信號放大時間分辨熒光分析技術(shù)的研究進展及應(yīng)用

1、信號放大時間分辨熒光分析技術(shù)的研究進展及應(yīng)用【摘要】信號放大時間分辨熒光分析技術(shù)是一種新型的超微量的標(biāo)記分析技術(shù)。它是以生物信號放大為根底，以鑭系元素螯合物為標(biāo)記物，以時間分辨和波長分辨為測量方法，充分利用了酶標(biāo)記分析和PR擴增等分析技術(shù)優(yōu)點的技術(shù)。它的獨特優(yōu)點是非同位素和超靈敏度。本綜述介紹了TRFA的特點以及酶放大、二次酶放大、銪納米顆粒、滾動循環(huán)放大、免疫PR和熒光淬滅分析等信號放大時間分辨熒光分析技術(shù)的研究進展及應(yīng)用。信號放大時間分辨熒光分析技術(shù)在生物分析中極其廣泛的應(yīng)用，顯示出具有很好的開展前景?！娟P(guān)鍵詞】信號放大；時間分辨熒光分析；鑭系元素螯合物Studiesandappliati

2、nsftie-reslvedflureseneassaybasednsignalaplifiatin【Abstrat】Tie-reslvedflureseneassies(TRFA)basednsignalaplifiatinareneultrasensitivelabellingassaytehnlgies.Thebasisisbisignalaplifiatin,thelabelsarelanthanidehelates,andthedetetinethdsarethetie-reslvedandavelength-reslvedflureseneassayinthetehnlgies.I

3、nadditin,enzye-labelledassayandPRaplifiatinetalareusedinthetehnlgies.Theseveralainsignalaplifiatinethdsandaplifiatins,frexaple,enzye-aplifiatin,t-rundenzye-aplifiatin,eurpiunanpartial,rllingirleaplifiatin,iun-PRandfluresenequenhingassayetal,ereintrduedinthesuary.Theuniqueadvantagesfnnistpeandultrase

4、nsitivityandextensiveappliatinsinbiassayshngdprspetsfTRFAbasednsignalaplifiatin.【Keyrds】signalaplifiatin;tie-reslvedflureseneassay;lanthanidehelate近些年來，非同位素標(biāo)記分析技術(shù)開展迅速。它主要包括：酶標(biāo)記分析技術(shù)、化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)、生物發(fā)光分析技術(shù)和時間分辨熒光分析技術(shù)。信號放大時間分辨熒光分析技術(shù)克制了其他技術(shù)的缺點，具有非同位素、靈敏度高、標(biāo)記物制備簡單、測量快速和分析動態(tài)范圍寬等優(yōu)點，成為一種最有開展前途的非同位素標(biāo)記分析技術(shù)。1信號放大時間

5、分辨熒光分析技術(shù)的原理及特點信號放大時間分辨熒光分析tie-reslvedflureseneassay，TRFA技術(shù)是把生物信號放大、鑭系元素螯合物的固有優(yōu)點以及時間分辨和波長分辨兩種測量技術(shù)合為一體，極其有效地排除了非特異熒光，測量了特異熒光，因此靈敏度很高。信號放大時間分辨熒光分析技術(shù)的優(yōu)點歸根到底是源于鑭系元素螯合物的固有特點1。它們是：(1)激發(fā)光譜帶較寬，可以增加激發(fā)能，進步標(biāo)記物的比活性。(2)發(fā)射光譜帶很窄，50%發(fā)射譜帶的寬僅約為10n，可以利用通帶濾光片，只允許峰值波長5n譜段通過供測量，在如此窄的譜段內(nèi)，非特異熒光很少，可有效降低本底熒光，且能量損失也不大。(3)激發(fā)光與發(fā)

6、射光之間的stkes位移大，有利于排除激發(fā)光散射等的干擾。(4)鑭系離子螯合物的熒光壽命很長，約1s,在時間分辨熒光儀上測量時，脈沖光源激發(fā)后，可適當(dāng)延遲一段時間，待其他短半衰期110ns的非特異熒光完全衰變后再測量，從而極大的降低了本底熒光，實現(xiàn)了時間分辨，靈敏度大大進步。(5)鑭系離子由激發(fā)態(tài)躍遷到基態(tài)時發(fā)射熒光，在測量時間內(nèi)可反復(fù)激發(fā)鑭系離子，相當(dāng)于大大進步了標(biāo)記比活性。此外，時間分辨熒光分析技術(shù)的分析動態(tài)范圍寬，可達45個數(shù)量級；標(biāo)記物制備簡單，穩(wěn)定性好，有效期長，不受半衰期影響；標(biāo)記蛋白質(zhì)時反響條件溫和，蛋白質(zhì)活性受損少；測量快速，易于自動化。2生物素鏈霉親和素系統(tǒng)放大的時間分辨熒光

7、分析1988年，出現(xiàn)了一種新的雙功能螯合劑，稱為4,7-雙氯磺?；交?1,10-菲咯啉-2,9-二羧酸4,7-bis(hlrsulfphenyl)-1,10-phenanthrline-2,9-diarbxyliaid,BPDA，為了增加生物放大又把生物素-親合素系統(tǒng)bitin-avidinsyste,BAS引入免疫反響系統(tǒng)。本分析系統(tǒng)的根本原理是：固相Ab與抗原反響后，再參加生物素化Ab，形成免疫反響復(fù)合物，再參加通用試劑SA-BPDA-Eu3+，其中SA是鏈霉親合素streptavidin，SA，借助SA與生物素的高特異和高親合力的結(jié)合，把這種通用試劑連接到免疫反響復(fù)合物上，最終形成的復(fù)

8、合物為：固相Ab-抗原標(biāo)準(zhǔn)或樣品-Ab-生物素-SA-BPDA-Eu3+2。本分析系統(tǒng)的特點是不用增強液，可在固相下直接測熒光。該系統(tǒng)共有三次放大作用，但放大倍數(shù)仍然遠小于增強液系統(tǒng)，靈敏度可能略低，為此也有學(xué)者在最后一步參加增強液，進展液相熒光測定。3酶放大時間分辨熒光分析酶放大時間分辨熒光分析enzye-aplifiedtie-reslvedflureseneassay,EATRFA系統(tǒng)，它的核心思想是把生物素-鏈霉親和素的高親和力和放大作用、酶放大作用、鑭系元素螯合物的特有優(yōu)點和時間分辨測量技術(shù)結(jié)合，不用增強液，在液相下測量熒光。其根本原理是：固相Ab與抗原和生物素化Ab同時反響，形成免

9、疫反響復(fù)合物；然后再與堿性磷酸酶ALP標(biāo)記SA的復(fù)合物ALP-SA反響，形成復(fù)合物固相Ab-抗原-Ab-生物素-SA-ALP。再參加ALP的底物5-氟水楊酸磷酸酯5-flursaliylphsphate，5-FSAP，生成產(chǎn)物5-氟水楊酸5-flursaliyliaid，5-FSA。再參加鋱Tb3+乙二胺四乙酸EDTA螯合物，在高pH下，形成熒光壽命長、熒光產(chǎn)額高的三元復(fù)合物FSA-Tb3+-EDTA。測定546n波長的熒光強度即可得抗原濃度3,4。在本法中，環(huán)境改變和淬滅體對熒光發(fā)射特征影響極?。昏|系元素污染的影響也非常小5；在液相下測熒光，不用別離，非常簡捷。4二次酶放大時間分辨熒光分析近

10、年又提出二次酶放大時間分辨熒光分析系統(tǒng)3,6，用于核酸雜交分析。其原理如下：先用抗體包被微滴定孔，再經(jīng)特異抗原標(biāo)記的靶DNA與該抗體反響，將靶DNA連接到固相抗體上。然后用生物素化探針與靶DNA雜交，再通過生物素與鏈霉親和素的反響，將鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶HRP連接到雜化物上。當(dāng)參加含有H22和生物素化酪胺B-T的HRP的底物溶液，因有H22存在，HRP在催化酪胺氧化，產(chǎn)生游離基團的同時，也催化事先固定在微滴定孔外表的蛋白質(zhì)如白蛋白的酪胺?；难趸Ｓ捎诙垠w形成反響，于是B-T就共價地結(jié)合到固相上。再參加ALP-SA，經(jīng)B與SA的反響，ALP結(jié)合到固相上。至此，實現(xiàn)了雜交和建立了雜交

11、的定量關(guān)系。洗滌后，參加ALP的底物5-FSAP，此后的步驟與EATRF分析系統(tǒng)的一樣。二次酶放大時間分辨熒光分析系統(tǒng)的主要目的是增加放大倍數(shù)，大大進步分析靈敏度。有報告稱此系統(tǒng)的特異信號可增加30倍，信/噪比可改良10倍，靈敏度可達310-16l7。熒光光譜明確可靠。測量熒光強度時，溶液中有5-FSA：EDTA：Tb三元復(fù)合物，它的最大吸收波長與儀器的激發(fā)波長337n幾乎相等，很匹配，它的四條發(fā)射譜帶中547n譜帶的強度最強，用5475n的窄通帶濾光片，只允許其通過，是供測量的熒光信號。5-FSAP本身不發(fā)熒光，也不能與Tb-EDTA結(jié)合成復(fù)合物。游離的5-FSA只發(fā)射420n波長的熒光，也

12、被濾光片濾掉。EATRFA系統(tǒng)的優(yōu)點是：靈敏度非常高，對PBR322DNA的雜交分析，國外Evanglista等報道為3pg8，國內(nèi)趙啟仁等報道為10pg3，而二次EATRFA系統(tǒng)的靈敏度更高；分析系統(tǒng)簡單，全過程操作，可以一管到底，在檢測熒光強度時，不需要別離，可直接在液相下測量；分析快速，測定全過程只需要十幾小時，且主要是溫育需要過夜；相關(guān)試劑的有效期長；不存在放射性對人體的危害等問題；不存在金屬離子污染問題；環(huán)境改變和淬滅體對熒光特征發(fā)射的影響極??；有利于分析自動化實現(xiàn)。5納米顆粒的應(yīng)用近幾年來，納米顆粒應(yīng)用到時間分辨熒光分析技術(shù)中。每個納米顆粒含有數(shù)千鑭系元素螯合物，這樣可以大大進步標(biāo)

13、記比活性。在均相時間分辨熒光分析中，使用納米顆粒技術(shù)，當(dāng)激發(fā)光激發(fā)時，大量增加的鑭系元素螯合物作為能量供體將能量傳遞給能量受體，傳遞的能量增加，受體所受的激發(fā)熒光強度也大大增加。Hara等和Kkk等分別報告了用銪納米顆粒和時間分辨熒光免疫分析技術(shù)進展了超靈敏的前列腺特異抗原PSA和雌二醇的測定9，10。6滾動循環(huán)放大時間分辨熒光分析由于ELISA等酶免疫分析的靈敏度和特異性受限，特別是當(dāng)分析材料或抗原的量很少時，2000年，ShEitzer等11利用滾動循環(huán)放大rllingirleaplifiatin,RA進展了超靈敏的抗原測定。滾動循環(huán)放大用于蛋白抗原類的測定，被稱為“iunRA。它是一個多

14、元化的分析系統(tǒng)，可以一次檢測多種抗原，可用于免疫診斷和基因診斷?！癷unRA的原理是：將抗原標(biāo)準(zhǔn)或待測樣品包被在固相上，參加共價連接寡核苷酸引物的抗體。通過抗原和抗體的特異結(jié)合，寡核苷酸引物連于固相。這樣，在環(huán)狀DNA、DNA聚合酶和核苷酸的存在下，進展擴增。擴增的結(jié)果就是一條很長的DNA分子，它包含了數(shù)百個拷貝的環(huán)狀DNA序列12。這時，我們用生物素化的探針和其雜交，利用生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)對擴增產(chǎn)物DNA的量進展時間分辨熒光測定。因為在一定范圍內(nèi)，所得擴增DNA的量正比于固相的量，所以可以定量固相抗原。“iunRA具有靈敏度高，特異性強；測定快速，動態(tài)范圍寬；不需要特殊的設(shè)備，操作更簡便

15、；防止假陽性結(jié)果；檢測結(jié)果更準(zhǔn)確等優(yōu)點13,14?！癷unRA不僅可用于蛋白抗原類的測定，其根本原理還可應(yīng)用于點突變檢測以及直接檢測病毒DNA或RNA來診斷病毒感染。2022年，angB等用RA高效地測定了SARS-V病毒DNA15。2022年，SilanderK等用少量DNA經(jīng)過多樣引物進展了SNP基因擴增的評估16。7免疫PR時間分辨熒光分析很多疾病的生命和分子根底的根本原理的說明，需要研究生物分子的互相作用，甚至是在單個細胞或單個分子程度上的這種作用。多數(shù)自然過程涉及蛋白質(zhì)和其他非核酸物質(zhì)，因此，單是核酸分析還是缺乏以探究生物原理。為了把PR的近乎指數(shù)的擴增能擴展到蛋白質(zhì)的高靈敏度測定，

16、Sanetal17創(chuàng)立了免疫PR法Iun-PR，IPR。IPR是一種檢測微量抗原的高靈敏度技術(shù)。它把抗原抗體反響的高特異性和PR的高靈敏感性有機地結(jié)合起來。它的根本原理是：用一段DNA分子標(biāo)記抗體作為探針，利用抗體和抗原的特異結(jié)合，把此探針連接到待測抗原上，PR擴增粘附在抗原抗體復(fù)合物上的這段DNA分子，電泳定性，根據(jù)特異性PR產(chǎn)物的有無，來判斷待測抗原是否存在。IPR是迄今最敏感的一種抗原檢測方法，理論上可以檢測單個抗原分子，理論上它的靈敏度比ELISA法高10010000倍18。由于PR產(chǎn)物在抗原量未到達飽和前與抗原抗體復(fù)合物的量成正比，因此IPR還可進展抗原的定量19和半定量試驗。IPR

17、的連接分子是指IPR中需要的連接報告分子和抗原抗體復(fù)合物的中間橋分子20。主要有：重組的鏈霉親和素-蛋白A嵌合體，蛋白A可與抗體的F段結(jié)合，而鏈霉親和素可與DNA分子上的生物素連接。以及生物素化單抗-親和素-生物素化DNA分子復(fù)合體及其修飾物21。研制新型連接分子是IPR的一個研究熱點。要求用作IPR報告分子和PR擴增系統(tǒng)有良好的擴增效果，具有近似理論的擴增率。與反響系統(tǒng)中可能存在的DNA分子不應(yīng)有同源性。目前用的較多的是DNA聚合酶將生物素化的堿基聚合到DNA末端，理論上一條DNA鏈上標(biāo)記一個生物素分子時靈敏度最高。PR產(chǎn)物經(jīng)葡聚糖凝膠電泳后，EB染色，紫外線燈下觀察或照像，出現(xiàn)特異性擴增帶

18、為陽性。另外，在PR擴增時應(yīng)用生物素標(biāo)記，再與堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉親和素反響，再參加ALP的底物5-FSAP，產(chǎn)物為5-FSA，再參加含Tb-EDTA的熒光開展溶液，可用時間分辨熒光儀測熒光強度。當(dāng)然也有用放射性同位素和熒光素的。IPR應(yīng)用很多，目前主要用于檢測腫瘤標(biāo)志物、細胞因子、神經(jīng)內(nèi)分泌活性多肽、病毒抗原、細菌、酶、支原體、衣原體等微量抗原。到目前不完全統(tǒng)計有各種檢測40多種2224。8時間分辨熒光淬滅分析時間分辨熒光淬滅分析tie-reslvedfluresenequenhingassay,TRFQA是建立于熒光共振能量轉(zhuǎn)移flureseneresnaneenergytransfer，

19、FRET理論25上的一種分析系統(tǒng)。在此分析系統(tǒng)中，能量是從一個鑭系元素螯合物轉(zhuǎn)移到一個非熒光淬滅體。雙鏈DNA探針，其中一條鏈的5端標(biāo)記鑭系元素螯合物，另一條單鏈的3端標(biāo)記熒光淬滅基團。當(dāng)標(biāo)記有鑭系元素螯合物的單鏈與靶DNA雜交時產(chǎn)生熒光信號，而游離的該種單鏈與標(biāo)記有熒光淬滅基團的單鏈結(jié)合時，熒光信號被熒光淬滅基團淬滅。這樣大大減小了背景熒光，進步了靈敏度26。2022年，ang等進展了抗引物淬滅的實時PR和臨床癌癥樣品的分析27。Santangel等用納米構(gòu)造探針測定了活細胞中的RNA28。信號放大時間分辨熒光分析法是一種新型的超微量分析方法,由于它的優(yōu)點突出，越來越受到關(guān)注,應(yīng)用日益廣泛。

20、相信在不久的將來,隨著生物技術(shù)的開展，對微量檢測要求的進步，具有高靈敏度的信號放大時間分辨熒光分析將在更多的領(lǐng)域內(nèi)得到廣泛應(yīng)用?！緟⒖嘉墨I】1SiniE,KjlaH.Tie-reslvedflureterfrlanthanidehelates:anegeneratinnnnistpiiunassays.linhe,1983,29:65-68.2HeilaJ.Lanthanidesasprbesfrtie-reslvedflurerriiunassays.SandJlinLabInvest,1988,48:389.3趙啟仁，李美佳，劉潔，等.核酸雜交的酶放大時間分辨熒光分析.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報，

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