水產(chǎn)動物病原的檢測技術課件

第六章水產(chǎn)動物病原的檢測技術第一節(jié)免疫學檢測第二節(jié)PCR技術第三節(jié)核酸分子雜交技術第六章水產(chǎn)動物病原的檢測技術第一節(jié)免疫學檢測1第一節(jié)免疫學檢測一、Ag-Ab反應的一般規(guī)律和特點二、Ag-Ab反應的影響因素三、免疫凝集試驗四、免疫沉淀試驗五、與補體相關的試驗六、酶聯(lián)免疫吸附試驗七、熒光免疫技術第一節(jié)免疫學檢測一、Ag-Ab反應的一般規(guī)律和特點2一、Ag-Ab反應的一般規(guī)律和特點（一）特異性與交叉性（二）可逆性（三）Ag-Ab的結(jié)合比例與“帶現(xiàn)象”（四）特異性結(jié)合與反應可見兩個階段第一節(jié)免疫學檢測一、Ag-Ab反應的一般規(guī)律和特點（一）特異性與交叉性第一節(jié)3（三）Ag-Ab的結(jié)合比例與“帶現(xiàn)象”Ag-Ab結(jié)合需有適當比例-----最適比，形成的結(jié)合物體積大、數(shù)量多，出現(xiàn)肉眼可見的反應。即Ag-Ab反應的等價帶。若Ag或Ab過多，比例不適，不能出現(xiàn)肉眼可見反應-----“帶現(xiàn)象”。Ab過剩---------前帶，Ag過剩--------后帶。第一節(jié)免疫學檢測（三）Ag-Ab的結(jié)合比例與“帶現(xiàn)象”第一節(jié)免疫學檢測4水產(chǎn)動物病原的檢測技術課件5二、影響Ag-Ab反應的主要因素1、電解質(zhì)：生理鹽水（0.85%NaCl）2、溫度：37℃，水產(chǎn)動物28～30℃

3、PH：6~8第一節(jié)免疫學檢測二、影響Ag-Ab反應的主要因素1、電解質(zhì)：生理鹽水（0.86三、免疫凝集試驗（凝集反應）

電解質(zhì)顆粒性Ag+相應Ab凝集小塊（凝集原）（凝集素）

反應種類敏感度直接凝集反應+間接凝集反應++間接凝集抑制試驗+++協(xié)同凝集試驗+++第一節(jié)免疫學檢測三、免疫凝集試驗（凝集反應）7（一）直接凝集試驗第一節(jié)免疫學檢測（一）直接凝集試驗第一節(jié)免疫學檢測8常用已知Ab測未知Ag。可用于細菌的鑒定、ABO血型分型1、玻片法：定性反應陽性

反應陰性

第一節(jié)免疫學檢測常用已知Ab測未知Ag?？捎糜诩毦蔫b定、ABO血型分型1、92、試管法：定量

（測定抗體的效價）第一節(jié)免疫學檢測2、試管法：定量（測定抗體的效價）第一節(jié)免疫學檢測10（二）間接凝集試驗可溶性Ag吸附在載體表面+Ab→凝集（致敏顆粒）可用來檢測微量存在的Ab載體：紅細胞--------------------------間接血凝試驗聚苯乙烯乳膠顆粒-----------間接凝膠凝集試驗硫酸鋁、活性炭第一節(jié)免疫學檢測（二）間接凝集試驗第一節(jié)免疫學檢測11

載體可溶性Ag致敏顆粒

Ab致敏顆粒凝集

+→+→第一節(jié)免疫學檢測載體可溶性Ag致敏顆粒12（三）間接凝集抑制試驗可溶性Ag+相應Ab+相應致敏顆?！怀霈F(xiàn)致敏顆粒凝集可用來檢測可溶性Ag如：免疫妊娠診斷試驗：（1）診斷Ag：HCG致敏的乳膠顆粒（2）診斷血清：抗HCG的Ab（3）檢測標本：尿液（是否含有HCG）第一節(jié)免疫學檢測（三）間接凝集抑制試驗可溶性Ag+相應Ab+相應致敏13水產(chǎn)動物病原的檢測技術課件14（四）協(xié)同凝集試驗金黃色葡萄球菌細胞壁中的蛋白A（SPA）SPA+IgG→暴露Fab片段+相應Ag→協(xié)同凝集反應通常可用于檢測可能存在的微量抗原目前，已用于流腦、傷寒、布氏菌病的早期診斷第一節(jié)免疫學檢測（四）協(xié)同凝集試驗金黃色葡萄球菌細胞壁中的蛋白A（SPA）第15水產(chǎn)動物病原的檢測技術課件16四、免疫沉淀試驗（沉淀反應）可溶性抗原+抗體肉眼可見的沉淀（沉淀原）（沉淀素）第一節(jié)免疫學檢測電解質(zhì)四、免疫沉淀試驗（沉淀反應）可溶性抗原+抗體17（一）環(huán)狀沉淀試驗已知抗血清+待檢抗原液面交界處，白色環(huán)狀沉淀主要用于抗原的定性試驗，如細菌血清型鑒定等。

第一節(jié)免疫學檢測數(shù)分鐘（一）環(huán)狀沉淀試驗已知抗血清+待檢抗原18（二）瓊脂擴散試驗可溶性Ag+相應Ab白色沉淀線瓊脂擴散：雙向、單向瓊脂擴散+電泳技術：

對流電泳、火箭電泳、免疫電泳第一節(jié)免疫學檢測電解質(zhì)、瓊脂擴散（二）瓊脂擴散試驗可溶性Ag+相應Ab191、雙向瓊脂擴散單個Ag-Ab系統(tǒng)

多個Ag-Ab系統(tǒng)第一節(jié)免疫學檢測AgAbAbAg制成凝膠板——打孔——加入Ag、Ab1、雙向瓊脂擴散第一節(jié)免疫學檢測AgAbAbAg制成凝膠20水產(chǎn)動物病原的檢測技術課件21特點：敏感性不高，所需時間較長?？捎糜冢海?）定性檢測可溶性Ag或Ab。（2）對復雜的Ag、Ab的提取純度進行分析鑒定。第一節(jié)免疫學檢測第一節(jié)免疫學檢測222、單向瓊脂擴散將已知抗體與瓊脂混勻

特點：操作繁瑣第一節(jié)免疫學檢測2、單向瓊脂擴散第一節(jié)免疫學檢測233、對流電泳雙向瓊脂擴散+電泳技術試驗在裝有PH8.6緩沖液的電泳槽中進行。一+AgAb電滲力電場力第一節(jié)免疫學檢測特點：操作簡便，敏感性高，所需時間短。3、對流電泳一+AgAb電滲力電場力第一節(jié)免疫學檢測特點24水產(chǎn)動物病原的檢測技術課件254、火箭電泳單向瓊脂擴散+電泳緩沖液PH8.6第一節(jié)免疫學檢測+—4、火箭電泳第一節(jié)免疫學檢測+—26水產(chǎn)動物病原的檢測技術課件275、免疫電泳先電泳，再雙向瓊脂擴散

第一節(jié)免疫學檢測5、免疫電泳第一節(jié)免疫學檢測28本試驗樣品用量小，特異性高，分辨力強，主要用于血清蛋白及抗體成分的分析研究本試驗樣品用量小，特異性高，分辨力強，主要用于血清蛋白及抗體29

五、與補體相關的試驗（一）溶解試驗1、溶血試驗紅細胞與相應抗體（溶血素）結(jié)合，通過激活補體使紅細胞溶解2、溶菌試驗某些細菌與相應Ab結(jié)合，可激活補體，使細菌溶解（二）補體結(jié)合試驗（CFT）是一種在補體參與的條件下，以綿羊紅細胞和溶血素作為指示系統(tǒng)來測定有無相應抗原或抗體的血清學試驗。第一節(jié)免疫學檢測五、與補體相關的試驗（一）溶解試驗第一節(jié)免疫學檢測30AgAgAgAbAbAbCCCSRBCSRBCSRBCHHH__溶血（反應陰性）溶血（反應陰性）不溶血（反應陽性）待檢系統(tǒng)指示系統(tǒng)第一節(jié)免疫學檢測AgAgAgAbAbAbCCCSRBCSRBCSRBCHHH31六、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）Ag-Ab+酶→底物顯色→用酶標測定儀分析優(yōu)點：敏感性高，特異性強，可定性、定量。常用酶及底物：1、辣根過氧化物酶（HRP）底物：鄰苯二胺（OPD）-------------------黃色。四甲基聯(lián)苯胺（TMB）-------------金黃色。2、堿性磷酸酶（AP）底物：對硝基苯磷酸鹽（PNPP）---------黃色。第一節(jié)免疫學檢測六、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）第一節(jié)免疫學檢測32（一）直接法（二）間接法（三）雙抗體夾心法（四）抗原競爭法第一節(jié)免疫學檢測特異性高；敏感性低敏感性高；易非特異性吸附適用于含兩個以上表位的抗原適用于小分子抗原（一）直接法第一節(jié)免疫學檢測特異性高；敏感性低敏感性高；33（一）直接法抗原（抗體）+酶標抗體（抗原）第一節(jié)免疫學檢測（一）直接法第一節(jié)免疫學檢測34（二）間接法用已知Ag檢測未知Ab的效價。已知Ag吸附于載體洗滌加被檢血清，Ab與Ag結(jié)合洗滌加酶標二抗，使與Ag-Ab復合物結(jié)合。洗滌加底物顯色第一節(jié)免疫學檢測EEEEEE（二）間接法第一節(jié)免疫學檢測EE35酶標板第一節(jié)免疫學檢測酶標板第一節(jié)免疫學檢測36第一節(jié)免疫學檢測第一節(jié)免疫學檢測37（三）雙抗體夾心法用已知Ab檢測未知Ag。

已知Ab吸附于載體洗滌加可能含Ag的待檢溶液洗滌加酶標記Ab洗滌加底物EEEEEE第一節(jié)免疫學檢測（三）雙抗體夾心法EE第一節(jié)免疫學檢測38EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEE（1）已知Ab吸附于載體（2）a、加酶標記Ag，b、加酶標記Ag和可能含Ag的待檢溶液（3）

（3）b-（3）a=待檢溶液的Ag量。（四）抗原競爭法：用已知Ab檢測未知Ag（小分子抗原）EEEEEEEE39七、免疫熒光技術又稱熒光抗體技術。熒光素：異硫氰酸熒光素（FITC）----------------黃綠色熒光四乙基羅丹明（RB200）------------------橙色熒光四甲基異硫氰酸羅丹明（TMRITC）---橙紅色熒光第一節(jié)免疫學檢測七、免疫熒光技術又稱熒光抗體技術。第一節(jié)免疫學檢測40（一）直接法含未知Ag待檢標本（固定在玻片上）+已知熒光Ab→洗去游離的熒光Ab→干燥后，熒光顯微鏡下觀察。優(yōu)點：方法簡便、特異性高。缺點：敏感性偏低、如檢測多種Ag需制備多種相應的熒光抗體標記。

第一節(jié)免疫學檢測（一）直接法第一節(jié)免疫學檢測41已知熒光Ab（若有相應Ag）待檢標本（未知Ag）第一節(jié)免疫學檢測已知熒光Ab（若有相應Ag）待檢標本（未知Ag）第一節(jié)免42（二）間接法

待檢樣品（未知Ag）+Ab（已知）→熒光標記抗Ab→沖洗、干燥、熒光顯微鏡下觀察。

優(yōu)點：敏感性高，制備一種熒光標記抗Ab即可對多種Ag-Ab系統(tǒng)進行檢測。缺點：易出現(xiàn)非特異性熒光。第一節(jié)免疫學檢測（二）間接法第一節(jié)免疫學檢測43待檢標本（未知Ag）熒光標記抗Ab+已知Ab第一節(jié)免疫學檢測待檢標本（未知Ag）熒光標記+已知Ab第一節(jié)免疫學檢測44免疫熒光抗體技術檢測兔抗血清結(jié)果a-SR1b-副溶血弧菌c-哈維氏弧菌d-愛德華氏菌e-熒光假單胞菌f-大腸桿菌（bar=20μm）免疫熒光抗體技術檢測兔抗血清結(jié)果45水產(chǎn)動物病原的檢測技術課件46水產(chǎn)動物病原的檢測技術課件47一、定義多聚酶鏈式反應（polymerasechainreaction,PCR）：在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促反應。第二節(jié)PCR技術一、定義第二節(jié)PCR技術48二、反應體系和過程1、PCR反應緩沖液2、模板DNA3、引物4、TaqDNA聚合酶5、4種脫氧核糖核苷酸(4×dNTP)

一個循環(huán)包括：變性、退火、延伸一般20-30個循環(huán)。第二節(jié)PCR技術二、反應體系和過程第二節(jié)PCR技術49750bp250bp2000bp500bp1000bp100bp

M12

1-16SrRNA2-HSP60PCR擴增結(jié)果第二節(jié)PCR技術750bp250bp2000bp500bp1000bp10050以HSP60基因構建的弧菌系統(tǒng)發(fā)育樹以HSP60基因構建的弧菌系統(tǒng)發(fā)育樹511、名詞解釋：帶現(xiàn)象、PCR2、抗原抗體反應的一般規(guī)律有哪些？3、酶聯(lián)免疫吸附試驗中常用哪幾種酶和底物？第六章水產(chǎn)動物病原的檢測技術（思考題）1、名詞解釋：帶現(xiàn)象、PCR第六章水產(chǎn)動物病原的檢測技術（52第六章水產(chǎn)動物病原的檢測技術第一節(jié)免疫學檢測第二節(jié)PCR技術第三節(jié)核酸分子雜交技術第六章水產(chǎn)動物病原的檢測技術第一節(jié)免疫學檢測53第一節(jié)免疫學檢測一、Ag-Ab反應的一般規(guī)律和特點二、Ag-Ab反應的影響因素三、免疫凝集試驗四、免疫沉淀試驗五、與補體相關的試驗六、酶聯(lián)免疫吸附試驗七、熒光免疫技術第一節(jié)免疫學檢測一、Ag-Ab反應的一般規(guī)律和特點54一、Ag-Ab反應的一般規(guī)律和特點（一）特異性與交叉性（二）可逆性（三）Ag-Ab的結(jié)合比例與“帶現(xiàn)象”（四）特異性結(jié)合與反應可見兩個階段第一節(jié)免疫學檢測一、Ag-Ab反應的一般規(guī)律和特點（一）特異性與交叉性第一節(jié)55（三）Ag-Ab的結(jié)合比例與“帶現(xiàn)象”Ag-Ab結(jié)合需有適當比例-----最適比，形成的結(jié)合物體積大、數(shù)量多，出現(xiàn)肉眼可見的反應。即Ag-Ab反應的等價帶。若Ag或Ab過多，比例不適，不能出現(xiàn)肉眼可見反應-----“帶現(xiàn)象”。Ab過剩---------前帶，Ag過剩--------后帶。第一節(jié)免疫學檢測（三）Ag-Ab的結(jié)合比例與“帶現(xiàn)象”第一節(jié)免疫學檢測56水產(chǎn)動物病原的檢測技術課件57二、影響Ag-Ab反應的主要因素1、電解質(zhì)：生理鹽水（0.85%NaCl）2、溫度：37℃，水產(chǎn)動物28～30℃

3、PH：6~8第一節(jié)免疫學檢測二、影響Ag-Ab反應的主要因素1、電解質(zhì)：生理鹽水（0.858三、免疫凝集試驗（凝集反應）

電解質(zhì)顆粒性Ag+相應Ab凝集小塊（凝集原）（凝集素）

反應種類敏感度直接凝集反應+間接凝集反應++間接凝集抑制試驗+++協(xié)同凝集試驗+++第一節(jié)免疫學檢測三、免疫凝集試驗（凝集反應）59（一）直接凝集試驗第一節(jié)免疫學檢測（一）直接凝集試驗第一節(jié)免疫學檢測60常用已知Ab測未知Ag?？捎糜诩毦蔫b定、ABO血型分型1、玻片法：定性反應陽性

反應陰性

第一節(jié)免疫學檢測常用已知Ab測未知Ag?？捎糜诩毦蔫b定、ABO血型分型1、612、試管法：定量

（測定抗體的效價）第一節(jié)免疫學檢測2、試管法：定量（測定抗體的效價）第一節(jié)免疫學檢測62（二）間接凝集試驗可溶性Ag吸附在載體表面+Ab→凝集（致敏顆粒）可用來檢測微量存在的Ab載體：紅細胞--------------------------間接血凝試驗聚苯乙烯乳膠顆粒-----------間接凝膠凝集試驗硫酸鋁、活性炭第一節(jié)免疫學檢測（二）間接凝集試驗第一節(jié)免疫學檢測63

載體可溶性Ag致敏顆粒

Ab致敏顆粒凝集

+→+→第一節(jié)免疫學檢測載體可溶性Ag致敏顆粒64（三）間接凝集抑制試驗可溶性Ag+相應Ab+相應致敏顆?！怀霈F(xiàn)致敏顆粒凝集可用來檢測可溶性Ag如：免疫妊娠診斷試驗：（1）診斷Ag：HCG致敏的乳膠顆粒（2）診斷血清：抗HCG的Ab（3）檢測標本：尿液（是否含有HCG）第一節(jié)免疫學檢測（三）間接凝集抑制試驗可溶性Ag+相應Ab+相應致敏65水產(chǎn)動物病原的檢測技術課件66（四）協(xié)同凝集試驗金黃色葡萄球菌細胞壁中的蛋白A（SPA）SPA+IgG→暴露Fab片段+相應Ag→協(xié)同凝集反應通常可用于檢測可能存在的微量抗原目前，已用于流腦、傷寒、布氏菌病的早期診斷第一節(jié)免疫學檢測（四）協(xié)同凝集試驗金黃色葡萄球菌細胞壁中的蛋白A（SPA）第67水產(chǎn)動物病原的檢測技術課件68四、免疫沉淀試驗（沉淀反應）可溶性抗原+抗體肉眼可見的沉淀（沉淀原）（沉淀素）第一節(jié)免疫學檢測電解質(zhì)四、免疫沉淀試驗（沉淀反應）可溶性抗原+抗體69（一）環(huán)狀沉淀試驗已知抗血清+待檢抗原液面交界處，白色環(huán)狀沉淀主要用于抗原的定性試驗，如細菌血清型鑒定等。

第一節(jié)免疫學檢測數(shù)分鐘（一）環(huán)狀沉淀試驗已知抗血清+待檢抗原70（二）瓊脂擴散試驗可溶性Ag+相應Ab白色沉淀線瓊脂擴散：雙向、單向瓊脂擴散+電泳技術：

對流電泳、火箭電泳、免疫電泳第一節(jié)免疫學檢測電解質(zhì)、瓊脂擴散（二）瓊脂擴散試驗可溶性Ag+相應Ab711、雙向瓊脂擴散單個Ag-Ab系統(tǒng)

多個Ag-Ab系統(tǒng)第一節(jié)免疫學檢測AgAbAbAg制成凝膠板——打孔——加入Ag、Ab1、雙向瓊脂擴散第一節(jié)免疫學檢測AgAbAbAg制成凝膠72水產(chǎn)動物病原的檢測技術課件73特點：敏感性不高，所需時間較長?？捎糜冢海?）定性檢測可溶性Ag或Ab。（2）對復雜的Ag、Ab的提取純度進行分析鑒定。第一節(jié)免疫學檢測第一節(jié)免疫學檢測742、單向瓊脂擴散將已知抗體與瓊脂混勻

特點：操作繁瑣第一節(jié)免疫學檢測2、單向瓊脂擴散第一節(jié)免疫學檢測753、對流電泳雙向瓊脂擴散+電泳技術試驗在裝有PH8.6緩沖液的電泳槽中進行。一+AgAb電滲力電場力第一節(jié)免疫學檢測特點：操作簡便，敏感性高，所需時間短。3、對流電泳一+AgAb電滲力電場力第一節(jié)免疫學檢測特點76水產(chǎn)動物病原的檢測技術課件774、火箭電泳單向瓊脂擴散+電泳緩沖液PH8.6第一節(jié)免疫學檢測+—4、火箭電泳第一節(jié)免疫學檢測+—78水產(chǎn)動物病原的檢測技術課件795、免疫電泳先電泳，再雙向瓊脂擴散

第一節(jié)免疫學檢測5、免疫電泳第一節(jié)免疫學檢測80本試驗樣品用量小，特異性高，分辨力強，主要用于血清蛋白及抗體成分的分析研究本試驗樣品用量小，特異性高，分辨力強，主要用于血清蛋白及抗體81

五、與補體相關的試驗（一）溶解試驗1、溶血試驗紅細胞與相應抗體（溶血素）結(jié)合，通過激活補體使紅細胞溶解2、溶菌試驗某些細菌與相應Ab結(jié)合，可激活補體，使細菌溶解（二）補體結(jié)合試驗（CFT）是一種在補體參與的條件下，以綿羊紅細胞和溶血素作為指示系統(tǒng)來測定有無相應抗原或抗體的血清學試驗。第一節(jié)免疫學檢測五、與補體相關的試驗（一）溶解試驗第一節(jié)免疫學檢測82AgAgAgAbAbAbCCCSRBCSRBCSRBCHHH__溶血（反應陰性）溶血（反應陰性）不溶血（反應陽性）待檢系統(tǒng)指示系統(tǒng)第一節(jié)免疫學檢測AgAgAgAbAbAbCCCSRBCSRBCSRBCHHH83六、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）Ag-Ab+酶→底物顯色→用酶標測定儀分析優(yōu)點：敏感性高，特異性強，可定性、定量。常用酶及底物：1、辣根過氧化物酶（HRP）底物：鄰苯二胺（OPD）-------------------黃色。四甲基聯(lián)苯胺（TMB）-------------金黃色。2、堿性磷酸酶（AP）底物：對硝基苯磷酸鹽（PNPP）---------黃色。第一節(jié)免疫學檢測六、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）第一節(jié)免疫學檢測84（一）直接法（二）間接法（三）雙抗體夾心法（四）抗原競爭法第一節(jié)免疫學檢測特異性高；敏感性低敏感性高；易非特異性吸附適用于含兩個以上表位的抗原適用于小分子抗原（一）直接法第一節(jié)免疫學檢測特異性高；敏感性低敏感性高；85（一）直接法抗原（抗體）+酶標抗體（抗原）第一節(jié)免疫學檢測（一）直接法第一節(jié)免疫學檢測86（二）間接法用已知Ag檢測未知Ab的效價。已知Ag吸附于載體洗滌加被檢血清，Ab與Ag結(jié)合洗滌加酶標二抗，使與Ag-Ab復合物結(jié)合。洗滌加底物顯色第一節(jié)免疫學檢測EEEEEE（二）間接法第一節(jié)免疫學檢測EE87酶標板第一節(jié)免疫學檢測酶標板第一節(jié)免疫學檢測88第一節(jié)免疫學檢測第一節(jié)免疫學檢測89（三）雙抗體夾心法用已知Ab檢測未知Ag。

已知Ab吸附于載體洗滌加可能含Ag的待檢溶液洗滌加酶標記Ab洗滌加底物EEEEEE第一節(jié)免疫學檢測（三）雙抗體夾心法EE第一節(jié)免疫學檢測90EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEE（1）已知Ab吸附于載體（2）a、加酶標記Ag，b、加酶標記Ag和可能含Ag的待檢溶液（3）

（3）b-（3）a=待檢溶液的Ag量。（四）抗原競爭法：用已知Ab檢測未知Ag（小分子抗原）EEEEEEEE91七、免疫熒光技術又稱熒光抗體技術。熒光素：異硫氰酸熒光素（FITC）----------------黃綠色熒光四乙基羅丹明（RB200）------------------橙色熒光四甲基異硫氰酸羅丹明（TMRITC）---橙紅色熒光第一節(jié)免疫學檢