分子克隆工具酶

1、關(guān)于分子克隆的工具酶第1頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四切割位點(diǎn)可為獲得DNA的物理圖的特殊的標(biāo)記利用限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生特殊DNA片段的能力使得純化那些DNA片段成為可能獲得的限制性DNA片段可作為DNA操作中的基本介質(zhì)第2頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四任何物種都有排除異物保護(hù)自身的防御機(jī)制免疫系統(tǒng)細(xì)菌的限制與修飾系統(tǒng)限制性內(nèi)切酶 修飾酶第3頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四第一節(jié) 限制性內(nèi)切酶Restriction endonuclease第4頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四一、

2、限制與修飾Restriction and modification 50年代初，發(fā)現(xiàn) host controlled specificity噬菌體具有代表性和普遍性其在不同宿主中的轉(zhuǎn)染頻率，在感染某一宿主后，再去感染其它宿主時受到限制的現(xiàn)象。第5頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四E.coli K E.coli B E.coli C KBC第6頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四E.coli K E.coli B E.coli C KBC11110-410-410-410-411第7頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四說明

3、K和B菌株中存在一種限制系統(tǒng)可排除外來的DNA10-4的存活率是由宿主修飾系統(tǒng)作用的結(jié)果甲基化：A N6甲基-腺膘呤 C 5甲基-胞嘧啶第8頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四2. 限制酶的發(fā)現(xiàn)60年代，限制內(nèi)切酶和限制酶的概念1968年 首次從E.coli K中分離限制性內(nèi)切酶需要ATP，S-腺苷甲硫氨酸（SAM）等有特定的識別位點(diǎn)但沒有特定的切割位點(diǎn)切割位點(diǎn)遠(yuǎn)離識別位點(diǎn)1000bp以上第9頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四1970年 美國約翰霍布金斯大學(xué) H.Smith 偶然發(fā)現(xiàn)流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae）能

4、迅速降解外源的噬菌體DNA細(xì)胞提取液可降解E.coli DNA但不能降解自身DNA 即HindII酶第10頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四5 .G T Py Pu A C. 33C A Pu Py T G. 5 G T C G A CG T T A A CG T C A A CG T T G A CY RPy表示嘧啶，Pu表示嘌呤 第11頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四5 .G A A T T C. 33C T T A A G. 5 EcoRI第12頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四3. 限制酶的命名宿主 屬名第

5、一字母、種名頭兩個字母菌株或型號序號 羅馬字HindII EcoRI 第13頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四例如：Hin d Haemophilus influenzae（流感嗜血桿菌）， ：表示菌系為型血清型； ：表示分離到的第三個限制酶。Eco RIEscherichia coli RI EcoRI表示基因位于Escherichia coli中的抗藥性R質(zhì)粒上 Hin dHaemophilus influensae d Sac I(II)Streptomyces achromogenes I ()第14頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四

6、第類酶（切割部位無特異性）：如EcoB(大腸桿菌B株)、EcoK(大腸桿菌K株)分子量較大(約300000)，作用時需ATP、Mg+等輔助因子第類酶（切割部位有特異性）：如EcoR I(大腸桿菌)、Hind (嗜血桿菌)，分子量較小(約 20000-100000)，作用時需Mg+存在4、限制性內(nèi)切酶的分類：III類 識別位點(diǎn)嚴(yán)格專一（不是回文序列）： 切點(diǎn)不專一，往往不在識別位點(diǎn)內(nèi)部。 NEB；Invitrogen公司；promega 普洛麥格；TakaRa.第15頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四二、限制酶的識別序列 2、識別特定堿基順序：2、1 回文對稱序列（pa

7、lindrome，從兩個方向閱讀其序列相同的序列）。1、限制酶識別序列長度4，5，6個堿基對。4 堿基酶識別位點(diǎn)在DNA分子中的頻率 6 堿基酶 稀有切割限制酶第16頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四R=A or G Y=C or T M=A or C K=G or T S=C or G W=A or TH=A or C or T B=C or G or T V=A or C or G D=A or G or TN=A or C or G or T第17頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四 EcoRI 5-G A A T T C-3 3-C T

8、 T A A G-5 3、型限制性核酸內(nèi)切酶的切割方式 切點(diǎn)大多數(shù)在識別順序之內(nèi) 限制酶切后產(chǎn)生兩個末端，末端結(jié)構(gòu)是-和- CCTCAGCGGAGTCGBbvc I第18頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四三、限制酶產(chǎn)生的末端種類 1.粘性末端 ）-端突起， ）-端突起，個數(shù)為或個核苷酸第19頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四 2. 平末端 SmaI 5-CCCGGG-3 5-CCC GGG-3 3-GGGCCC-5 3-GGG CCC-5 在對稱軸上同時切割DNA的兩條鏈 HaeIII GGCC EcoRV GATATC XmnI GAANN

9、NNTTC 第20頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四3. 非對稱突出端 來自非對稱識別序列 CCTCAGC BbvCI GGAGTCG第21頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四 簡并序列 AccIGT/MKACGTATACGTAGACGTCTACGTCGAC第22頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四 間隔序列 DraIII CACNNNGTG EarI CTC T TC (1/4) GAGAAG第23頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四4. 同裂酶 1. 定義：能識別相同序列但來源不同的兩種或多種

10、限制酶 2. 特點(diǎn)：1）識別相同順序 2）切割位點(diǎn)的異同 KpnI GGTAC C Asp718 G GTACC SstI CCGC GG SacI CCGC GG 第24頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四 同序同切 這些酶識別序列和切割位置都相同 HindII HincII GTY/RAC HpaII HapII C/CGG MobI Sau3AI /GATC第25頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四 同序異切KpnI GGTAC/C Acc65I G/GTACC Asp718I G/GTACCAatII GACGT/C BsaHI GR/C

11、GYC識別的序列是相同的，但它們的切割位點(diǎn)不同 第26頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四 “同功多位”EcoRI G/AATTC ApoI R/AATTYHpaI GTT/AAC HincII GTY/RAC許多識別簡并序列的限制酶包含了另一種限制酶的功能。如 EcoR 識別和切割位點(diǎn)為 GAATTC ， Apo 識別和切割位點(diǎn)為 RAATTY ，后者可識別前者的序列。第27頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四 其它 SalI G/TCGAC AccI GT/MKAC HincII GTY/RAC第28頁，共182頁，2022年，5月20日，1

12、1點(diǎn)11分，星期四 許多不同的限制酶來源各異，識別的靶子序列也各不相同，但切割 DNA 產(chǎn)生的末端是相同的，且是對稱的，即它們可產(chǎn)生相同的粘性突出末端。這些酶統(tǒng)稱為同尾酶。這些酶切割 DNA 得到的產(chǎn)物可進(jìn)行粘端連接。5、同尾酶（isocaudamer）：GATC 4個核苷酸組成的粘性末端平端同裂酶第29頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四四、DNA末端長度對限制酶切割的影響限制酶切割 DNA 時對識別序列兩端的非識別序列有長度的要求，也就是說在識別序列兩端必須有一定數(shù)量的核苷酸，否則限制酶將難以發(fā)揮切割活性。雙酶切 PCR產(chǎn)物第30頁，共182頁，2022年，5月20

13、日，11點(diǎn)11分，星期四 2hr 20hrAccI CCGGTCGACCGG 0 0HindIII CAAGCTTG 0 0 CCAAGCTTGG 0 0 CCCAAGCTTGGG 10% 75%EcoRI GGAATTCC 90 90 第31頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四PstI GCTGCAGC 0 0 TGCACTGCAGTGCA 10 10 AACTGCAG(N) 14 90 90 CTGCAG(N) 20 0 0第32頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四1、保護(hù)堿基 限制性內(nèi)切酶識別特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白還要占據(jù)識別位

14、點(diǎn)兩邊的若干個堿基，這些堿基對內(nèi)切酶穩(wěn)定的結(jié)合到DNA雙鏈并發(fā)揮切割DNA作用是有很大影響的，被稱為保護(hù)堿基。 PCR引物設(shè)計時，為保護(hù)5端外加的內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，使酶切完全而添加. 第33頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四 比如設(shè)計引物5端導(dǎo)入酶切位點(diǎn)的時候, 一般導(dǎo)入34個;導(dǎo)入的堿基, 最好是A/G/C/T比較平均,并能部分平衡整個引物的GC%和Tm;G/C為主,可以使引物5形成所謂GC Clamp(有的軟件,認(rèn)為這樣好). 別的就沒什么了. 加幾個和加哪幾個的問題 /techinfo/re/restrdigpcrii.htm第34頁，共182頁，2022年，5月

15、20日，11點(diǎn)11分，星期四 載體的酶切位點(diǎn)也會碰到，相臨的2個酶切位點(diǎn)往往不能同時使用，因為一個位點(diǎn)切割后留下的堿基過少以至于影響旁邊的酶切位點(diǎn)切割。第35頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四第36頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四第37頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC. XhoI EcoRI PstI EcoRI initial cut L1TMUS29cleavage efficiency XhoI 97% 1 base PstI 37

16、% 1 base第38頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC. XhoI EcoRI PstI EcoRI initial cut L1TMUS29cleavage efficiency XhoI 97% 1 base PstI 37% 1 base第39頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四.CTCGAGG AATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAA GGACGTC. XhoI PstI EcoRI initial cut L1TMUS29cleavage effici

17、ency XhoI 97% 1 base PstI 37% 1 base第40頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四.CTCGAGG AATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAA GGACGTC. XhoI PstI EcoRI initial cut L1TMUS29cleavage efficiency XhoI 97% 1 base PstI 37% 1 base第41頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四.CTCGAGG AATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAA GGACGTC. XhoI PstI EcoRI initial cut

18、 L1TMUS29cleavage efficiency XhoI 97% 1 base PstI 37% 1 base第42頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四.CTCGAGG AATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAA GGACGTC. XhoI PstI EcoRI initial cut L1TMUS29cleavage efficiency XhoI 97% 1 base PstI 37% 1 base第43頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四EcoRI initial cut L1TMUS29cleavage efficiency

19、 XhoI 97% 1 base PstI 37% 1 base.CTCGAGG AATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAA GGACGTC. XhoI PstI 第44頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四EcoRI initial cut L1TMUS29cleavage efficiency XhoI 97% 1 base PstI 37% 1 base.C TCGAGGAATTCCTGCA G.GAGCT CCTTAAGG ACGTC. XhoI EcoRI PstI XhoI : 1 EcoRI 100% PstI : 1 EcoRI 88%第45頁，共18

20、2頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四五、位點(diǎn)偏愛 (site preferences)單位酶: 在建議使用的緩沖液及溫度下，在20l反應(yīng)液中反應(yīng)1小時，使1g DNA完全消化所需的酶量 DNA第46頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四某些限制酶對同一介質(zhì)中的有些位點(diǎn)表現(xiàn)出偏愛性切割，即對不同位置的同一個識別序列表現(xiàn)出不同的切割效率的現(xiàn)象稱作位點(diǎn)偏愛。第47頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四* 1975 EcoRI切割 phage (Lambda)中的5個位點(diǎn)，并不是隨機(jī)的，靠近右端的位點(diǎn)，比分子中間的位點(diǎn)切割快10倍。1. 現(xiàn)象第

21、48頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四* 有4個 SacII位點(diǎn) 三個在中央 一個在右臂（Right-terminus） at 40,386 中央三個快50倍第49頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四NEB檢測了許多限制酶，有許多酶的差異在10倍的范圍上，但有許多酶有較大的差異, 如NarI, NaeI SacIIGGCGCC, GCCGGC, CCGCGG第50頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四(1) pBR322含4個NarI位點(diǎn)1單位酶 1hr (標(biāo)準(zhǔn)條件)將兩個位點(diǎn)完全切割但是另外兩個位點(diǎn)50單位,16小時 不

22、能完全切割完全第51頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四(2) NaeI 在pBR322也有4個位點(diǎn)，其中兩個易切割，有一個有點(diǎn)慢,第四個慢50倍。在 DNA上NarI 和NaeI各都有一個位點(diǎn)，但是過量的酶只能完成部分酶切。第52頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四2. 原因(1) 在切割DNA之前需要同時與兩個識別位點(diǎn)相作用第53頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四plasmidPlasmid /SalIPlasmid /EagI第54頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四六、酶切反應(yīng)條件任何一個

23、提供商都會標(biāo)明其產(chǎn)品的最佳作用條件第55頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四(一) 緩沖液1. 常規(guī)緩沖液pH, Mg+, DTT, BSA (10X)Mg2+的作用是提供二價的陽離子。巰基試劑對于保持某些核酸內(nèi)切限制酶的穩(wěn)定性是有用的， 而且還可保護(hù)其免于失活。第56頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四 pH 7.0-7.9 (at 25) Tris-HCl, 乙酸 Tris-HCL的作用在于，使反應(yīng)混合物的pH恒定在酶活 性所要求的最佳數(shù)值的范圍之內(nèi)。 離子強(qiáng)度： NaCl 高 中 低 100mM 50mM 0第57頁，共182頁，2022年

24、，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四 Mg+ 10mM MgCl2 , MgAc DTT (dithiothreitol,二硫蘇糖醇) 1mM 100g/ml BSA 少數(shù)需要第58頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四 不同酶具有不同Buffer 各公司設(shè)立幾種常用BufferNEBuffer 1NEBuffer 2 NEBuffer 3NEBuffer 4 Buffer ABuffer BBuffer HBuffer L Roche第59頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四 對 DNA 進(jìn)行雙酶切時，如何選擇緩沖液是相當(dāng)重要的。一方面可選用都合適

25、的緩沖液或通用緩沖液；若找不到共用的緩沖液則先用低濃度的，再加適量 NaCl 和第二種酶；或先用低鹽緩沖液再用高鹽緩沖液（DNA 可純化或不純化）。 第60頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四2. 通用緩沖體系 Phamacia 法瑪西亞 One-Phor-All buffer plus, OPA+第61頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四3. 注意事項a. 取少量酶 (方法 or 稀釋 )b. 最后加酶、盡快操作c. 減少反應(yīng)體積d. 反應(yīng)時間的延長e. 分裝（對于多個反應(yīng)）第62頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四(二

26、) 反應(yīng)溫度大多數(shù)為37一部分為50-65 少數(shù)25-30高溫作用酶于37時活性多數(shù)10-50%TaqI (65) 10% , ApoI(50)50%第63頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四(三) 反應(yīng)時間 1hr or more許多酶延長其反應(yīng)時間可減少酶的用量 16hrEcoRI 0.13 (1/8) HindIII (1/8)KpnI(1/4) BamHI(1/2) HaeIII(1/1)第64頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四(四) 反應(yīng)終止EDTA 終10mM EDTA 可鏊合鎂離子，從而可終止酶切反應(yīng) 2. 加熱 37 酶 65

27、20min otherwise 80 20min第65頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四不失活在80 20min的酶37：Bg1II HpaI PvuII65：Tth111I TspRI50：Bc1I第66頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四3. 其它 DNA純化(苯酚,試劑盒)第67頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四七、星星活性(star activity) 非特異性切割在極端非標(biāo)準(zhǔn)條件下，限制酶能切割與識別序列相似的序列，這個改變的特殊性稱星星活性1. 概念 第68頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11

28、分，星期四實際上星星活性是限制內(nèi)切酶的一般性質(zhì)，任何一種限制酶在極端非標(biāo)準(zhǔn)條件下都能切割非典型位點(diǎn)。ApoI、AseI、BamHI、BssHII、EcoRI、EcoRV、HindIII、Hinf1、KpnI、PstI、PvuII、SalI、ScaI、TaqI、XmnI第69頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四2. 酶的特異性變化方式與酶的種類和所應(yīng)用的條件有關(guān)最普遍的活性變化1個堿基的變化識別位點(diǎn)外層堿基的隨意性以及單鏈缺口第70頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四3. 引起星星活性的因素 高濃度甘油（5%） 酶過量（100U/g） 低離子強(qiáng)度（

29、pH8.0)第71頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四 有機(jī)溶劑PMSD(二甲基亞砜)、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺（dimethylacetamide）、二甲基甲酰胺（dimethylformamide）、sulphalane 用其它二價陽離子代替Mg+Mn+，Cu+，Co+, Zn+ 第72頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四不同的酶對上述條件的敏感性不一樣PstI比EcoRI對高pH更敏感但后者對甘油濃度更敏感星星活性在絕大多數(shù)情況下，是可控制的第73頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四4. 抑制星星活性的條件（措施）

30、 減少酶的用量，避免過量酶切,減少甘油濃度 保證反應(yīng)體系中無有機(jī)溶濟(jì)或乙醇 提高離子強(qiáng)度到100150mM (如果不會抑制的話) 降低反應(yīng)pH至pH7.0 使用Mg+作為二價陽離子第74頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四1. 外因 外因是可預(yù)見和控制的，如反應(yīng)條件、底物的純度（是否有雜質(zhì)、是否有鹽酚的污染）、何時加酶、操作是否恰當(dāng)、反應(yīng)體積的選擇以及反應(yīng)時間的長短等等。 九、影響活性的因素第75頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四2. “內(nèi)因” 位點(diǎn)偏愛性 甲基化 底物的構(gòu)象構(gòu)象的影響主要指切割線性 DNA 和超螺旋 DNA 時的活性，如與切割

31、 DNA 相比， EcoR、Pst、Sal 需要至少 2.5-10 倍的酶來切割 pBR322 的超螺旋 DNA 。 PaeRT 與 Xho 切割相同的序列（CTCGAG），但如果 5 端為 CT 則 PaeRT 不能切割。 第76頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四十、酶切位點(diǎn)的引入 （酶切水平）第77頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四1. 產(chǎn)生的5突出端補(bǔ)平后連接EcoRI GAATTC CTTAAG第78頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC

32、. XhoI EcoRI PstI 第79頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四.CTCGAGG AATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAA GGACGTC. XhoI PstI 第80頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四.CTCGAGG AATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAA GGACGTC. XhoI PstI 第81頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四.CTCGAGG AATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAA GGACGTC. XhoI PstI 第82頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)1

33、1分，星期四.CTCGAGG AATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAA GGACGTC. XhoI PstI AATTTTAA第83頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四.CTCGAGG AATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAA GGACGTC. XhoI PstI AATTTTAA第84頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四.CTCGAGG AATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAA GGACGTC. XhoI PstI AATTTTAA AceIATTAAT XmaIGAANNNNTTC 第85頁，共182頁，2022年，5月20

34、日，11點(diǎn)11分，星期四2. 同尾末端的連接BamHI(G/GATCC) + BclI (T/GATCA) AlwI (GGATC 4/5)第86頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四3.平端連接PvuII(CAGCTG)+EcoRV(GATATC) MobI (GATC)第87頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四十一、酶切位點(diǎn)在基因組中分布的不均一性GC% 酶切位點(diǎn)出現(xiàn)的機(jī)率BamHI GGATCCEcoRI GAATTC第88頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四在基因組中，堿基對的排列是非均勻的因此盡管GC含量相同的酶切

35、位點(diǎn)，在基因組中出現(xiàn)的機(jī)率是不一樣的平均片段大小在E.coliAscI(GGCGCGCC) 20kbNotI(GCGGCCGC) 200kbEcoRI/HindIII 5kbSpeI(ACTAGT) 60kb第89頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四細(xì)菌基因組在大多數(shù)富含A+T的細(xì)菌中，CCG和CGG的排列是最少見的，所以含有這兩種序列的識別序列出現(xiàn)的機(jī)率就非常少酵母基因組G+C%為38%，因此在重復(fù)序列之外(tRNA or Ty elements)，富含G+C的識別序列就特別少第90頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四哺乳動物細(xì)胞核基因組的G+

36、C為41%，其中CG的序列比想象的低5倍之多，因此含CG序列的酶切位點(diǎn)在哺乳動物細(xì)胞就相當(dāng)稀少。但是在哺乳動物細(xì)胞中，大多數(shù)CG序列是甲基化的第91頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四第二節(jié) 甲基化酶 Methylase Methylationmethyltransferase第92頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四一、甲基化酶的種類在真核和原核生物中存在大量的甲基化酶，在E.coli中大多數(shù)都有三個位點(diǎn)特異性的DNA甲基化酶第93頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四1. Dam甲基化酶GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基第

37、94頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四 PvuII BamHI BclI BglII XhoII MboI Sau3AI 識別位點(diǎn)中含GATC序列 ClaI(1/4) XbaI (1/16) TaqI (1/16) MboII (1/16) HphI(1/16)部分識別序列含GATC序列4個ClaI位點(diǎn)(ATCGATN)中有一個該序列第95頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四有些限制酶對Dam甲基化敏感不能切割相應(yīng)的序列BclI, ClaI, MboI, XbaI 等不敏感的有BamHI, Sau3AI, BglII, PvuI等第96頁，共1

38、82頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四一般哺乳動物DNA不會在A-N6上甲基化當(dāng)需要在敏感位點(diǎn)上完全切割DNA時，必須從dam- E.coli中提取DNA第97頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四2. Dcm甲基化酶識別CCAGG或CCTGG序列在第二個C上C5位置上引入甲基第98頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四EcoRII / BstNI CCA(T)GG二者識別序列相同，但切點(diǎn)不同EcoRII受dcm甲基化作用影響B(tài)stNI可避免這一影響第99頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四受影響酶有：Acc65

39、I GGTACCAlwNI ApaI GGGCCCEcoRIIEaeI 等不受影響酶有：KpnI GGTACCBanIIBg1I BstNINarI GGCGCC等第100頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四二、甲基化對限制酶切的影響1. 修飾酶切位點(diǎn) HincII GTCGAC GTCAAC GTTGAC GTTAAC M.TaqI甲基化TCGA中的A，所以M.TaqI處理DNA后，GTCGAC將不受HincII切割第101頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四 BamHI GGATCC M.MspI m5CCGG如果BamHI前面為CC或后面為

40、GG，那么M.MspI處理的DNA抵抗BamHI的切割第102頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四 構(gòu)建DNA文庫時用AluI(AGCT)和HaeIII(GGCC)部分消化基因組DNA用M.EcoRI甲基化酶處理，然后加上合成的EcoRI接頭當(dāng)再用EcoRI來切割時只有接頭上的位點(diǎn)可被切割第103頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四2. 產(chǎn)生新酶切位點(diǎn)TCGATCGAAGCTAGCT TaqI TaqI M.TaqI TCGA*TCGA* *AGCT*AGCT DpnI第104頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四第三節(jié) D

41、NA聚合酶DNA polymerase催化DNA的合成(模板/引物/dNTP等)及其相輔的活性第105頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四第106頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四 真核細(xì)胞有 4種 DNApoly：也許是復(fù)合物，位于細(xì)胞核內(nèi)，有催化細(xì)胞增生的作用。：小分子蛋白質(zhì)（4.4kDa）曾從小牛胸腺出提出，與細(xì)胞增生無關(guān)。：100kDa，利用RNA為模板的效率比利用DNA為模板的效率高。其它：線粒體DNA聚合酶、催化線粒體DNA的合成。第107頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四原核細(xì)胞三種DNA聚合酶，都與DN

42、A鏈的延長有關(guān)I單鏈多肽，可催化單鏈或雙鏈DNA的延長II 與低分子脫氧核苷酸鏈的延長有關(guān)III 在細(xì)胞中存在的數(shù)目不多，是促進(jìn)DNA鏈延長的主要酶一、大腸桿菌DNA聚合酶 I Ecoli DNA polymerase I第108頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四1. 活性單鏈多肽(109kDa) 三種活性 53DNA聚合酶活性底物: 模板(ssDNA), 引物（帶3OH基） 或 5突出DsDNA Mg2+ dNTP DNApolyI第109頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四53外切核酸酶活性底物: dsDNA or DNA: RNA雜交體活

43、性：從5端降解dsDNA，也降解 RNA:DNA中的RNA(RNase H 活性) Mg2+ DNApolyI+ dNTP第110頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四35外切酶活性底物：3-OH dsDNA or ssDNA活性：從3-OH端降解DNA，可被53聚合活性封閉。 Mg2+ DNApolyI+ dNTP Mg2+ DNApolyI+ dNTPProof reading第111頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四反應(yīng)平衡過量dNTP 平端第112頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四2. 用途切口平移法標(biāo)記DNAN

44、ick translation（所有DNApoly中只有此有此活性）第113頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四 Mg2+, 低限量DNase IdNTP DNApoly I產(chǎn)生切口切口平移外切活性和合成活性共同作用使切口沿5-3方向平移若有放射性dNTP, 則可標(biāo)記成探針第114頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四 用于cDNA克隆中的第二鏈即單純的DNA聚合活性但由于有5-3外切活性，已不再使用，而改用Klenow酶和反轉(zhuǎn)錄酶第115頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四 末端標(biāo)記 （ 交換或置換反應(yīng)） Mg2+, DN

45、Apoly I -P32dATPA*TT4 DNApolyT7 DNApoly 更好第116頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四二、Klenow酶E.coli DNA polymerase I large fragmentKlenow fragment在蛋白酶（枯草桿菌蛋白酶）裂解, 從全酶中除去53外切活性片段，而聚合活性和35外切活性不受影響，或基因工程而得76kDa第117頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow片段Klenow聚合酶或Klenow大片段酶大腸桿菌DNA聚合酶 DNA聚合酶全酶 大片段 Klen

46、ow 小片段具有5 3的聚合活性和3 5核酸外切酶活性，5 3的核酸外切酶活性枯草桿菌蛋白酶第118頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四1. 活性共兩種, 同 DNApoly I2.作用 補(bǔ)平3凹端，注意要用 dNTP 抹平3凸端，注意必須加足量dNTP T4和T7具更強(qiáng)3-5外切活性。 末端標(biāo)記 A置換反應(yīng) 同前,同樣被T4poly代替 B補(bǔ)平3-凹端的過程進(jìn)行標(biāo)記第119頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四第120頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四第121頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四

47、cDNA克隆中合成第二鏈 隨機(jī)引物標(biāo)記 DNA測序（Sanger 雙脫氧鏈末端終止法）被T7取代，Taq等PCR酶。 PCR反應(yīng)被Taq等取代 在體外誘變中，用于從單鏈模板合成dsDNA僅利用DNA合成活性第122頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四三、T4噬菌體DNA聚合酶 T4 DNA polymerase來源于T4 phage感染的E.coli 114kDa第123頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四1. 活性由噬菌體基因編碼的，具有兩種酶催活性，即5 3的聚合酶活性和3 5的核酸外切酶活性。與Klenow酶相似，但35外切活性強(qiáng)200倍

48、第124頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四2. 用途 補(bǔ)平或標(biāo)記3 凹端 必須有高濃度dNTP（末端標(biāo)記） 置換反應(yīng) 必須有高濃度dNTP(一種)末端標(biāo)記第125頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四 標(biāo)記DNA片段 即利用外切活性產(chǎn)生了3凹端 再補(bǔ)平（用標(biāo)記的dNTP）第126頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四第127頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四T4 DNA 聚合酶和取代合成法標(biāo)記DNA片段第128頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四四、T7噬菌體DNA聚合酶T7

49、 DNA polymerase來源于T7 phage感染的E.coli為兩種緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合體(基因5蛋白和宿主的硫氧還蛋白)第129頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四T7DNApoly為持續(xù)合成能力最強(qiáng)的一個 平均長度要大得多,在測序時具有優(yōu)勢活性/功能與T4DNApoly、Klenow類似 但3 5外切活性為Klenow的1000倍用途:A. 替代T4的功能B. 長模板的引物延伸第130頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四修飾的 T7 DNA polymerase99% 35外切活性被除去（V1.0）完全除去（V2.0）用于測序反應(yīng)（測

50、序酶）Sequenase USB Biochemical第131頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四1. 特點(diǎn)： 分離自水生棲熱菌，分子量為94,000，最適反應(yīng)溫度75， 對95高溫具良好穩(wěn)定性，該酶不存在35外切酶活性2. 用途： 主要用于DNA的體外擴(kuò)增，經(jīng)25次循環(huán)后才進(jìn)入酶的反應(yīng)穩(wěn)定期，一個DNA 分子因而可被擴(kuò)增4106倍 DNA擴(kuò)增技術(shù)又稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，它包括以下三個步驟： DNA模板變性(95) 與DNA引物退火(45) 引物延伸(75) 五. Taq DNA聚合酶 耐熱DNA聚合酶第132頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四

51、六、反轉(zhuǎn)錄酶 Reverse transcriptase依賴于RNA的DNA聚合酶1種類 來自AMV 禽成髓細(xì)胞瘤病毒 Mo-MLV(M-MuLV) Moloney鼠白血病病毒5 3合成DNA無3 5外切活性第133頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四第134頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四 AMV 二鏈多肽(62kDa/94kDa)具5 3DNA聚合活性具很強(qiáng)的RNA酶H活性(降解與DNA雜交的RNA)在反應(yīng)開始時,引物和mRNA模板雜交體可成為 RNase H 的底物, 此時模板的降解和cDNA的合成相競爭第135頁，共182頁，2022

52、年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四反應(yīng)終止時，RNase H 可在正在增長的 DNA鏈近3端切割模板 趨向于抑制cDNA的產(chǎn)量并限制其長度但在42(雞的正常體溫),能有效發(fā)揮DNA合成作用，能有效地拷貝較復(fù)雜的mRNA 早期提純過程中易被內(nèi)切酶污染, cDNA不超過1kb,現(xiàn)已解決第136頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四 High Fidelity PrimeScript RT-PCR Kit是用于從Total RNA或mRNA高保真合成cDNA的2 Step RT-PCR試劑盒。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用了TaKaRa獨(dú)自開發(fā)的反轉(zhuǎn)錄酶PrimeScript RTase，該

53、酶是一種新型的RNase H-型反轉(zhuǎn)錄酶，無RNase H活性，不會分解模板RNA，能夠有效合成長鏈的1st-strand cDNA。 本反轉(zhuǎn)錄酶具有極強(qiáng)的延伸能力，即使對有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的RNA，在42條件下也能得到良好的反應(yīng)效果，無需進(jìn)行高溫反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，因為高溫的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)會導(dǎo)致RNA的降解。PCR反應(yīng)選用兼具高保真和高效擴(kuò)增性能的PrimeSTAR HS DNA Polymerase，可以很好地應(yīng)用于cDNA克隆等對保真性要求高的實驗。使用本試劑盒擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物幾乎都為平滑末端，可克隆于平滑末端的載體中。第137頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四 M-MuL

54、V M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶是一種依賴于RNA和DNA的DNA聚合酶。它可以單鏈RNA、DNA或RNA-DNA雜合鏈為模板，以RNA或DNA為引物啟動DNA合成。該酶帶有針對RNA-DNA雜合鏈中RNA的RNase H活性。本產(chǎn)品來源于帶有編碼莫洛尼氏鼠白血病病毒（M-MLV）逆轉(zhuǎn)錄酶的pol基因片段的E.coli菌株。單肽 84kDa RNase H 活性弱利于合成較長cDNA第138頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四2用途 cDNA克隆 測轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)（引物延伸法） 5突出DNA的補(bǔ)平 測序反應(yīng) (當(dāng)用DNApolyI, Klenow 或測序酶不理想時) 其它 RT-PC

55、R RNA二級結(jié)構(gòu)第139頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四3. 活性 53DNA聚合活性（Mg+） RNA or DNA 模板 及帶3OH的RNA或DNA引物 RNase H 活性RNase H- 突變第140頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四4. 注意事項 無3 5外切校正作用，在高dNTP和Mn2+時，每500個bases會有一個誤摻入。 為防止新合成的DNA提前終止，需高濃度dNTP。 單鏈拷貝，也可雙鏈合成（自身序列為引物，但效率低）,50g/ml 放線菌毒D，抑制第二鏈合成。第141頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)1

56、1分，星期四七、末端轉(zhuǎn)移酶來源于小牛胸腺,存在于前淋巴細(xì)胞及分化早期的類淋巴樣細(xì)胞內(nèi)的一種不尋常的DNApoly在二價陽離子存在下，末端轉(zhuǎn)移酶催化dNTP加于DNA分子的3羥基端T, C 首選 Co2+ A, G首選Mg2+Terminal transferase第142頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四1. 底物DNA, 可短至3個核苷酸, 3突出低離子強(qiáng)度時,平端或3凹出端DNA 亦可 但效率低2. 用途 在3端加同聚尾，cDNA或載體，用于克隆，或標(biāo)記 末端標(biāo)記 ddNTP(標(biāo)記的)第143頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四 37 15

57、min 隨時間的延長尾亦長。3. 同尾的長度第144頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四第四節(jié) RNA聚合酶RNA polymerase來源于噬菌體感染宿主后所產(chǎn)生第145頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四SP6噬菌體聚合酶 來源于感染鼠傷寒沙門氏菌LT2菌株T3或T7噬菌體聚合酶 來源于感染的大腸桿菌第146頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四1. 活性這些RNA聚合酶實際上為轉(zhuǎn)錄過程中RNA合成的酶，識別DNA中特異的啟動子序列，并沿此dsDNA模板起始RNA的合成。與DNA聚合酶不同，無需引物，但識別特異性位點(diǎn)第1

58、47頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四2. 用途 體外：將這些RNA聚合酶特異性的啟動子安裝在載體,如pGEM-3Z載體(2.74kb,p13)中，用于體外轉(zhuǎn)錄（合成）與外源DNA同源的RNA，從而用作雜交探針，體外翻譯系統(tǒng)中的mRNA，體外剪接反應(yīng)的底物第148頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四第149頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四 體內(nèi)：用于表達(dá)外源基因A. Ecoli先構(gòu)建宿主菌，將T7 poly RNA基因置于 lacUV5 啟動子之下，插入到噬菌體中，感染E.coli建立穩(wěn)定的溶原菌Ecoli BL21

59、(DE3)：lacUV5啟動子+T7RNA聚合酶基因，置于噬菌體DE3區(qū)，該區(qū)整合于染色體的BL21處。第150頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四若將T7噬菌體啟動子控制的目的基因經(jīng)質(zhì)粒載體導(dǎo)入該宿主菌中在IPTG(異丙基硫代-D-半乳糖苷)誘導(dǎo)啟動外源基因的表達(dá)另一種方法是，先導(dǎo)入重組質(zhì)粒，再用（帶T7 RNApoly）感染，激活目的基因的表達(dá)第151頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四B酵母菌酵母啟動子+T7 RNApoly in 穩(wěn)定載體T7啟動+外源基因 in 另一載體第152頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四

60、第五節(jié) 連結(jié)酶(Ligase)將兩段核酸連接起來的酶1. T4 DNA ligase 68kDa T4噬菌體感染大腸桿菌產(chǎn)生催化DNA 5磷酸基與3羥基之間形成磷酸二脂鍵。這種反應(yīng)需要供給能量，大腸桿菌和其他細(xì)菌的DNA連接酶以NAD+作為能量來源，動物細(xì)胞和噬菌體的連接酶則以ATP作為能量來源。第153頁，共182頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)11分，星期四ATP+DNA ligase(E)E-AMP+PPi。E-AMP上的AMP轉(zhuǎn)移到DNA的5磷酸根上，使其活化，釋放出酶?；罨?磷酸根與相鄰的3羥基形成3，5磷酸二酯鍵，并釋放出AMP。第154頁，共182頁，2022年，5月20日，