ELISA法檢查乙肝表面抗原HBsAg培訓(xùn)課件

1、ELISA法檢查乙肝表面抗原HBsAgELISA法檢查乙肝表面抗原HBsAg免疫標(biāo)記技術(shù)定義： 將抗原-抗體反應(yīng)與標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，用放射性同位素、酶或熒光素標(biāo)記的已知抗體或抗原，通過檢測標(biāo)記物，間接測定未知的抗原或抗體。分類：放射免疫測定法：131I，32P免疫熒光技術(shù)：FITC，PE免疫酶測定法：HRP，AP2ELISA法檢查乙肝表面抗原HBsAg免疫標(biāo)記技術(shù)定義：2ELISA法檢查乙肝表面抗原HBsAg 用標(biāo)記物標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)借以提高免疫學(xué)診斷的敏感性熒光素 ：異硫氰酸熒光素（黃綠色熒光）、藻紅蛋白、 羅丹明（紅色熒光）放射性同位素： 125I、131I酶：辣根過氧化物酶、

2、堿性磷酸酶免疫熒光檢測法（IFA）放射免疫檢測法（RIA）酶免疫檢測法（EIA）免疫標(biāo)記技術(shù)3ELISA法檢查乙肝表面抗原HBsAg 用標(biāo)記物標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)借以提免疫酶測定法(Enzyme ImmunoAssay,EIA)用酶標(biāo)記的抗原或抗體進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。 辣根過氧化物酶(HRP)，堿性磷酸酶(AP)特點：高度特異性：保持抗原抗體反應(yīng)的特異性高靈敏度：酶催化底物顯色的高效性，pg水平微量檢測定性定量檢測：反應(yīng)液顏色深淺或光密度值分類：酶聯(lián)免疫吸附試驗：可溶性抗原或抗體酶免疫組化法： 組織中或細(xì)胞表面的抗原。4ELISA法檢查乙肝表面抗原HBsAg免疫酶測定法(Enzyme

3、 ImmunoAssay,EIA酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay）,簡稱ELISA，它是實驗室最常用的檢測方法，用酶標(biāo)記抗原或抗體檢測液體（血液、細(xì)胞液）中未知抗體或抗原。ELISA具有準(zhǔn)確性高、檢測時間短、價格低廉、判斷結(jié)果有客觀標(biāo)準(zhǔn)、結(jié)果便于記錄和保存等優(yōu)點，適合于大批標(biāo)本的檢測，廣泛應(yīng)用于食品安全檢測、醫(yī)療檢測以及免疫實驗分析等領(lǐng)域。1.簡介5ELISA法檢查乙肝表面抗原HBsAg酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-Linked Immuno

4、ELISA法檢查乙肝表面抗原HBsAg培訓(xùn)課件3、ELISA基本的實驗過程包被：將已知抗原或抗體通過物理吸附到固相載體表面，使抗原或抗體固相化；抗原抗體反應(yīng)：先后加入被檢標(biāo)本和酶結(jié)合物，使之與固相抗原或抗體發(fā)生免疫反應(yīng)而被結(jié)合固定；酶促反應(yīng)：在反應(yīng)體系中加入酶作用的底物，使發(fā)生酶促反應(yīng)而顯色。7ELISA法檢查乙肝表面抗原HBsAg3、ELISA基本的實驗過程包被：將已知抗原或抗體通過物理吸 ELISA的試劑ELISA中有3個是必要的試劑：免疫吸附劑、標(biāo)記物和顯色劑。（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）； （聚苯乙烯板：具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來

5、的免疫學(xué)活性）（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）；（3）酶作用的底物（顯色劑）；（4）陰性對照品和陽性對照品，參考標(biāo)準(zhǔn)品；（5）樣品及標(biāo)準(zhǔn)本的稀釋液；（6）洗滌液；（7）酶反應(yīng)終止液8ELISA法檢查乙肝表面抗原HBsAg ELISA的試劑ELISA中有3個是必要的試劑：免疫吸附劑 ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體，根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的情況以及檢測的具體條件，可設(shè)計出各種不同類型的檢測方法，主要類型有 雙抗體夾心法、間接法、競爭法、捕獲法等。4、ELISA類別9ELISA法檢查乙肝表面抗原HBsAg ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體，根雙抗體夾心法10ELISA法檢查乙肝

6、表面抗原HBsAg雙抗體夾心法10ELISA法檢查乙肝表面抗原HBsAg間接法11ELISA法檢查乙肝表面抗原HBsAg間接法11ELISA法檢查乙肝表面抗原HBsAg5、操作步驟（以雙抗體夾心法ELISA為例）：用抗體包被固相載體加入抗原Sample(二價以上)，溫育加入酶標(biāo)抗體，溫育加入底物，顯色清洗清洗清洗終止反應(yīng)，底物顯色深淺與待檢抗原量成正比。利用已知濃度的抗原制成標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋為梯度濃度，對其最終OD值與濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，那么樣品的濃度可以根據(jù)最終的OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出。12ELISA法檢查乙肝表面抗原HBsAg5、操作步驟（以雙抗體夾心法ELISA為例）：用抗體包被固相實驗內(nèi)容：

7、雙抗體夾心法測定乙肝表面抗原（HBsAg）定性定量檢測13ELISA法檢查乙肝表面抗原HBsAg實驗內(nèi)容： 雙抗體夾心法測定乙肝表面抗原（HBsAg）1、掌握ELISA（雙抗體夾心法）的原理2、熟悉ELISA實驗操作方法，并了解其應(yīng)用實驗?zāi)康?4ELISA法檢查乙肝表面抗原HBsAg1、掌握ELISA（雙抗體夾心法）的原理實驗?zāi)康?4ELIS實驗材料HBsAg酶聯(lián)免疫分析試劑盒HBsAg陽性品，陰性對照品移液槍，槍頭濕盒酶標(biāo)板，酶標(biāo)儀一次性手套記號筆計時器15ELISA法檢查乙肝表面抗原HBsAg實驗材料HBsAg酶聯(lián)免疫分析試劑盒15ELISA法檢查乙肝實驗步驟16ELISA法檢查乙肝表面抗

8、原HBsAg實驗步驟16ELISA法檢查乙肝表面抗原HBsAg結(jié)果判定定性測定定性測定的結(jié)果判斷作出“有”或“無”的回答，分別用“陽性”、“陰性”表示。在這種半定量測定中，將標(biāo)本作一系列稀釋后進(jìn)行試驗，呈陽性反應(yīng)的最高稀釋度即為滴度。根據(jù)滴度的高低，可以判斷標(biāo)本反應(yīng)性的強(qiáng)弱，這比觀察不稀釋標(biāo)本呈色的深淺判斷為強(qiáng)陽性、弱陽性更具定量意義。待測孔（P）與對照孔（N）的比值（P：N）大于1.5或2者為陽性，N為陰性對照孔。定量測定：酶標(biāo)儀測定450nm波長下的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品抗原的濃度。17ELISA法檢查乙肝表面抗原HBsAg結(jié)果判定定性測定17ELISA法檢查乙肝表面抗原HBsAg預(yù)期結(jié)果陽性：顯色為黃色陰性：無色1 2 3 4陰性陰性陽性陽性18ELISA法檢查乙肝表面抗原HBsAg預(yù)期結(jié)果陽性：顯色為黃色1 2 3 4ELISA注意事項加樣應(yīng)加在板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，避免產(chǎn)生氣泡并迅速完成；一個人操作時，一次不宜多于兩塊板同時測定。洗滌必須徹底，防止產(chǎn)生假陽性；溫育常采用的溫度有43、37、室溫和4等。37是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。ELISA板放在濕盒內(nèi)，可在盒底墊濕的紗布，將ELISA板放在濕紗布上。反應(yīng)板