信號通路和腫瘤發(fā)生II

1、關(guān)于信號通路與腫瘤發(fā)生II第1頁，共48頁，2022年，5月20日，8點39分，星期四TNF NF- B信號1975年，E. A. Carswell和L. J. Old等人發(fā)現(xiàn)已接種卡介苗的小鼠注射脂多糖后，小鼠血清中產(chǎn)生了一種可引起動物腫瘤組織出血壞死的物質(zhì)，該物質(zhì)對體外培養(yǎng)的多種腫瘤細(xì)胞株都具有細(xì)胞殺傷作用，于是他們將這種物質(zhì)命名為腫瘤壞死因子（tumour necrosis factor, TNF）。TNF是迄今發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤效果最強的細(xì)胞因子。第2頁，共48頁，2022年，5月20日，8點39分，星期四TNF的發(fā)現(xiàn)1968, Dr. Gale A Granger from the Uni

2、versity of California, Irvine, reported a cytotoxic factor produced by lymphocytes and named it lymphotoxin (LT).1968，Dr. Nancy H. Ruddle from Yale University, who reported the same activity in a series of back-to-back articles published in the same month and year.1975 Dr. Lloyd J. Old from Memorial

3、 Sloan-Kettering Cancer Center, New York, reported another cytotoxic factor produced by macrophages, and named it tumor necrosis factor (TNF).Both factors were described based on their ability to kill mouse fibrosarcoma L-929 cells.第3頁，共48頁，2022年，5月20日，8點39分，星期四TNF的命名1984 When the cDNAs encoding LT

4、and TNF were cloned , they were revealed to be similar.The binding of TNF to its receptor and its displacement by LT confirmed the functional homology between the two factors. The sequential and functional homology of TNF and LT led to the renaming of TNF as TNF and LT as TNF. 第4頁，共48頁，2022年，5月20日，8

5、點39分，星期四TNF alpha Model 第5頁，共48頁，2022年，5月20日，8點39分，星期四TNF是一種糖蛋白，它以兩種形式存在：TNF-和TNF-。TNF-由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，它可引起腫瘤組織出血壞死，而脂多糖Lipopolysaccharides, LPS）是較強的刺激劑。第6頁，共48頁，2022年，5月20日，8點39分，星期四單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)單核細(xì)胞來源粒-單系祖細(xì)胞，經(jīng)原單核細(xì)胞、幼稚單細(xì)胞階段分化成單核細(xì)胞，然后由骨髓釋放入血，在血中34天后進入組織和漿膜腔轉(zhuǎn)變成巨噬細(xì)胞。二者是相同但在部位不同名稱不一樣，共同構(gòu)成單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)。 第7頁，共48頁，202

6、2年，5月20日，8點39分，星期四單核-巨噬細(xì)胞家族單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)（mononuclear phagocyte system） 包括血液中的單核細(xì)胞和組織中固定或游走的巨噬細(xì)胞，在功能上都具有吞噬作用。 單核-巨噬細(xì)胞均起源于骨髓干細(xì)胞，在骨髓中經(jīng)前單核細(xì)胞分化發(fā)育為單核細(xì)胞，進入血液，隨血流到全身各種組織，進入組織中隨即發(fā)生形態(tài)變化，如肝臟中的枯否氏細(xì)胞(kupffer cell)，肺臟中的塵細(xì)胞（dust cells)，結(jié)締組織中的組織細(xì)胞（histocytes)，神經(jīng)組織中的小膠質(zhì)細(xì)胞（microglialcells)，脾和淋巴結(jié)中的固定和游走巨噬細(xì)胞等。 第8頁，共48頁，202

7、2年，5月20日，8點39分，星期四TNF-是一種淋巴因子，又稱淋巴毒素（lymphotoxin, LT）?？乖蚪z裂原均可刺激T淋巴細(xì)胞分泌TNF-，具有腫瘤殺傷及免疫調(diào)節(jié)功能。第9頁，共48頁，2022年，5月20日，8點39分，星期四T淋巴細(xì)胞定義：表達(dá)T細(xì)胞受體和CD3復(fù)合物的淋巴細(xì)胞。來源于胚肝或骨髓的原T細(xì)胞，在胸腺微環(huán)境中分化、發(fā)育，成熟后遷移至外周血，繼而定居于外周淋巴組織，可介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，并輔助機體針對T細(xì)胞依賴性抗原產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答。T淋巴細(xì)胞來源于骨髓的多能干細(xì)胞（胚胎期則來源于卵黃囊和肝）。在人體胚胎期和初生期，骨髓中的一部分多能干細(xì)胞或前T細(xì)胞遷移到胸腺內(nèi)，在胸腺

8、激素的誘導(dǎo)下分化成熟，成為具有免疫活性的T細(xì)胞。 第10頁，共48頁，2022年，5月20日，8點39分，星期四T細(xì)胞分類（根據(jù)不同的分類方法）可分為不同亞群（一）初始、效應(yīng)、記憶T細(xì)胞從未接受過抗原刺激的成熟T細(xì)胞為初始T細(xì)胞，接受抗原刺激而活化，分化為效應(yīng)T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞。（二）T細(xì)胞和T細(xì)胞根據(jù)表達(dá)的TCR類型，T細(xì)胞可分為+T即細(xì)胞和+T細(xì)胞。+T細(xì)胞分布廣泛，識別抗原具有MHC限制性，抗原識別受體具有多樣性，既可分化為輔助性T細(xì)胞（Th），也可分化為細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）；+T細(xì)胞分布于皮膚粘膜組織，識別抗原無MHC限制性，抗原識別受體缺乏多樣性，只識別多種病原體表達(dá)的共同抗原，

9、效應(yīng)細(xì)胞為CTL.第11頁，共48頁，2022年，5月20日，8點39分，星期四（三）CD4+和CD8+T細(xì)胞T細(xì)胞又可分為CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞。CD4+T細(xì)胞識別MHC類分子所提呈的外源性抗原肽，活化后主要分化為Th. CD8+T細(xì)胞識別MHC類分子所提呈的內(nèi)源性抗原肽，活化后主要分化為CTL.（四）Th、CTL和Tr細(xì)胞根據(jù)功能可將T細(xì)胞分為Th、CTL和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tr細(xì)胞），均為效應(yīng)細(xì)胞。Th細(xì)胞可分化為Th1、Th2、Th3三類細(xì)胞，分別分泌不同的細(xì)胞因子，Th1和Th2在細(xì)胞和體液免疫中發(fā)揮作用；Th3對免疫應(yīng)答起負(fù)調(diào)節(jié)作用。CTL細(xì)胞可分化為Tc1和Tc2，分泌細(xì)胞因

10、子不同，Tc1與Th1相似；Tc2與Th2相似。Tr細(xì)胞參與免疫應(yīng)答的負(fù)調(diào)節(jié)及在自身免疫耐受中發(fā)揮作用。第12頁，共48頁，2022年，5月20日，8點39分，星期四TNF基因人的TNF- 基因長2.76 kb，由4個外顯子和3個內(nèi)含子組成，定位在第六號染色體上。人TNF-前體由233個氨基酸組成，含有76個氨基酸殘基的信號肽第13頁，共48頁，2022年，5月20日，8點39分，星期四TNF多態(tài)性第14頁，共48頁，2022年，5月20日，8點39分，星期四MHC定義：主要組織相容性復(fù)合體，是存在于脊椎動物某一染色體上編碼主要組織相容性抗原的一組緊密連鎖的基因群，與免疫應(yīng)答、免疫調(diào)節(jié)和移植排

11、斥等有關(guān)。 類和類分子是結(jié)構(gòu)相似的細(xì)胞膜表面糖蛋白，除作為移植抗原外，還與抗原遞呈及某些疾病相關(guān)。類分子包括c2、c4、b因子和腫瘤壞死因子等多種可溶性蛋白質(zhì)，相互間差別很大，與類和類分子在結(jié)構(gòu)和功能上相關(guān)性很小第15頁，共48頁，2022年，5月20日，8點39分，星期四TNF 基因具有多態(tài)性, 這種多態(tài)性的標(biāo)志是TNF 及其受體基因內(nèi)的堿基變化, 這種變化與一些自身免疫疾病TNF 水平特征性增高有密切關(guān)系, 尤其是與MHC 連鎖的疾病相關(guān)第16頁，共48頁，2022年，5月20日，8點39分，星期四示例1（論文）腫瘤壞死因子基因多態(tài)性對子宮內(nèi)膜異位癥患者血清中TNF濃度的影響目的：研究內(nèi)異

12、癥患者及非內(nèi)異癥婦女腫瘤壞死因子( tumor necro sis factors beta) 基因+ 252 位點的多態(tài)性與兩組血清中TNF 濃度的關(guān)系方法：PCRRFLP 檢測82 例內(nèi)異癥患者( 內(nèi)異癥組) 和8 0 例非內(nèi)異癥婦女( 對照組)檢測兩組血清中TNFa 和TNFb 的含量結(jié)論：+ 252 位點AA基因型血清中TNFb 水平較GG 基因型TNFb水平明顯升高第17頁，共48頁，2022年，5月20日，8點39分，星期四示例2腫瘤壞死因子基因多態(tài)性與膿毒癥易感性及預(yù)后間的關(guān)系目的: 確定腫瘤壞死因子基因多態(tài)性與膿毒癥易感性及細(xì)胞因子產(chǎn)量間的相關(guān)性。方法: 采用 PCR- RFL

13、P 分析正常人群和膿毒癥患者腫瘤壞死因子( TNF) - 啟動子- 308 位點及TNF- 第一內(nèi)含子+252 位點基因的單堿基突變多態(tài)性之間的異同。采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附( ELISA) 方法檢測膿毒癥患者血漿TNF- 和白細(xì)胞介素6 ( IL- 6) 的濃度。結(jié)果: 45 例膿毒癥患者的TNFB 等位基因頻率為67.78%, 高于正常對照組的53.33%( P 0.05) , 結(jié)論:TNF- 第一內(nèi)含子+252 位點的等位基因TNFB2 與膿毒癥的易感性和體內(nèi)TNF- 、IL- 6 濃度有關(guān)。第18頁，共48頁，2022年，5月20日，8點39分，星期四RFLP第19頁，共48頁，202

14、2年，5月20日，8點39分，星期四第20頁，共48頁，2022年，5月20日，8點39分，星期四TNF基因治療1984年起，歐美國家就開始把TNF的基因工程產(chǎn)品應(yīng)用到癌癥臨床治療中，并一度取得轟動的成果，然而最終由于毒副作用嚴(yán)重而被迫終止。九十年代末以來，隨著基礎(chǔ)研究的深入和基因工程技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家研制出一些高效、低毒的TNF變構(gòu)體，從而重新確立了TNF在抗腫瘤中的重要地位第21頁，共48頁，2022年，5月20日，8點39分，星期四切除信號肽后形成157個氨基酸的成熟型非糖基化的TNF-。通過基因工程方法改造后的TNF-具有更好的生物學(xué)活性和抗腫瘤效果。第22頁，共48頁，2022年，5

15、月20日，8點39分，星期四分泌蛋白的轉(zhuǎn)運過程（1）信號肽被信號肽識別粒子（SRP）結(jié)合，SRP把核蛋白體帶至胞膜的胞漿面與對接蛋白結(jié)合，核蛋白體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)合。（2）信號肽被信號肽酶切割掉，蛋白質(zhì)分泌到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔。第23頁，共48頁，2022年，5月20日，8點39分，星期四1以TNF基因修飾的腫瘤細(xì)胞為瘤苗的主動免疫治療患者自體或同種腫瘤細(xì)胞在體外轉(zhuǎn)入TNF基因后,致瘤性消除,仍然保留有免疫原性,注入機體后,可激起機體產(chǎn)生免疫反應(yīng),且對相應(yīng)腫瘤起治療作用.第24頁，共48頁，2022年，5月20日，8點39分，星期四瘤苗相關(guān)報道所謂“瘤苗”，即由科研人員先制備惡性腫瘤治療所需的細(xì)胞因子cDN

16、A，將其克隆到安全的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，并包裝成重組的缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，用以感染腫瘤細(xì)胞的疫苗。這種“瘤苗”經(jīng)60鈷輻射后，致瘤性消失，而細(xì)胞的免疫性則保留，并在一定時間內(nèi)還持續(xù)分泌細(xì)胞因子。陳詩書、錢關(guān)祥等潛心10年時間制備的“白介素-2基因工程化胃癌細(xì)胞瘤苗”,于2000年10月被SDA批準(zhǔn)為可用于臨床試驗的生物制品一類新藥，同意進行8例小樣本臨床試驗。8例晚期癌癥患者經(jīng)過該“瘤苗”2個月的治療和1個月的療效觀察，證實病人接受“瘤苗”治療是安全的、可耐受的，而且病情穩(wěn)定。第25頁，共48頁，2022年，5月20日，8點39分，星期四2供TNF基因的過繼免疫治療供TNF基因的過繼免疫治療是指

17、利用對腫瘤有免疫力的供者淋巴細(xì)胞或患者自身的免疫細(xì)胞在體外轉(zhuǎn)入TNF基因活化后、增殖,再輸入患者體內(nèi),使TNF基因在患者體內(nèi)表達(dá),發(fā)揮抗腫瘤作用.第26頁，共48頁，2022年，5月20日，8點39分，星期四3通過對TNF基因的表達(dá)調(diào)控,使TNF在腫瘤細(xì)胞中高效特異表達(dá)調(diào)控TNF基因在腫瘤細(xì)胞中特異性表達(dá),可達(dá)到定向轉(zhuǎn)移的目的.進入腫瘤細(xì)胞中的TNF基因要受到啟動子、增強子等序列的調(diào)控,因此可通過改變或引入有關(guān)特異性序列來實現(xiàn)其定向轉(zhuǎn)移與表達(dá).第27頁，共48頁，2022年，5月20日，8點39分，星期四4將TNF受體基因轉(zhuǎn)入腫瘤細(xì)胞,提高腫瘤細(xì)胞對TNF的敏感性TNF殺傷腫瘤細(xì)胞的主要機制就

18、是TNF與腫瘤細(xì)胞表面的受體結(jié)合所形成的內(nèi)在化效應(yīng),對某些腫瘤治療效果不理想.原因是腫瘤細(xì)胞缺乏TNF受體,從而對TNF不敏感.故將TNF受體基因轉(zhuǎn)入腫瘤細(xì)胞,使不表達(dá)或低表達(dá)TNF受體的腫瘤細(xì)胞表達(dá)TNF受體,可提高TNF治療效果.第28頁，共48頁，2022年，5月20日，8點39分，星期四TRADD分子TNF receptor 1 associated via death domain有死亡區(qū)的腫瘤壞死因子受體1相關(guān)蛋白抗原 TRADD is an adaptor protein.The protein encoded by this gene is a death domain con

19、taining adaptor molecule that interacts with TNFRSF1A/TNFR1 and mediates programmed cell death signaling and NF-kappaB activation. This protein binds adaptor protein TRAF2, reduces the recruitment of inhibitor-of-apoptosis proteins (IAPs) by TRAF2, and thus suppresses TRAF2 mediated apoptosis. This

20、protein can also interact with receptor TNFRSF6/FAS and adaptor protein FADD/MORT1, and is involved in the Fas-induced cell death pathway.第29頁，共48頁，2022年，5月20日，8點39分，星期四Signal transducing adaptor proteinproteins which are accessory to main proteins in a signal transduction pathway. These proteins te

21、nd to lack any intrinsic enzymatic activity themselves but instead mediate specific proteinprotein interactions that drive the formation of protein complexes.第30頁，共48頁，2022年，5月20日，8點39分，星期四NF-B的發(fā)現(xiàn)和命名NF-B（nuclear factor-kappa B）是1986年從B淋巴細(xì)胞的細(xì)胞核抽提物中找到的轉(zhuǎn)錄因子，它能與免疫球蛋白kappa輕鏈基因的增強子B序列GGGACTTTCC特異性結(jié)合，促進輕鏈基

22、因表達(dá)，故而得名。第31頁，共48頁，2022年，5月20日，8點39分，星期四增強子存在于基因組中的對基因表達(dá)有調(diào)控作用的DNA調(diào)控元件。位置不定，結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子后，可增強基因表達(dá)。 第32頁，共48頁，2022年，5月20日，8點39分，星期四Kappa CHAINSWhen immunoglobulin molecules are produced by the plasma cells in the bone marrow, the heavy chains (G, A, M, D, or E) and the light chains (kappa or lambda) are pro

23、duced separately. The kappa and lambda molecules are bound to the heavy chains and intact immunoglobulins are assembled, then transported to the surface of the plasma cell. 第33頁，共48頁，2022年，5月20日，8點39分，星期四REL家族它是真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Rel家族成員之一，廣泛存在于各種哺乳動物細(xì)胞中。迄今為止，在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)共發(fā)現(xiàn)5種NF-B/Rel家族成員，它們分別是RelA（即p65）、RelB、C-Re

24、l、p50/NF-B1（即p50/RelA）和p52/NF-B2。這些成員均有一個約300個氨基酸的Rel同源結(jié)構(gòu)域（Rel homology domain, RHD）。這個高度保守的結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)Rel蛋白形成同源或異源二聚體，該結(jié)構(gòu)域也是NF-B與靶基因DNA序列的特異性結(jié)合區(qū)域。第34頁，共48頁，2022年，5月20日，8點39分，星期四細(xì)胞內(nèi)NF-B的活化過程受到精細(xì)調(diào)控。通常情況下，在細(xì)胞質(zhì)中的NF-B處于失活狀態(tài)，與抑制蛋白IB（inhibitory protein of NF-B）結(jié)合成三聚體復(fù)合物。第35頁，共48頁，2022年，5月20日，8點39分，星期四信號傳遞過程1當(dāng)出現(xiàn)

25、TNF-信號、炎癥因子以及LPS、紫外線等外界刺激時，細(xì)胞因子與細(xì)胞膜表面的TNF受體結(jié)合后，TNF受體發(fā)生多聚化并與細(xì)胞質(zhì)中TRADD分子發(fā)生相互作用。第36頁，共48頁，2022年，5月20日，8點39分，星期四信號傳遞過程2TRADD招募TRAF（TNFR-associated factor）和激酶RIP（receptor interacting protein），由RIP將信號傳遞給IKK（IB kinase）第37頁，共48頁，2022年，5月20日，8點39分，星期四信號傳遞過程3IKK由、和三個亞基組成，作為激酶的IKK能使IB的亞基的Ser32和Ser36殘基和亞基的Ser19

26、和Ser23殘基磷酸化。IB隨即從p50/p65/IB異源三聚體中解離出來，經(jīng)泛素化修飾后通過蛋白酶體降解。第38頁，共48頁，2022年，5月20日，8點39分，星期四信號傳遞過程4受到IB抑制的NF-B得以暴露其核定位序列（nuclear localization signals, NLS），迅速從細(xì)胞質(zhì)進入細(xì)胞核內(nèi)，與核內(nèi)DNA上的特異序列相結(jié)合，從而啟動或增強相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄第39頁，共48頁，2022年，5月20日，8點39分，星期四第40頁，共48頁，2022年，5月20日，8點39分，星期四NF-B與腫瘤密切相關(guān)NF-B具有明顯的抑制細(xì)胞凋亡的功能，與腫瘤的發(fā)生、生長和轉(zhuǎn)移等多個過

27、程密切相關(guān)。在人類腫瘤尤其是淋巴系統(tǒng)的惡性腫瘤中，?？砂l(fā)現(xiàn)NF-B家族基因的突變。第41頁，共48頁，2022年，5月20日，8點39分，星期四NF-B家族與癌癥相關(guān)性的第一個線索是c-Rel 基因的發(fā)現(xiàn)，它是禽類逆轉(zhuǎn)錄病毒癌基因v-Rel 在細(xì)胞內(nèi)的同源基因。該病毒在雞體中造成多種造血細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，引起淋巴癌的發(fā)生。第42頁，共48頁，2022年，5月20日，8點39分，星期四Immunogen Synthetic peptide - KLH conjugated, Synthetic peptide Reactivity Human, Mouse (Murine), Rat (Rattus) Host Rabbit Clonality Polyclonal Description Gene: V-rel Reticuloend