實(shí)驗(yàn)四：血液樣品的處理及組織樣品的制備課件

實(shí)驗(yàn)五：血液生化樣品處理及組織樣品的制備目的要求了解血液生化樣品制備的原理；掌握血液生化樣品制備的方法。掌握離心機(jī)使用方法和注意事項(xiàng)一、血液生化樣品制備采血

測(cè)定用的血液，多由靜脈采集。一般在飼喂前空腹采取，因此時(shí)血液中化學(xué)成分含量比較穩(wěn)定。采血時(shí)所用的針頭、注射器、盛血容器要清潔干燥；接血時(shí)應(yīng)讓血液沿著容器壁慢慢注入，以防溶血和產(chǎn)生泡沫。全血及血漿的制備全血：采血前加入抗凝劑，包括了血漿和血纖蛋白。血漿：全血離心后除去血纖蛋白的液體?？鼓齽悍彩悄芤种蒲耗谭磻?yīng)的化合物稱為抗凝劑。常用抗凝劑的使用方法1、草酸鉀(鈉)。其優(yōu)點(diǎn)是溶解度大，與血液混合后，迅速與血中鈣離子結(jié)合，形成不溶的草酸鈣，使血液不再凝固。配制方法：通常先配成10％草酸鉀或草酸鈉溶液，然后吸取此液0.1ml于試管中，轉(zhuǎn)動(dòng)試管，使其鋪散在試管壁上，置80℃干燥箱內(nèi)烘干，管壁呈白色粉末狀，加塞備用。每管含草酸鉀或草酸鈉10mg，可抗凝血液5ml。應(yīng)用范圍：適用于非蛋白氮、血糖等多種測(cè)定項(xiàng)目，但不適用于鉀、鈉和鈣的測(cè)定；另外草酸鹽能抑制乳酸脫氫酶、酸性磷酸酶和淀粉酶，故使用時(shí)給予注意。草酸鉀一氟化鈉混合劑。血液內(nèi)某些化學(xué)成分(如血糖)離開機(jī)體后仍易被酶作用而影響測(cè)定結(jié)果。如用混合劑可抑制酶的作用(氟化鈉有抑制糖酵解作用)，因而能防止血糖等化學(xué)物質(zhì)的分解。配制方法：稱取草酸鉀6g，氟化鈉3g，加蒸餾水至lOOml，分裝在試管內(nèi)，每管0.25ml。80℃烘干后加塞備用。每管含混合劑22.5mg，可抗凝血液5ml。應(yīng)用范圍：最適用于血糖的測(cè)定，而不適用于脲酶法的尿素氮測(cè)定(因氟化鈉能抑制脲酶活性)。肝素是一種較好的抗凝劑，因它對(duì)血中有機(jī)成分和無機(jī)成分的測(cè)定均無影響，其主要作用是抑制凝血酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槟?，使纖維蛋白原不能轉(zhuǎn)化為纖維蛋白而凝血。配制方法：常將肝素配成lmg／ml的水溶液，每管裝0．1ml，再橫放蒸干(不宜超過50℃)備用。每管可抗凝血液5～lOml。市售肝素大多數(shù)為鈉鹽，可按10mg／ml配制成水溶液。每管裝0.1ml，按上法烘干，可使5～lOml血液不凝固。應(yīng)用范圍：適用于血液有機(jī)物的測(cè)定；不適用于凝血酶原的測(cè)定。血漿的制備血漿的制備由靜脈采集的血液，放人裝有抗凝劑的試管或離心管中，輕輕搖動(dòng)，使血液與抗凝劑充分混合，以防小血塊的形成。抗凝血可靜置或離心沉淀分離(2000r／min,10min)，以使血細(xì)胞下沉，上清液即為血漿。血漿與血清成分基本相似，只是血清不含纖維蛋白原。

鎢酸法

原理：血液中的蛋白質(zhì)在pH小于其等電點(diǎn)時(shí)，可用鎢酸來沉淀。鎢酸鈉與硫酸混合產(chǎn)生鎢酸和硫酸鈉，游離的鎢酸被，蛋白質(zhì)吸附，形成不溶性的鎢酸蛋白而沉淀，經(jīng)過濾或離心，除去沉淀即得無蛋白的血濾液。試劑：①10%鎢酸鈉溶液；②0.333mol／L硫酸溶液。儀器與器材：錐形瓶、吸管、奧氏吸管、濾紙、漏斗或離心管及離心機(jī)。三氯醋酸法

原理：三氯醋酸是一種有機(jī)強(qiáng)酸，可使血液中蛋白質(zhì)變性而形成不溶的蛋白質(zhì)鹽沉淀。其上清液即為無蛋白血濾液。此液呈酸性，常用來測(cè)定無機(jī)磷等。試劑：10％三氯醋酸溶液。儀器與器材：錐形瓶、刻度吸管和奧氏吸管、濾紙、漏斗或離心管和離心機(jī)。方法與步驟：①取9份10％三氯醋酸放人錐形瓶中；②加入抗凝血1份，邊加邊搖，靜置5min；③過濾或離心，即得完全澄清的無蛋白血濾液，此液亦為10倍稀釋之血濾液。附注(1)等無蛋白血濾液時(shí)，各液加妥后，搖勻不應(yīng)有泡沫，否則表明蛋白質(zhì)沉淀不完全。(2)所得無蛋白血濾液均應(yīng)是五色透明的液體，如呈粉紅色則說明蛋白質(zhì)沉淀不完全。

二、離心機(jī)使用方法離心分離技術(shù)是根據(jù)物體在一個(gè)實(shí)用離心場(chǎng)合中的狀態(tài)而發(fā)展起來的新技術(shù)。不同密度、大小或形狀的物質(zhì)在不同速度的離心場(chǎng)合中沉降，所以一個(gè)大體是球形非均一的混合物，可以用離心的方法加以分離，離心機(jī)是為了進(jìn)一步研究生物化學(xué)、分離大量的物質(zhì)。例如：收集細(xì)胞，分離血漿。從這些預(yù)純化的制劑中分離DNA和蛋白質(zhì)分子，并可分離出病毒和大規(guī)模大腸桿菌、亞細(xì)胞成份、核蛋白微粒。使用方法1．將離心機(jī)放在堅(jiān)實(shí)而平整的工作臺(tái)上；2．在適用的離心管中加入樣品，按離心機(jī)轉(zhuǎn)頭的離心管位置刻度所對(duì)應(yīng)