提示腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)，因此有助于肝癌預(yù)后判斷.總之，實(shí)驗(yàn)初步完成H血循環(huán)中RASSF1A異常甲基化的

13、檢測(cè)，而鑒于此現(xiàn)象在腫瘤中的廣泛性，其方法及結(jié)論同樣適用于其他惡性腫瘤，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)打好根底，在肝癌的診治及預(yù)前方面具有重要意義9.【參考文獻(xiàn)】1PfEiferGP,YnJH,LiuL,etal.ethylatinftheRASSF1AgeneinhuananersJ.Bilhe,2002,383(6):907-914.2安錦霞,楊永秀,黎衛(wèi)平.RASSF1A基因在宮頸癌組織中的表達(dá)及意義J.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2022,26(7):657-660.3FujiaraK,FujitN,Tabata,etal.Identifiatinfepigenetiaberrantprterethylatinin

14、seruDNAisusefulfrearlydetetinflunganerJ.linanerRes,2022,11(3):1219-1225.4RairezJL,Tarn,Balana,etal.SeruDNAasatlfranerpatientanageentJ.RzAkadedBialyst,2022,48:34-41.5Ibanezd,I,Battagli,Esteller,etal.TurellspeifiBRA1andRASSF1Ahyperethylatininseru,plasa,andperitnealfluidfrvariananerpatientsJ.anerRes,20

15、22,64(18):6476-6481.6aruyaaR,TykaS,TykaK,etal.AberrantprterethylatinprfilefprstateanersanditsrelatinshiptlinipathlgialfeaturesJ.linanerRes,2002,8(2):514-519.7Hque,BeguS,Tpalglu,etal.Quantitativedetetinfprterhyperethylatinfultiplegenesinthetur,urine,andseruDNAfpatientsithrenalanerJ.anerRes,2022,64(15):5511-5517.8KangGH,LeeS,LeeHJ,HangKS.Aberra