通脈口服液對氣虛血淤證單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎小管間質(zhì)病變的影響

1、通脈口服液對氣虛血淤證單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎小管間質(zhì)病變的影響【摘要】目的討論益氣活血復(fù)方通脈口服液對氣虛血淤證腎小管間質(zhì)病變的干預(yù)作用。方法istar大鼠60只，隨機(jī)分為空白組，模型組，洛汀新治療組，通脈大、中、小劑量治療組。采用單側(cè)輸尿管梗阻(UU)+亞急性衰老+游泳力竭致氣虛血淤證腎小管間質(zhì)病變病證結(jié)合模型，予相應(yīng)藥物治療4周，觀測體質(zhì)量等一般狀況，進(jìn)展中醫(yī)氣虛證、血淤證評(píng)分，化學(xué)法檢測血清BUN、Sr含量，ELISA法檢測血組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)、纖溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)含量，對病變腎組織進(jìn)展間質(zhì)細(xì)胞浸潤情況評(píng)分(IS)及腎小管間質(zhì)慢性病變評(píng)分(AFS)。結(jié)果模型

2、大鼠體質(zhì)量顯著下降，氣虛證、血淤證積分顯著增高，通脈大、中劑量組大鼠體質(zhì)量顯著改善(P0.05)，通脈各劑量組大鼠氣虛證、血淤證積分顯著降低;模型組大鼠PAI-1及t-PA/PAI-1顯著升高(P0.01)，通脈大劑量組PAI-1顯著下降(P0.01)，通脈中劑量及洛汀新組PAI-1明顯下降(P0.05);通脈大劑量組梗阻腎IS、AFS顯著降低(P0.05)，降低前者與絡(luò)汀新組相當(dāng)，降低后者那么優(yōu)于絡(luò)汀新(P0.05)。結(jié)論通脈口服液大、中劑量可改善氣虛血淤證腎小管間質(zhì)病變大鼠體質(zhì)量、氣虛證、血淤證、血PAI-1升高等整體表現(xiàn)，大劑量通脈可明顯減輕腎小管間質(zhì)病理改變，且在對抗腎小管間質(zhì)慢性病變

3、方面優(yōu)于洛汀新。【關(guān)鍵詞】通脈口服液;氣虛血淤證;腎小管間質(zhì)病變慢性腎臟病(KD)是世界范圍的醫(yī)療和公共衛(wèi)生問題。長期以來，對其研究主要集中于腎小球病變，腎小管間質(zhì)病變(Tubulinterstitiallesins，TIL)未得到足夠重視。隨著人類腎臟疾病病理改變和腎病變動(dòng)物模型研究的深化，提示KD的開展和預(yù)后不僅與腎小球病變有關(guān)，更取決于TIL的有無及程度的輕重1。以楊霓芝教授為代表的學(xué)科組研究說明氣虛血淤證為KD最常見證侯之一，通過十余年的臨床與實(shí)驗(yàn)研究，證明具有益氣活血成效的中藥復(fù)方通脈口服液(T)可通過多種機(jī)制改善KD預(yù)后2。因此進(jìn)一步開展其對氣虛血淤證UU大鼠TIL干預(yù)作用的實(shí)驗(yàn)研

4、究，完善其機(jī)制討論。1材料與儀器1.2藥物與試劑通脈口服液(由黃芪、三七等制成)由廣東省中醫(yī)院制劑中心提供(批號(hào)：06080709，規(guī)格：10l10支)。對照藥物：洛汀新(苯那普利)，北京諾華制藥消費(fèi)(批號(hào)：H20220514，規(guī)格：10g14片)。t-PA、PAI-1檢測試劑盒：美國USNlifeSieneandtehnlgypany消費(fèi)，廣州威佳科技公司提供。1.3儀器7170A全自動(dòng)生化分析儀：日本日立;ElipseE800型光學(xué)顯微鏡：日本Nikn公司;DG5033A酶標(biāo)儀：南京華東電子公司。2方法2.1分組與造模方法適應(yīng)性飼養(yǎng)7d后將大鼠隨機(jī)分為2組，空白組(A)10只，造模組50只

5、，后者復(fù)制氣虛血淤證UU模型。造模方法：衰老：采用D-半乳糖亞急性衰老方法3，第748天注射D-半乳糖(150g/kgd);疲勞：采用游泳力竭方法4，第734天每日9：00開場分批置入直徑50，高100水桶內(nèi)，桶內(nèi)水深45，水溫與室溫均保持為(150.5)，以木棒拔打強(qiáng)迫其不斷游泳直到力竭(標(biāo)準(zhǔn)為動(dòng)物下沉后10s不露出水面);UU:參考文獻(xiàn)5方法，第37天5%水合氯醛麻醉成功后，常規(guī)消毒，腹正中線切口，游離腎臟及輸尿管，將左側(cè)輸尿管用組織鉗托起中段部位，止血鉗夾住，在兩端用4-0絲線結(jié)扎(近腎盂段兩次結(jié)扎)后剪斷，關(guān)腹縫合。術(shù)后存活大鼠隨機(jī)分為模型組(B)，洛汀新治療組(),T大、中、小劑量治

6、療組(D、E、F)。A組大鼠第748天等量生理鹽水皮下注射，第34天行假手術(shù)處理，手術(shù)方式同UU組，但在進(jìn)腹腔后別離左輸尿管后不結(jié)扎。2.2給藥方法第3460天、B組生理鹽水12l/kgd灌胃，組洛汀新2g/Kgd灌胃，D組大鼠T(12l/kgd)灌胃，E組8l/kgd(生理鹽水稀釋至12l/kgd，下同)灌胃，F(xiàn)組4l/kgd灌胃。2.3取材及處理方法第60天所有大鼠5%水合氯醛麻醉后，腹主動(dòng)脈取全血6l，低溫離心別離血清(4，3000r/in，10in)，-20保存。游離左腎，扇形切取局部腎組織，10%中性甲醛溶液固定。2.4檢測指標(biāo)與方法2.4.1治療前后中醫(yī)證候積分評(píng)定參考文獻(xiàn)6方法分

7、別于第33，57天對各組大鼠進(jìn)展證候積分評(píng)定。氣虛證評(píng)分：A：精神正常(0)、精神萎頓(3)、倦怠嗜睡(5)、對抗性、攻擊性完全消失(7);B：毛發(fā)正常(0)、毛發(fā)枯黃無光澤(3)、毛發(fā)結(jié)穗打卷(5)、毛發(fā)稀疏脫落(7);：大便正常(0)、輕度稀便(3)、中度稀便(5)、重度稀便或黃綠褐色黏臭便(7)。大鼠血淤證評(píng)分：A：舌質(zhì)紅潤(0)、舌質(zhì)暗淡(3)、舌質(zhì)絳紫(5);B：眼球淡紅(0)轉(zhuǎn)為深紅(3)、轉(zhuǎn)為暗紅(5)，：尾尖至根部無淤點(diǎn)淤斑(0)、出現(xiàn)輕度淤血點(diǎn)(3)、出現(xiàn)中度以上淤斑(5)。2.4.2血清指標(biāo)的測定血肌酐檢測采用苦味酸法，血尿素氮檢測用尿素酶法，ELISA法檢測血清內(nèi)t-PA

8、、PAI-1含量。2.4.3梗阻腎組織病理學(xué)檢查梗阻腎進(jìn)展大體觀察后，固定，包埋，制成4切片，HE及assn染色，光鏡下觀察TIL。參考文獻(xiàn)方法7進(jìn)展腎間質(zhì)細(xì)胞浸潤情況評(píng)分(ellinfiltratinsre，IS)：間質(zhì)細(xì)胞浸潤：無(0)、局灶細(xì)胞浸潤(1)、多灶細(xì)胞浸潤(2)、彌漫細(xì)胞浸潤(3)。腎間質(zhì)慢性病變(包括腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化)評(píng)分(Atrp-hyandfibrsissre，AFS)：間質(zhì)纖維化：無(0)、視野區(qū)域25%(1分)、視野25%50%(2)、視野50%(3);腎小管萎縮：無(0)、視野區(qū)域25%(1)、視野25%50%(2)、視野50%(3)。由兩個(gè)觀察者對每個(gè)腎組

9、織樣本200倍光鏡下隨機(jī)取互不重疊的10個(gè)視野進(jìn)展盲法評(píng)分，取兩觀察者評(píng)分的平均值,代表各樣品的TIL程度。2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包建立數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)采用s表示，采用方差分析和q檢驗(yàn)進(jìn)展統(tǒng)計(jì)分析。3結(jié)果3.1各組大鼠一般狀況A組及D組各有1只大鼠在UU手術(shù)過程中死亡，原因?yàn)槁樽硪馔?。B組死亡1只，原因?yàn)橛斡玖邔?shí)驗(yàn)過程中溺死。實(shí)驗(yàn)完畢時(shí)，A組大鼠精神狀況良好，動(dòng)作自如，反響靈敏，毛皮有光澤;B組、F組大鼠明顯消瘦，大便溏，精神萎靡，反映遲鈍，毛豎，無光澤，動(dòng)作緩慢。通脈各治療組一般狀況較模型組有不同程度改善。實(shí)驗(yàn)完畢時(shí)，各造模組大鼠體重明顯下降(P0.01)，與B組相比，通

10、脈大、中劑量組體質(zhì)量明顯增加(P0.05)。見表1。表1各組大鼠體質(zhì)量變化與空白組比擬，*P0.01;與模型組比擬，P0.053.2各組大鼠治療前后中醫(yī)證候積分治療前造模各組與A組相比氣虛證、血淤證積分值明顯升高(P0.01);治療后D、E、F組氣虛證、血淤證積分值較B組、組明顯降低(P0.05或P0.01)，D、E、F組之間無顯著性差異。見表2。表2治療前、后各組氣虛證、淤血證積分比擬與空白組比擬，*P0.01;與模型組比擬，P0.05、P0.013.3各組大鼠血肌酐、尿素氮、t-PA、PAI-1變化治療完畢時(shí)各造模組BUN、Sr與空白組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與A組相比，B組PAI-1及顯著升高(P

11、0.01);各治療組與B組比擬，D組PAI-1顯著下降(P0.01)，、E組PAI-1明顯下降(P0.05)。見表3。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.3.4各組大鼠腎臟組織病理學(xué)造模大鼠左側(cè)腎臟明顯增大成球形，色澤紫暗。A組HE染色可見：正常腎小球和腎小管間質(zhì)，腎小管由單層立方上皮組成，胞體較大，細(xì)胞核圓形，位于細(xì)胞近基底部。assn染色可見腎小球、腎小管基底膜明晰可見。模型組大鼠HE、assn染色可見：大局部腎小管上皮細(xì)胞顆粒、空泡變性，局部腎小管上皮細(xì)胞壞死脫落，呈裸基底膜，管腔擴(kuò)展，局部管腔內(nèi)可見脫落壞死組織及細(xì)胞形成顆粒管型及細(xì)胞管型，可見灶性腎小管萎縮;間質(zhì)區(qū)明顯增寬，炎性細(xì)胞浸潤，纖維組織增

12、生，呈條索狀、片狀纖維化;腎小球除局部有腎小囊輕-中度擴(kuò)張外，無其他明顯病變(圖14)。通脈各劑量組和西藥組也有以上類似的改變，但病變與模型組相比有不同程度的減輕。表3治療后各組大鼠血清t-PA、PAI-1含量3.5各組大鼠腎小管間質(zhì)IS及AFS積分情況與A組相比，各造模組IS均明顯增高(P0.001);與B組比擬，D與組下降明顯(P0.01)，兩者之間無顯著差異(P0.05)。與空白組相比，各造模組大鼠AFS均明顯增高(P0.001);與B組比擬，組AFS降低明顯(P0.05)，D組降低顯著(P0.001)，且較組明顯下降(P0.05)。見表4。表4治療后各組大鼠腎小管間質(zhì)IS、AFS與空白

13、組比擬，*P0.001;與模型組比擬，P0.001，P0.05;與洛汀新組比擬，P0.05，P0.054討論TIL最終可導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化(RIF)，后者幾乎是所有KD開展到后期的病理學(xué)特征。通過早期防治TIL以阻止RIF的進(jìn)展進(jìn)而改善KD的預(yù)后具有重大意義。研究說明,血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑等藥物具有一定保護(hù)作用8，中醫(yī)藥防治TIL的研究業(yè)已獲得了不少有意義的研究結(jié)果。我們前期應(yīng)用具有益氣活血成效的中藥復(fù)方制劑T用于治療具有氣虛血淤證的KD,療效明確。因此進(jìn)一步設(shè)計(jì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)討論T的療效與干預(yù)TIL的相關(guān)性，并設(shè)大、中、小劑量組及AEi類代表藥物洛汀新作為對照，以期初步明確其量效關(guān)系及作用特點(diǎn)。當(dāng)

14、前中醫(yī)藥干預(yù)TIL的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，大都直接采用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)模型，其中單側(cè)輸尿管梗阻(UU)應(yīng)用最為廣泛。但中醫(yī)藥現(xiàn)代化及中西醫(yī)結(jié)合事業(yè)迫切需要真正具有中醫(yī)證候特點(diǎn)的病證結(jié)合模型9。楊霓芝教授在腎臟病研究領(lǐng)域率先采用抗Thy-1+游泳疲勞試驗(yàn)造成的大鼠慢性腎炎“氣虛血淤證病證結(jié)合模型10。在此根底上，本實(shí)驗(yàn)TIL動(dòng)物模型，采用了UU結(jié)合亞急性衰老及游泳疲勞的復(fù)合因素造模方法。結(jié)果顯示：梗阻側(cè)腎組織發(fā)生典型TIL，說明“脖的復(fù)制是成功的。造模后在宏觀“證方面，模型組較空白組大鼠體重下降，并出現(xiàn)了精神萎頓、毛發(fā)枯黃無光澤、稀便、舌質(zhì)暗淡、尾尖至根部出現(xiàn)淤血點(diǎn)、梗阻側(cè)腎色澤紫暗等“氣虛血淤證表現(xiàn);在微觀“

15、證方面，我們監(jiān)測了纖溶酶原激活劑/纖溶酶原激活劑下抑制物(PAs/PAIs)這對指標(biāo)，其不僅是維持血液中凝血與纖溶平衡的關(guān)鍵酶系，同時(shí)為調(diào)節(jié)腎臟細(xì)胞外基質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶系之一11，PA程度下降、PAI程度上升或其比值下降與淤血證有一定相關(guān)性11，12。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與空白組相比，模型組PAI-1顯著升高，在一定程度上提示該模型具有微觀的血淤證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，應(yīng)用益氣活血中藥T灌胃后大鼠體質(zhì)量、“氣虛證、“血淤證血清PAI-1升高得到不同程度改善，洛汀新改善不顯著，提示益氣活血中藥T的多靶點(diǎn)、多途徑的藥理作用可能有助于改善衰老、疲勞、輸尿管梗阻對大鼠造成的“氣虛血淤綜合病理改變，這為臨床上應(yīng)用T等中藥制劑治療KD,在改善患者整體表現(xiàn)方面優(yōu)于洛汀新等西藥提供了實(shí)驗(yàn)根據(jù)。同時(shí)以方測證，本實(shí)驗(yàn)在氣虛血淤證的復(fù)制是比擬成功的。病理學(xué)是研究腎小管間質(zhì)病變的最直觀、最有說服力的指標(biāo)，本研究對實(shí)驗(yàn)大鼠梗阻腎病理切片行HE、assn染色，通過對大鼠腎小管間質(zhì)慢性病變和腎間質(zhì)細(xì)胞浸潤情況進(jìn)展盲法觀察評(píng)分。結(jié)果