第五組利用基因工程酵母生產(chǎn)抗瘧疾藥物前體-青蒿酸課件

第五組：利用基因工程酵母生產(chǎn)抗瘧疾藥物前體--青蒿酸

微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*第五組：利用基因工程酵母生產(chǎn)抗瘧疾藥物前體--青蒿酸

微生物1選用這篇文章的原因：符合微生物發(fā)酵的主題，且綜合分子生物學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等學(xué)科大部分為我們所學(xué)的知識(shí)：生化中的甲羥戊酸途徑；分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手段等等實(shí)驗(yàn)思路簡(jiǎn)單明了，充分體現(xiàn)對(duì)知識(shí)的靈活運(yùn)用實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響深刻，將會(huì)對(duì)瘧疾治療帶來(lái)一場(chǎng)革命微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*選用這篇文章的原因：符合微生物發(fā)酵的主題，且綜合分子生物學(xué)、2一、瘧疾俗稱“打擺子”，是一種由瘧原蟲(chóng)（瘧原蟲(chóng)屬，Plasmodiumspp.是一類單細(xì)胞真核生物，屬于細(xì)胞內(nèi)寄生蟲(chóng)）造成的，通過(guò)瘧蚊傳播的全球性急性寄生蟲(chóng)傳染病。

微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*一、瘧疾俗稱“打擺子”，是一種由瘧原蟲(chóng)（瘧原蟲(chóng)屬，Plasm3瘧原蟲(chóng)的生命周期很復(fù)雜。通過(guò)蚊子叮咬進(jìn)入宿主體內(nèi)後首先侵入肝臟細(xì)胞，再由肝臟進(jìn)入血液感染紅血球，在紅血球內(nèi)無(wú)性繁殖擴(kuò)增之後，受外部環(huán)境因素的影響，它們可以繼續(xù)感染新的紅血球，也可能形成配子體（gametocyte），當(dāng)蚊子吸取受感染的血液後，雄、雌配子體進(jìn)入蚊子胃內(nèi)發(fā)育成配子并進(jìn)行有性生殖，合子最終在胃壁下形成卵囊（oocyte）。卵囊中瘧原蟲(chóng)進(jìn)行無(wú)性繁殖，最終形成孢子體（sporozoite）進(jìn)入蚊子唾液腺，準(zhǔn)備感染新的脊椎動(dòng)物宿主。微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*瘧原蟲(chóng)的生命周期很復(fù)雜。通過(guò)蚊子叮咬進(jìn)入宿主體內(nèi)後首先侵入肝4瘧疾在年發(fā)病率不超過(guò)十萬(wàn)分之三的中國(guó)可能并不為人們關(guān)注，但是在非洲，平均每30秒就有一名兒童死于瘧疾。

世界范圍內(nèi)，僅是呈現(xiàn)臨床癥狀的患者病例每年就在3億到5億之間，而每年因患瘧疾而死亡的人數(shù)則則在一到三百萬(wàn)之間,這其中大部分為兒童。微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*瘧疾在年發(fā)病率不超過(guò)十萬(wàn)分之三的中國(guó)可能并不為人們關(guān)注5

由于傳播瘧疾的惡性瘧原蟲(chóng)（Plasmodium

falciparum）具有復(fù)雜的生命周期，因而很難根除這種疾病，治療是唯一的選擇。而抗藥瘧原蟲(chóng)突變系Plasmodiumfalciparum2,3的出現(xiàn)更嚴(yán)重阻礙了對(duì)這種疾病的控制。

而青蒿素，一種由我國(guó)學(xué)者在20世紀(jì)70年代初從ArtemisiaannuaL（菊科植物，俗稱青蒿）中提煉出來(lái)的倍半萜內(nèi)酯環(huán)內(nèi)過(guò)氧化物（C-15倍半萜），通過(guò)釋放高劑量的自由基殺死隱藏于紅細(xì)胞中的惡性瘧原蟲(chóng)。是目前世界上最有效的治療腦型瘧疾和抗氯喹惡性瘧疾的藥物，被世界衛(wèi)生組織稱為“治療瘧疾的最大希望”。二、青蒿素微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*由于傳播瘧疾的惡性瘧原蟲(chóng)（Plasmodium

falc6

人工合成青蒿素由于其工藝復(fù)雜、毒副作用大、成本高而不能投入生產(chǎn)。世界上青蒿素藥物的生產(chǎn)主要依靠我國(guó)從野生和栽培青蒿中直接提取。但是青蒿中青蒿素的含量很低(0.1%-1%

w/w),且受地域性種植影響較大。目前使用青蒿素進(jìn)行治療每個(gè)療程的費(fèi)用是８美元到１５美元，對(duì)于受瘧疾危害最深的非洲和南美地區(qū)的貧困患者來(lái)說(shuō)過(guò)于昂貴。

微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*

人工合成青蒿素由于其工藝復(fù)雜、毒副作用大、成本高而7

基于這些因素，科學(xué)家們開(kāi)始嘗試?yán)没蚬こ淌侄瓮ㄟ^(guò)微生物去合成這種物質(zhì)。這項(xiàng)工作被專門(mén)列為“青蒿素計(jì)劃”，由美國(guó)加利福尼亞大學(xué)伯克利分校的生化工程師Jay

Keasling主持，并且起初就獲得“比爾-梅琳達(dá)蓋茨基金會(huì)”4260

萬(wàn)美元的資助。

2006

年，Keasling

等宣布，通過(guò)合成生物學(xué)技術(shù)對(duì)一株酵母菌成功進(jìn)行遺傳工程改造，使得后者可以產(chǎn)生高水平的青蒿酸（artemisinic

acid）——青蒿素的一種直接的前體。

該成果發(fā)表于2006年4月13日英國(guó)《自然》雜志上，題為“Productionoftheantimalarialdrugprecursorartemisinicacidinengineeredyeast

”三、基因工程合成青蒿酸微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*基于這些因素，科學(xué)家們開(kāi)始嘗試?yán)没蚬こ淌侄瓮ㄟ^(guò)微8但是酵母的生長(zhǎng)代謝速率較青蒿要高出不知道多少倍，而且其培養(yǎng)條件容易控制，不受氣候、政治等因素的影響。因此，如果能用酵母生產(chǎn)青蒿酸，那將是非常高產(chǎn)、高效的。真核糖酵解甲羥戊酸途徑真核糖酵解甲羥戊酸途徑酵母與青蒿相比：微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*但是酵母的生長(zhǎng)代謝速率較青蒿要高出不知道多少倍，而且其培養(yǎng)條9研究人員已經(jīng)探明青蒿素是通過(guò)以下途徑在青蒿細(xì)胞內(nèi)合成的：焦磷酸法呢酯（FPP）Amorphadiene（合成青蒿酸及青蒿素的最直接的前體原料）青蒿酸青蒿素微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*研究人員已經(jīng)探明青蒿素是通過(guò)以下途徑在青蒿細(xì)胞內(nèi)合成的：焦磷10由于酵母也可以合成FPP，所以我們所需要做的只是將FPP到Amorphadiene再到青蒿酸這兩個(gè)過(guò)程克隆進(jìn)入酵母細(xì)胞內(nèi)，并對(duì)細(xì)胞內(nèi)的其他與之相關(guān)的基因進(jìn)行調(diào)控，使之能正常并且大量合成青蒿酸。

微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*由于酵母也可以合成FPP，所以我們所需要做的只是將FPP11為了將流程圖轉(zhuǎn)為現(xiàn)實(shí)，我們對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行了總共8次的基因工程改造。四具體流程微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*為了將流程圖轉(zhuǎn)為現(xiàn)實(shí)，我們對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行了總共8次的基因工程12

第一步，為了能讓酵母細(xì)胞合成Amorphadiene，我們將ADS基因插入由GAL1啟動(dòng)子控制轉(zhuǎn)錄的pRS425質(zhì)粒中，然后在酵母細(xì)胞中表達(dá)，結(jié)果顯示單獨(dú)轉(zhuǎn)入ADS基因的酵母只合成少量的amorphadiene。如圖中菌株EPY201，4.4mg/L。微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*

第一步，為了能讓酵母細(xì)胞合成Amorphadiene13而細(xì)胞中與amorphadiene的量最直接相關(guān)的就是FPP的量，所以，為了提高啤酒酵母合成amorphadiene的能力，我們對(duì)FPP合成途徑（甲羥戊酸合成途徑）進(jìn)行了總共5次的基因工程改造。

幾個(gè)與FPP合成相關(guān)的基因的表達(dá)被正調(diào)控，而另外幾個(gè)促使FPP轉(zhuǎn)變成固醇的基因被負(fù)調(diào)控。同時(shí)為了保證宿主菌株的遺傳穩(wěn)定性，所有這些對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行的修飾都是通過(guò)染色體融合進(jìn)行的

。具體過(guò)程如下：微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*而細(xì)胞中與amorphadiene的量最直接相關(guān)的14首先，將一種截短的水溶性酶3-羥基-3-甲基-戊二酰輔酶A還原酶（我們所學(xué)生化書(shū)中為譯為β-羥基-β-甲基-戊二酰輔酶A還原酶，簡(jiǎn)稱HMGCoA還原酶，又簡(jiǎn)稱tHMGR，是固醇合成的限速酶）過(guò)表達(dá)，可提高amorphadiene的合成產(chǎn)量近五倍（菌株EPY208）；

微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*首先，將一種截短的水溶性酶3-羥基-3-甲基-戊二酰輔酶A還15其次，利用一個(gè)methioninerepressible啟動(dòng)子(PMET3)，通過(guò)對(duì)編碼鯊稀合酶（固醇生物合成途徑中FPP合成后第一步）的ERG9基因進(jìn)行負(fù)調(diào)控，可將amorphadiene的合成量再增加兩倍（菌株EPY225）；

微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*其次，利用一個(gè)methioninerepressible啟動(dòng)16然后，盡管upc2-1,一個(gè)可以加強(qiáng)UPC２（啤酒酵母中調(diào)節(jié)固醇合成的一個(gè)的通用轉(zhuǎn)錄因子）活性的半顯性突變體等位基因，在已有菌株EPY208背景下過(guò)表達(dá)（菌株EPY210）對(duì)amorphadiene合成的提高起的作用并不顯著，但結(jié)合對(duì)ERG9基因的負(fù)調(diào)控，其過(guò)表達(dá)可將amorphadiene的合成量提高到105mg/L（菌株EPY213）；

微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*然后，盡管upc2-1,一個(gè)可以加強(qiáng)UPC２（啤酒酵母中調(diào)17再次，在酵母染色體更遠(yuǎn)處在轉(zhuǎn)進(jìn)一個(gè)tHMGR拷貝可以將將其合成量再增加50%達(dá)到149mg/L（菌株EPY219）；微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*再次，在酵母染色體更遠(yuǎn)處在轉(zhuǎn)進(jìn)一個(gè)tHMGR拷貝可以將將其合18最后，雖然編碼FPP合酶的基因（ERG20）過(guò)表達(dá)對(duì)amorphadiene合成總量（菌株EPY224）的提高效果非常小，但在細(xì)胞密度降低的情況下其合成量卻可增加10%。將所有這些對(duì)基因的修飾綜合在菌株EPY224上，amorphadiene的合成量已經(jīng)達(dá)到了153mg/L,是之前所報(bào)道這種倍半萜(烯)最大合成水平的幾乎500倍。微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*最后，雖然編碼FPP合酶的基因（ERG20）過(guò)表達(dá)對(duì)amor19現(xiàn)在我們已經(jīng)得到了可以高效合成amorphadiene的酵母菌株，但為能將amorphadiene轉(zhuǎn)變成青蒿酸，我們還需要找到并分離出青蒿中編碼催化amorphadiene轉(zhuǎn)變成青蒿酸的酶的基因。

青蒿素是一種倍半萜內(nèi)酯衍生物，這些衍生物在菊科植物中普遍存在，是一類十分有特性的細(xì)胞次級(jí)代謝產(chǎn)物。我們假定菊科植物在半倍半萜內(nèi)酯的合成的前幾步中利用的是源于同一祖先的合成酶，據(jù)此對(duì)菊科植物進(jìn)行了一次基因組比較分析。

微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*現(xiàn)在我們已經(jīng)得到了可以高效合成amorphadien20進(jìn)行基因組比較分析之前，我們先接觸兩個(gè)概念：1、細(xì)胞色素P450酶細(xì)胞色素P450同工酶是血紅蛋白超級(jí)家族，它是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上混合功能氧化酶系統(tǒng)的末端氧化酶。每個(gè)細(xì)胞色素P450同工酶由一個(gè)蛋白質(zhì)及一個(gè)血紅素基彌補(bǔ)部分組成。細(xì)胞色素P450酶系統(tǒng)催可催化很多反應(yīng)，包括環(huán)氧化反應(yīng)，N-去烷基化，O-去烷基化，S-氧化及脂肪族和芳香族殘基的羥化反應(yīng)。和所有的酶一樣，細(xì)胞色素P450同工酶呈飽和Michaelos-Meuten動(dòng)力學(xué)，其活性需要輔助因子，并可被誘導(dǎo)或抑制。系統(tǒng)命名：比如，CYP2家族有幾個(gè)亞家族，諸如CYP2C、CYP2D、CYP2E。數(shù)字代表不同的酶，如CYP2D6，基因同樣用CYP2D6表示。不論其來(lái)源或催化活性為何，這種命名法的優(yōu)點(diǎn)是很易識(shí)別結(jié)構(gòu)一致或高度相似的細(xì)胞色素P450酶。（CYP71AV1）微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*進(jìn)行基因組比較分析之前，我們先接觸兩個(gè)概念：1、細(xì)胞色素P4212、已表達(dá)序列標(biāo)志（EST）

EST是從一個(gè)隨機(jī)選擇的cDNA克隆進(jìn)行5’端和3’端單一次測(cè)序獲得的短的cDNA部分序列,代表一個(gè)完整基因的一小部分,EST來(lái)源于一定環(huán)境下一個(gè)組織總mRNA所構(gòu)建的cDNA文庫(kù)。

EST標(biāo)記在親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的物種間比較基因組連鎖圖和比較質(zhì)量性狀信息是特別有用。

EST是在隨機(jī)選擇并經(jīng)序列分析后分離得到的和（或）進(jìn)行了特性鑒定的核酸，當(dāng)確定EST片段的序列時(shí)尚不知道由之編碼的蛋白質(zhì)的功能。鑒定EST分子：首先確定部分序列信息并將其儲(chǔ)存在數(shù)據(jù)庫(kù)中；然后用該序列信息作為探針與數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。在有些情況下，經(jīng)過(guò)這種同源性檢索可以在核苷酸序列水平上揭示出與編碼已知功能蛋白質(zhì)的另一種核酸相關(guān)的特定EST序列。最后，選擇這樣的EST分子并進(jìn)一步分析之。

微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*2、已表達(dá)序列標(biāo)志（EST）

EST是從一個(gè)隨機(jī)選擇的c22進(jìn)行基因組比較分析的已知條件：知道是一種特異的細(xì)胞色素P450酶對(duì)amorphadiene進(jìn)行專一性羥化（先前已經(jīng)有文章報(bào)道），但其基因未知，我們目的就是要找到其編碼基因假定菊科植物在半倍萜內(nèi)酯的合成的前幾步中利用的是源于同一祖先的合成酶知道菊科植物的已表達(dá)序列標(biāo)志（EST）數(shù)據(jù)庫(kù)（由向日葵和萵苣這兩種菊科作物提供的基因數(shù)據(jù)構(gòu)建，從中檢索得到細(xì)胞色素P450已表達(dá)序列標(biāo)志（ESTs)擁有針對(duì)CYP71和CYP82家族（P450酶在菊科植物中最多的兩個(gè)家族，其序列已知）高度特異的簡(jiǎn)并引物那么怎么通過(guò)對(duì)已知條件的運(yùn)用才可以得到青蒿中這種特異的細(xì)胞色素P450基因呢？微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*進(jìn)行基因組比較分析的已知條件：知道是一種特異的細(xì)胞色素P4523步驟如下：高度特異的簡(jiǎn)并引物青蒿毛狀體細(xì)胞的互補(bǔ)DNA庫(kù)＋PCR、凝膠電泳回收等幾個(gè)特定的p450片段一個(gè)青蒿P450基因片段與之對(duì)應(yīng)的mRNA完整P450cDNA（CYP71AV1）

RT-PCR

轉(zhuǎn)錄BLAST分析法將這些片段與向日葵和萵苣的ESTｓ比對(duì)，我們驚奇地發(fā)現(xiàn)有一個(gè)青蒿P450基因片段與來(lái)自以上兩種植物的未知功能ESTs序列非常相似微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*步驟如下：高度特異的簡(jiǎn)并引物青蒿毛狀體細(xì)胞的互補(bǔ)DNA庫(kù)＋P24經(jīng)過(guò)BLAST分析篩選出的那個(gè)青蒿P450基因片段與來(lái)自以上兩種植物的未知功能ESTs序列非常相似（氨基酸水平上達(dá)相似度達(dá)85-88%），而同其他非菊科植物的P450序列相似度較低（氨基酸水平上小于50%）。這表明相對(duì)于非菊科植物，P450基因在這三個(gè)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的菊科植物屬中是高度保守的。

隨后相應(yīng)的完整P450cDNA（CYP71AV1），一個(gè)編碼495個(gè)氨基酸的開(kāi)放閱讀框，成功從青蒿中分離獲得。微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*經(jīng)過(guò)BLAST分析篩選出的那個(gè)青蒿P450基因片段與來(lái)自25

為了保證異源表達(dá)的CYP71AV1可以發(fā)揮正常功能，協(xié)同它進(jìn)行氧化還原反應(yīng)的天然配體，NADPH：細(xì)胞色素P450氧化還原酶（CPR），同樣從青蒿中成功分離，并且其生化活性已經(jīng)在體外被證實(shí)。微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*

為了保證異源表達(dá)的CYP71AV1可以發(fā)揮正常功能26

1、體內(nèi)表達(dá)GC-MS檢測(cè)：在配體分子CPR的參與下，我們分別在活細(xì)胞體內(nèi)和體外研究了CYP71AV1是否可以催化amorphadiene轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗉?jí)氧化產(chǎn)物。微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*1、體內(nèi)表達(dá)GC-MS檢測(cè)：在配體分子CPR的參與下27

分析結(jié)果顯示：幾乎95%的這種特異化合物是來(lái)源于細(xì)胞體的。而且這種化合物的電子碰撞質(zhì)譜和保留時(shí)間與從青蒿中提取的青蒿酸的完全吻合。微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*分析結(jié)果顯示：幾乎95%的這種特異化合物是來(lái)源于細(xì)胞體的28在搖瓶培養(yǎng)條件下，同時(shí)表達(dá)CYP71AV1和CPR的EPY224菌株青蒿酸產(chǎn)量為32±13mg/L(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差,n＝7)。更為重要的是，其中間代謝產(chǎn)物，青蒿醇和青蒿醛在細(xì)胞體和培養(yǎng)基中被檢測(cè)到的量幾乎可以忽略（青蒿醇的量比青蒿素酸的5%還少，并且根本沒(méi)有青蒿醛被檢測(cè)出）。微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*在搖瓶培養(yǎng)條件下，同時(shí)表達(dá)CYP71AV1和CPR的E29從啤酒酵母菌株YPH499中分離微體，這些微體僅表達(dá)CPR（對(duì)照組）或者同時(shí)表達(dá)CPR和CYP71AV1。將微體在不同的合成途徑中間體（amorphadiene，青蒿醇，青蒿醛）條件下進(jìn)行培養(yǎng)。2、體外酶法檢測(cè)：微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*從啤酒酵母菌株YPH499中分離微體，這些微體僅表達(dá)CP30

a-c．每一種酶的測(cè)定分別加入

（a）10μMamorphadiene，

（b）25μM青蒿醇

（c）25μM青蒿醛。

底物的色譜峰用星號(hào)標(biāo)出。醚提取物經(jīng)過(guò)衍生，并用GC-MS在不同的粒子模式下分析（mlz：121，189，204，218，220和248）。酶反應(yīng)的產(chǎn)物按照預(yù)期得到：1，青蒿醇（保留時(shí)間13.20分鐘）；2，青蒿醛（保留時(shí)間11.79分鐘）；3，青蒿酸（保留時(shí)間13.58分鐘，甲酯化后檢測(cè)）

微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*

a-c．每一種酶的測(cè)定分別加入

（a）10μMam31

雖然先前已經(jīng)有報(bào)道，使用青蒿蛋白提取物的體外酶法測(cè)定證明可溶性的醇醛脫氫酶和一種C11，13雙鍵還原酶（作用于醛）參與青蒿素的生物合成。我們不排除在青蒿中存在其他的醇醛脫氫酶參與的催化反應(yīng)，但是體外實(shí)驗(yàn)中重組的CYP71AV1將amorpha-4,11-diene高效轉(zhuǎn)化為青蒿酸，完全顯示出膜結(jié)合、多功能的CYP71AV1是青蒿素的生物合成中的關(guān)鍵促成因素。微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*

雖然先前已經(jīng)有報(bào)道，使用青蒿蛋白提取物的體外酶法測(cè)32我們證實(shí)，通過(guò)用堿性緩沖液（pH為9的Tris-HCL緩沖液中添加1.2M的山梨醇）清洗胞體沉淀物，絕大部分合成的青蒿酸（>96%）可以而被分離出，而且沖洗之后細(xì)胞體和培養(yǎng)基中的殘留量?jī)H為2%。青蒿酸不僅可以被高效的轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外，且在酸性條件下經(jīng)過(guò)質(zhì)子化后會(huì)被束縛在細(xì)胞表面。

五、提純微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*我們證實(shí)，通過(guò)用堿性緩沖液（pH為9的Tris-HCL緩33利用這個(gè)特點(diǎn)制定了一種便捷提純方法：混合培養(yǎng)物細(xì)胞體沉淀物堿性清洗緩沖液凝膠柱層析純度大于95%的青蒿酸HCL調(diào)pH醚抽提抽提產(chǎn)物微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*利用這個(gè)特點(diǎn)制定了一種便捷提純方法：混合培養(yǎng)物細(xì)胞體沉淀物堿34在一個(gè)一升發(fā)酵罐中，青蒿酸的產(chǎn)量為115mg，而通這種方法的，我們可以得到76mg的提純產(chǎn)物。最重要的是，經(jīng)1Hand13C原子核磁共振檢測(cè)顯示，這種酵母合成青蒿酸與從青蒿中直接提取的青蒿酸分子結(jié)構(gòu)完全一樣。因此，可以確定我們所得到的這株轉(zhuǎn)基因酵母能夠直接合成結(jié)構(gòu)功能上完全正確的青蒿酸。

微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*在一個(gè)一升發(fā)酵罐中，青蒿酸的產(chǎn)量為115mg，而通這種方35轉(zhuǎn)基因酵母在生產(chǎn)青蒿酸時(shí)需要的生物量與青蒿相比：

青蒿素（酸）含量胞體干重4.5%地上部分干重0.16%培養(yǎng)時(shí)間4-5天數(shù)月提純方法簡(jiǎn)單復(fù)雜總之，轉(zhuǎn)基因酵母菌珠的單位生產(chǎn)效率比青蒿高了近兩個(gè)數(shù)量級(jí)。微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*轉(zhuǎn)基因酵母在生產(chǎn)青蒿酸時(shí)需要的生物量與青蒿相比：

青蒿素36總的來(lái)說(shuō)，我們采用改造FPP生物合成途徑的方法獲得了能高水平生產(chǎn)青蒿酸的啤酒酵母菌株。該方法通過(guò)表達(dá)amorphadiene合成酶，一種新型的細(xì)胞色素P450和與之相關(guān)的來(lái)自青蒿的氧化還原酶來(lái)提高FPP的產(chǎn)量。據(jù)了解，相關(guān)轉(zhuǎn)化青蒿酸到青蒿素或其他派生物的化學(xué)方法可能還有許多待改進(jìn)之處，但微生物法生產(chǎn)青蒿酸是獲得此類高效抗瘧疾藥物切實(shí)可行的方法。

微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*總的來(lái)說(shuō)，我們采用改造FPP生物合成途徑的方法獲得了能高37六、實(shí)驗(yàn)方法：１、化學(xué)和植物材料：青蒿酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)買(mǎi)于ApinChemicals公司或者直接用己烷從青蒿葉片萃取。青蒿植株被栽培在加州大學(xué)伯克利分校的溫室當(dāng)中，并且都是從種子開(kāi)始培育的。2、GC—MS法分析Amorphadiene：用GC—MS對(duì)不同株系的啤酒酵母的Amorphadiene合成量進(jìn)行測(cè)定，使用十二烷阻止Amorphadiene的揮發(fā)。為了定量衡量Amorphadiene產(chǎn)量水平，用于測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的Amorphadiene（90%純）是通過(guò)大腸桿菌菌株發(fā)酵制備的。微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*六、實(shí)驗(yàn)方法：１、化學(xué)和植物材料：青蒿酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)買(mǎi)于Apin383、青蒿酸的胞內(nèi)發(fā)酵，純化及化學(xué)分析：將經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)的在600nm（A600）下吸光度達(dá)到0.05的EPY224菌株（已經(jīng)被轉(zhuǎn)入pESCURA::CPR或者pESCURA::CPR/CYP71AV1）接種到25ml合成培養(yǎng)基中。該培養(yǎng)基不含組氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和尿嘧啶，但是添加有0.2%的葡萄糖、1.8%的半乳糖以及1mMol定量的甲硫氨酸。300C下恒溫培養(yǎng)120小時(shí)，然后將培養(yǎng)混合物進(jìn)行離心，留下細(xì)胞體。再用50mMTris-HCl緩沖液（pH9.0）沖洗細(xì)胞體，加入2M的HCl將緩沖液的pH調(diào)至2.0，用混入4-烷基苯甲酸（10ug/ml）的乙酸乙酯進(jìn)行萃取。萃取餾分經(jīng)50ul2M的四甲基硅烷-重氮甲烷和10%的甲醇衍生。在進(jìn)行GC-MS分析前，產(chǎn)物還要經(jīng)過(guò)以（1：1）的醚和戊烷為洗脫劑的凝膠色譜提純。微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*3、青蒿酸的胞內(nèi)發(fā)酵，純化及化學(xué)分析：將經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)的在60039最后，提純的產(chǎn)物經(jīng)氣相色譜質(zhì)譜儀（70eV，AgilentTechnologies）分析，毛細(xì)管柱為DB5（0.25毫米內(nèi)徑×0.25μ×30m，J&WScientific）。氣相色譜的加熱程序從80℃（保持2分鐘），以每分鐘20℃的梯度遞增到140℃。產(chǎn)品分離時(shí)由5℃/min的速度增加到220℃。采用火焰電離色譜檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)為了定量，沒(méi)有使用相同的氣相加熱程序?qū)χ舆M(jìn)行凈化。微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*最后，提純的產(chǎn)物經(jīng)氣相色譜質(zhì)譜儀（70eV，Agile404、發(fā)酵及產(chǎn)物的核磁共振分析:使用1升的生物反應(yīng)器（New-BrunswickScientific），在30℃的條件下，培養(yǎng)酵母菌93個(gè)小時(shí)。2%的半乳糖的誘導(dǎo)酵母細(xì)胞，600nm下測(cè)OD值為1.7，最終的細(xì)胞濃度OD值A(chǔ)600達(dá)到5.0。攪拌速度從100rmp變到500rmp，每分鐘通氧0.5L，使得溶氧量始終保持在40%，青蒿酸使用堿洗的方法從細(xì)胞沉淀物中提取出來(lái)，再使用含有78%的己烷，20%的乙酸乙酯和2%的乙酸的硅膠管柱提純。分離得到的青蒿酸（純度大于95%）的結(jié)構(gòu)采用CollegeofChemistryNMRFacilityattheUniversityofCalifornia提供的1H和13CNMR500MHz核磁共振儀進(jìn)行分析。微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*4、發(fā)酵及產(chǎn)物的核磁共振分析:使用1升的生物反應(yīng)器（New-415、體外酶法測(cè)定:用重組質(zhì)粒pESCURA::CPR或者pESCURA::CPR/CYP71AV1與1升的啤酒酵母YPH499培養(yǎng)物，加入2%的半乳糖轉(zhuǎn)化24小時(shí)。微體使用聚乙二醇法沉淀，然后超高速離心去除前面提到的細(xì)胞里的蛋白質(zhì)雜質(zhì)。取大約500μg的微體蛋白，100mMpH7.5的磷酸加緩沖液,10或者25μM的培養(yǎng)基，100μMNADPH和一個(gè)NADPH的重建體系（5mM葡萄糖-6-磷酸和2個(gè)單位的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶）。反應(yīng)在24℃下輕微攪拌作用24小時(shí)。反應(yīng)完成之后加酸至pH為2，然后使用乙醚抽提。產(chǎn)物采用與上面所述相同的氣相加熱程序。使用包含了相對(duì)于產(chǎn)物典型的六種離子（121，189，204，220和248）的固定離子檢測(cè)（SIM）法進(jìn)行檢測(cè)。微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*5、體外酶法測(cè)定:用重組質(zhì)粒pESCURA::CPR或者pE42

七、本實(shí)驗(yàn)的意義：保守分析證明，在使產(chǎn)品效價(jià)最優(yōu)化的情況下，青蒿素結(jié)合治療法將會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)降低于現(xiàn)在用于瘧疾治療的價(jià)格。這種生物合成方法不會(huì)受到像天氣和政治氣候等因素的影響，但這些因素可能會(huì)對(duì)植物的培育造成影響。從微生物里得到的青蒿酸可以采用對(duì)環(huán)境友好的方式提取，而不用擔(dān)心像植物能夠產(chǎn)生其他的萜烯致使產(chǎn)物受到污染，從而減少純化的費(fèi)用。微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*七、本43轉(zhuǎn)化的真菌除了用于治療瘧疾以外，也可以用來(lái)對(duì)抗其他疾病?；蚋牧嫉木赀€可被轉(zhuǎn)化用來(lái)生產(chǎn)其他類異戊二烯類化學(xué)物質(zhì)，只要以對(duì)工程菌做稍許的改變，加入任何數(shù)量感興趣的與化學(xué)物合成有關(guān)的植物基因，幾乎可得到任何一種類異戊二烯物質(zhì)，包括像調(diào)味薄荷醇、類胡蘿卜素（可對(duì)抗紫外線損傷）和紫杉醇（從太平洋紫杉所提煉的一種抗癌藥）。

微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*轉(zhuǎn)化的真菌除了用于治療瘧疾以外，也可以用來(lái)對(duì)抗其他疾病?；?4盡管這種基因工程酵母合成青蒿酸的能力相對(duì)于青蒿來(lái)說(shuō)已經(jīng)十分顯著，仍需急切解決問(wèn)題的是如何提高其生產(chǎn)效率從而擴(kuò)大至工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)，以便可以生產(chǎn)出足夠多的青蒿酸來(lái)降低現(xiàn)有青蒿素的價(jià)格，讓青蒿素綜合療法可以廣泛地被應(yīng)用到對(duì)瘧疾的治療中去。

微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*盡管這種基因工程酵母合成青蒿酸的能力相對(duì)于青蒿來(lái)45微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*46第五組：利用基因工程酵母生產(chǎn)抗瘧疾藥物前體--青蒿酸

微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*第五組：利用基因工程酵母生產(chǎn)抗瘧疾藥物前體--青蒿酸

微生物47選用這篇文章的原因：符合微生物發(fā)酵的主題，且綜合分子生物學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等學(xué)科大部分為我們所學(xué)的知識(shí)：生化中的甲羥戊酸途徑；分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手段等等實(shí)驗(yàn)思路簡(jiǎn)單明了，充分體現(xiàn)對(duì)知識(shí)的靈活運(yùn)用實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響深刻，將會(huì)對(duì)瘧疾治療帶來(lái)一場(chǎng)革命微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*選用這篇文章的原因：符合微生物發(fā)酵的主題，且綜合分子生物學(xué)、48一、瘧疾俗稱“打擺子”，是一種由瘧原蟲(chóng)（瘧原蟲(chóng)屬，Plasmodiumspp.是一類單細(xì)胞真核生物，屬于細(xì)胞內(nèi)寄生蟲(chóng)）造成的，通過(guò)瘧蚊傳播的全球性急性寄生蟲(chóng)傳染病。

微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*一、瘧疾俗稱“打擺子”，是一種由瘧原蟲(chóng)（瘧原蟲(chóng)屬，Plasm49瘧原蟲(chóng)的生命周期很復(fù)雜。通過(guò)蚊子叮咬進(jìn)入宿主體內(nèi)後首先侵入肝臟細(xì)胞，再由肝臟進(jìn)入血液感染紅血球，在紅血球內(nèi)無(wú)性繁殖擴(kuò)增之後，受外部環(huán)境因素的影響，它們可以繼續(xù)感染新的紅血球，也可能形成配子體（gametocyte），當(dāng)蚊子吸取受感染的血液後，雄、雌配子體進(jìn)入蚊子胃內(nèi)發(fā)育成配子并進(jìn)行有性生殖，合子最終在胃壁下形成卵囊（oocyte）。卵囊中瘧原蟲(chóng)進(jìn)行無(wú)性繁殖，最終形成孢子體（sporozoite）進(jìn)入蚊子唾液腺，準(zhǔn)備感染新的脊椎動(dòng)物宿主。微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*瘧原蟲(chóng)的生命周期很復(fù)雜。通過(guò)蚊子叮咬進(jìn)入宿主體內(nèi)後首先侵入肝50瘧疾在年發(fā)病率不超過(guò)十萬(wàn)分之三的中國(guó)可能并不為人們關(guān)注，但是在非洲，平均每30秒就有一名兒童死于瘧疾。

世界范圍內(nèi)，僅是呈現(xiàn)臨床癥狀的患者病例每年就在3億到5億之間，而每年因患瘧疾而死亡的人數(shù)則則在一到三百萬(wàn)之間,這其中大部分為兒童。微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*瘧疾在年發(fā)病率不超過(guò)十萬(wàn)分之三的中國(guó)可能并不為人們關(guān)注51

由于傳播瘧疾的惡性瘧原蟲(chóng)（Plasmodium

falciparum）具有復(fù)雜的生命周期，因而很難根除這種疾病，治療是唯一的選擇。而抗藥瘧原蟲(chóng)突變系Plasmodiumfalciparum2,3的出現(xiàn)更嚴(yán)重阻礙了對(duì)這種疾病的控制。

而青蒿素，一種由我國(guó)學(xué)者在20世紀(jì)70年代初從ArtemisiaannuaL（菊科植物，俗稱青蒿）中提煉出來(lái)的倍半萜內(nèi)酯環(huán)內(nèi)過(guò)氧化物（C-15倍半萜），通過(guò)釋放高劑量的自由基殺死隱藏于紅細(xì)胞中的惡性瘧原蟲(chóng)。是目前世界上最有效的治療腦型瘧疾和抗氯喹惡性瘧疾的藥物，被世界衛(wèi)生組織稱為“治療瘧疾的最大希望”。二、青蒿素微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*由于傳播瘧疾的惡性瘧原蟲(chóng)（Plasmodium

falc52

人工合成青蒿素由于其工藝復(fù)雜、毒副作用大、成本高而不能投入生產(chǎn)。世界上青蒿素藥物的生產(chǎn)主要依靠我國(guó)從野生和栽培青蒿中直接提取。但是青蒿中青蒿素的含量很低(0.1%-1%

w/w),且受地域性種植影響較大。目前使用青蒿素進(jìn)行治療每個(gè)療程的費(fèi)用是８美元到１５美元，對(duì)于受瘧疾危害最深的非洲和南美地區(qū)的貧困患者來(lái)說(shuō)過(guò)于昂貴。

微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*

人工合成青蒿素由于其工藝復(fù)雜、毒副作用大、成本高而53

基于這些因素，科學(xué)家們開(kāi)始嘗試?yán)没蚬こ淌侄瓮ㄟ^(guò)微生物去合成這種物質(zhì)。這項(xiàng)工作被專門(mén)列為“青蒿素計(jì)劃”，由美國(guó)加利福尼亞大學(xué)伯克利分校的生化工程師Jay

Keasling主持，并且起初就獲得“比爾-梅琳達(dá)蓋茨基金會(huì)”4260

萬(wàn)美元的資助。

2006

年，Keasling

等宣布，通過(guò)合成生物學(xué)技術(shù)對(duì)一株酵母菌成功進(jìn)行遺傳工程改造，使得后者可以產(chǎn)生高水平的青蒿酸（artemisinic

acid）——青蒿素的一種直接的前體。

該成果發(fā)表于2006年4月13日英國(guó)《自然》雜志上，題為“Productionoftheantimalarialdrugprecursorartemisinicacidinengineeredyeast

”三、基因工程合成青蒿酸微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*基于這些因素，科學(xué)家們開(kāi)始嘗試?yán)没蚬こ淌侄瓮ㄟ^(guò)微54但是酵母的生長(zhǎng)代謝速率較青蒿要高出不知道多少倍，而且其培養(yǎng)條件容易控制，不受氣候、政治等因素的影響。因此，如果能用酵母生產(chǎn)青蒿酸，那將是非常高產(chǎn)、高效的。真核糖酵解甲羥戊酸途徑真核糖酵解甲羥戊酸途徑酵母與青蒿相比：微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*但是酵母的生長(zhǎng)代謝速率較青蒿要高出不知道多少倍，而且其培養(yǎng)條55研究人員已經(jīng)探明青蒿素是通過(guò)以下途徑在青蒿細(xì)胞內(nèi)合成的：焦磷酸法呢酯（FPP）Amorphadiene（合成青蒿酸及青蒿素的最直接的前體原料）青蒿酸青蒿素微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*研究人員已經(jīng)探明青蒿素是通過(guò)以下途徑在青蒿細(xì)胞內(nèi)合成的：焦磷56由于酵母也可以合成FPP，所以我們所需要做的只是將FPP到Amorphadiene再到青蒿酸這兩個(gè)過(guò)程克隆進(jìn)入酵母細(xì)胞內(nèi)，并對(duì)細(xì)胞內(nèi)的其他與之相關(guān)的基因進(jìn)行調(diào)控，使之能正常并且大量合成青蒿酸。

微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*由于酵母也可以合成FPP，所以我們所需要做的只是將FPP57為了將流程圖轉(zhuǎn)為現(xiàn)實(shí)，我們對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行了總共8次的基因工程改造。四具體流程微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*為了將流程圖轉(zhuǎn)為現(xiàn)實(shí)，我們對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行了總共8次的基因工程58

第一步，為了能讓酵母細(xì)胞合成Amorphadiene，我們將ADS基因插入由GAL1啟動(dòng)子控制轉(zhuǎn)錄的pRS425質(zhì)粒中，然后在酵母細(xì)胞中表達(dá)，結(jié)果顯示單獨(dú)轉(zhuǎn)入ADS基因的酵母只合成少量的amorphadiene。如圖中菌株EPY201，4.4mg/L。微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*

第一步，為了能讓酵母細(xì)胞合成Amorphadiene59而細(xì)胞中與amorphadiene的量最直接相關(guān)的就是FPP的量，所以，為了提高啤酒酵母合成amorphadiene的能力，我們對(duì)FPP合成途徑（甲羥戊酸合成途徑）進(jìn)行了總共5次的基因工程改造。

幾個(gè)與FPP合成相關(guān)的基因的表達(dá)被正調(diào)控，而另外幾個(gè)促使FPP轉(zhuǎn)變成固醇的基因被負(fù)調(diào)控。同時(shí)為了保證宿主菌株的遺傳穩(wěn)定性，所有這些對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行的修飾都是通過(guò)染色體融合進(jìn)行的

。具體過(guò)程如下：微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*而細(xì)胞中與amorphadiene的量最直接相關(guān)的60首先，將一種截短的水溶性酶3-羥基-3-甲基-戊二酰輔酶A還原酶（我們所學(xué)生化書(shū)中為譯為β-羥基-β-甲基-戊二酰輔酶A還原酶，簡(jiǎn)稱HMGCoA還原酶，又簡(jiǎn)稱tHMGR，是固醇合成的限速酶）過(guò)表達(dá)，可提高amorphadiene的合成產(chǎn)量近五倍（菌株EPY208）；

微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*首先，將一種截短的水溶性酶3-羥基-3-甲基-戊二酰輔酶A還61其次，利用一個(gè)methioninerepressible啟動(dòng)子(PMET3)，通過(guò)對(duì)編碼鯊稀合酶（固醇生物合成途徑中FPP合成后第一步）的ERG9基因進(jìn)行負(fù)調(diào)控，可將amorphadiene的合成量再增加兩倍（菌株EPY225）；

微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*其次，利用一個(gè)methioninerepressible啟動(dòng)62然后，盡管upc2-1,一個(gè)可以加強(qiáng)UPC２（啤酒酵母中調(diào)節(jié)固醇合成的一個(gè)的通用轉(zhuǎn)錄因子）活性的半顯性突變體等位基因，在已有菌株EPY208背景下過(guò)表達(dá)（菌株EPY210）對(duì)amorphadiene合成的提高起的作用并不顯著，但結(jié)合對(duì)ERG9基因的負(fù)調(diào)控，其過(guò)表達(dá)可將amorphadiene的合成量提高到105mg/L（菌株EPY213）；

微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*然后，盡管upc2-1,一個(gè)可以加強(qiáng)UPC２（啤酒酵母中調(diào)63再次，在酵母染色體更遠(yuǎn)處在轉(zhuǎn)進(jìn)一個(gè)tHMGR拷貝可以將將其合成量再增加50%達(dá)到149mg/L（菌株EPY219）；微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*再次，在酵母染色體更遠(yuǎn)處在轉(zhuǎn)進(jìn)一個(gè)tHMGR拷貝可以將將其合64最后，雖然編碼FPP合酶的基因（ERG20）過(guò)表達(dá)對(duì)amorphadiene合成總量（菌株EPY224）的提高效果非常小，但在細(xì)胞密度降低的情況下其合成量卻可增加10%。將所有這些對(duì)基因的修飾綜合在菌株EPY224上，amorphadiene的合成量已經(jīng)達(dá)到了153mg/L,是之前所報(bào)道這種倍半萜(烯)最大合成水平的幾乎500倍。微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*最后，雖然編碼FPP合酶的基因（ERG20）過(guò)表達(dá)對(duì)amor65現(xiàn)在我們已經(jīng)得到了可以高效合成amorphadiene的酵母菌株，但為能將amorphadiene轉(zhuǎn)變成青蒿酸，我們還需要找到并分離出青蒿中編碼催化amorphadiene轉(zhuǎn)變成青蒿酸的酶的基因。

青蒿素是一種倍半萜內(nèi)酯衍生物，這些衍生物在菊科植物中普遍存在，是一類十分有特性的細(xì)胞次級(jí)代謝產(chǎn)物。我們假定菊科植物在半倍半萜內(nèi)酯的合成的前幾步中利用的是源于同一祖先的合成酶，據(jù)此對(duì)菊科植物進(jìn)行了一次基因組比較分析。

微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*現(xiàn)在我們已經(jīng)得到了可以高效合成amorphadien66進(jìn)行基因組比較分析之前，我們先接觸兩個(gè)概念：1、細(xì)胞色素P450酶細(xì)胞色素P450同工酶是血紅蛋白超級(jí)家族，它是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上混合功能氧化酶系統(tǒng)的末端氧化酶。每個(gè)細(xì)胞色素P450同工酶由一個(gè)蛋白質(zhì)及一個(gè)血紅素基彌補(bǔ)部分組成。細(xì)胞色素P450酶系統(tǒng)催可催化很多反應(yīng)，包括環(huán)氧化反應(yīng)，N-去烷基化，O-去烷基化，S-氧化及脂肪族和芳香族殘基的羥化反應(yīng)。和所有的酶一樣，細(xì)胞色素P450同工酶呈飽和Michaelos-Meuten動(dòng)力學(xué)，其活性需要輔助因子，并可被誘導(dǎo)或抑制。系統(tǒng)命名：比如，CYP2家族有幾個(gè)亞家族，諸如CYP2C、CYP2D、CYP2E。數(shù)字代表不同的酶，如CYP2D6，基因同樣用CYP2D6表示。不論其來(lái)源或催化活性為何，這種命名法的優(yōu)點(diǎn)是很易識(shí)別結(jié)構(gòu)一致或高度相似的細(xì)胞色素P450酶。（CYP71AV1）微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*進(jìn)行基因組比較分析之前，我們先接觸兩個(gè)概念：1、細(xì)胞色素P4672、已表達(dá)序列標(biāo)志（EST）

EST是從一個(gè)隨機(jī)選擇的cDNA克隆進(jìn)行5’端和3’端單一次測(cè)序獲得的短的cDNA部分序列,代表一個(gè)完整基因的一小部分,EST來(lái)源于一定環(huán)境下一個(gè)組織總mRNA所構(gòu)建的cDNA文庫(kù)。

EST標(biāo)記在親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的物種間比較基因組連鎖圖和比較質(zhì)量性狀信息是特別有用。

EST是在隨機(jī)選擇并經(jīng)序列分析后分離得到的和（或）進(jìn)行了特性鑒定的核酸，當(dāng)確定EST片段的序列時(shí)尚不知道由之編碼的蛋白質(zhì)的功能。鑒定EST分子：首先確定部分序列信息并將其儲(chǔ)存在數(shù)據(jù)庫(kù)中；然后用該序列信息作為探針與數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。在有些情況下，經(jīng)過(guò)這種同源性檢索可以在核苷酸序列水平上揭示出與編碼已知功能蛋白質(zhì)的另一種核酸相關(guān)的特定EST序列。最后，選擇這樣的EST分子并進(jìn)一步分析之。

微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*2、已表達(dá)序列標(biāo)志（EST）

EST是從一個(gè)隨機(jī)選擇的c68進(jìn)行基因組比較分析的已知條件：知道是一種特異的細(xì)胞色素P450酶對(duì)amorphadiene進(jìn)行專一性羥化（先前已經(jīng)有文章報(bào)道），但其基因未知，我們目的就是要找到其編碼基因假定菊科植物在半倍萜內(nèi)酯的合成的前幾步中利用的是源于同一祖先的合成酶知道菊科植物的已表達(dá)序列標(biāo)志（EST）數(shù)據(jù)庫(kù)（由向日葵和萵苣這兩種菊科作物提供的基因數(shù)據(jù)構(gòu)建，從中檢索得到細(xì)胞色素P450已表達(dá)序列標(biāo)志（ESTs)擁有針對(duì)CYP71和CYP82家族（P450酶在菊科植物中最多的兩個(gè)家族，其序列已知）高度特異的簡(jiǎn)并引物那么怎么通過(guò)對(duì)已知條件的運(yùn)用才可以得到青蒿中這種特異的細(xì)胞色素P450基因呢？微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*進(jìn)行基因組比較分析的已知條件：知道是一種特異的細(xì)胞色素P4569步驟如下：高度特異的簡(jiǎn)并引物青蒿毛狀體細(xì)胞的互補(bǔ)DNA庫(kù)＋PCR、凝膠電泳回收等幾個(gè)特定的p450片段一個(gè)青蒿P450基因片段與之對(duì)應(yīng)的mRNA完整P450cDNA（CYP71AV1）

RT-PCR

轉(zhuǎn)錄BLAST分析法將這些片段與向日葵和萵苣的ESTｓ比對(duì)，我們驚奇地發(fā)現(xiàn)有一個(gè)青蒿P450基因片段與來(lái)自以上兩種植物的未知功能ESTs序列非常相似微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*步驟如下：高度特異的簡(jiǎn)并引物青蒿毛狀體細(xì)胞的互補(bǔ)DNA庫(kù)＋P70經(jīng)過(guò)BLAST分析篩選出的那個(gè)青蒿P450基因片段與來(lái)自以上兩種植物的未知功能ESTs序列非常相似（氨基酸水平上達(dá)相似度達(dá)85-88%），而同其他非菊科植物的P450序列相似度較低（氨基酸水平上小于50%）。這表明相對(duì)于非菊科植物，P450基因在這三個(gè)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的菊科植物屬中是高度保守的。

隨后相應(yīng)的完整P450cDNA（CYP71AV1），一個(gè)編碼495個(gè)氨基酸的開(kāi)放閱讀框，成功從青蒿中分離獲得。微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*經(jīng)過(guò)BLAST分析篩選出的那個(gè)青蒿P450基因片段與來(lái)自71

為了保證異源表達(dá)的CYP71AV1可以發(fā)揮正常功能，協(xié)同它進(jìn)行氧化還原反應(yīng)的天然配體，NADPH：細(xì)胞色素P450氧化還原酶（CPR），同樣從青蒿中成功分離，并且其生化活性已經(jīng)在體外被證實(shí)。微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*

為了保證異源表達(dá)的CYP71AV1可以發(fā)揮正常功能72

1、體內(nèi)表達(dá)GC-MS檢測(cè)：在配體分子CPR的參與下，我們分別在活細(xì)胞體內(nèi)和體外研究了CYP71AV1是否可以催化amorphadiene轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗉?jí)氧化產(chǎn)物。微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*1、體內(nèi)表達(dá)GC-MS檢測(cè)：在配體分子CPR的參與下73

分析結(jié)果顯示：幾乎95%的這種特異化合物是來(lái)源于細(xì)胞體的。而且這種化合物的電子碰撞質(zhì)譜和保留時(shí)間與從青蒿中提取的青蒿酸的完全吻合。微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*分析結(jié)果顯示：幾乎95%的這種特異化合物是來(lái)源于細(xì)胞體的74在搖瓶培養(yǎng)條件下，同時(shí)表達(dá)CYP71AV1和CPR的EPY224菌株青蒿酸產(chǎn)量為32±13mg/L(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差,n＝7)。更為重要的是，其中間代謝產(chǎn)物，青蒿醇和青蒿醛在細(xì)胞體和培養(yǎng)基中被檢測(cè)到的量幾乎可以忽略（青蒿醇的量比青蒿素酸的5%還少，并且根本沒(méi)有青蒿醛被檢測(cè)出）。微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*在搖瓶培養(yǎng)條件下，同時(shí)表達(dá)CYP71AV1和CPR的E75從啤酒酵母菌株YPH499中分離微體，這些微體僅表達(dá)CPR（對(duì)照組）或者同時(shí)表達(dá)CPR和CYP71AV1。將微體在不同的合成途徑中間體（amorphadiene，青蒿醇，青蒿醛）條件下進(jìn)行培養(yǎng)。2、體外酶法檢測(cè)：微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*從啤酒酵母菌株YPH499中分離微體，這些微體僅表達(dá)CP76

a-c．每一種酶的測(cè)定分別加入

（a）10μMamorphadiene，

（b）25μM青蒿醇

（c）25μM青蒿醛。

底物的色譜峰用星號(hào)標(biāo)出。醚提取物經(jīng)過(guò)衍生，并用GC-MS在不同的粒子模式下分析（mlz：121，189，204，218，220和248）。酶反應(yīng)的產(chǎn)物按照預(yù)期得到：1，青蒿醇（保留時(shí)間13.20分鐘）；2，青蒿醛（保留時(shí)間11.79分鐘）；3，青蒿酸（保留時(shí)間13.58分鐘，甲酯化后檢測(cè)）

微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*

a-c．每一種酶的測(cè)定分別加入

（a）10μMam77

雖然先前已經(jīng)有報(bào)道，使用青蒿蛋白提取物的體外酶法測(cè)定證明可溶性的醇醛脫氫酶和一種C11，13雙鍵還原酶（作用于醛）參與青蒿素的生物合成。我們不排除在青蒿中存在其他的醇醛脫氫酶參與的催化反應(yīng)，但是體外實(shí)驗(yàn)中重組的CYP71AV1將amorpha-4,11-diene高效轉(zhuǎn)化為青蒿酸，完全顯示出膜結(jié)合、多功能的CYP71AV1是青蒿素的生物合成中的關(guān)鍵促成因素。微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*

雖然先前已經(jīng)有報(bào)道，使用青蒿蛋白提取物的體外酶法測(cè)78我們證實(shí)，通過(guò)用堿性緩沖液（pH為9的Tris-HCL緩沖液中添加1.2M的山梨醇）清洗胞體沉淀物，絕大部分合成的青蒿酸（>96%）可以而被分離出，而且沖洗之后細(xì)胞體和培養(yǎng)基中的殘留量?jī)H為2%。青蒿酸不僅可以被高效的轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外，且在酸性條件下經(jīng)過(guò)質(zhì)子化后會(huì)被束縛在細(xì)胞表面。

五、提純微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*我們證實(shí)，通過(guò)用堿性緩沖液（pH為9的Tris-HCL緩79利用這個(gè)特點(diǎn)制定了一種便捷提純方法：混合培養(yǎng)物細(xì)胞體沉淀物堿性清洗緩沖液凝膠柱層析純度大于95%的青蒿酸HCL調(diào)pH醚抽提抽提產(chǎn)物微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*利用這個(gè)特點(diǎn)制定了一種便捷提純方法：混合培養(yǎng)物細(xì)胞體沉淀物堿80在一個(gè)一升發(fā)酵罐中，青蒿酸的產(chǎn)量為115mg，而通這種方法的，我們可以得到76mg的提純產(chǎn)物。最重要的是，經(jīng)1Hand13C原子核磁共振檢測(cè)顯示，這種酵母合成青蒿酸與從青蒿中直接提取的青蒿酸分子結(jié)構(gòu)完全一樣。因此，可以確定我們所得到的這株轉(zhuǎn)基因酵母能夠直接合成結(jié)構(gòu)功能上完全正確的青蒿酸。

微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*在一個(gè)一升發(fā)酵罐中，青蒿酸的產(chǎn)量為115mg，而通這種方81轉(zhuǎn)基因酵母在生產(chǎn)青蒿酸時(shí)需要的生物量與青蒿相比：

青蒿素（酸）含量胞體干重4.5%地上部分干重0.16%培養(yǎng)時(shí)間4-5天數(shù)月提純方法簡(jiǎn)單復(fù)雜總之，轉(zhuǎn)基因酵母菌珠的單位生產(chǎn)效率比青蒿高了近兩個(gè)數(shù)量級(jí)。微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*轉(zhuǎn)基因酵母在生產(chǎn)青蒿酸時(shí)需要的生物量與青蒿相比：

青蒿素82總的來(lái)說(shuō)，我們采用改造FPP生物合成途徑的方法獲得了能高水平生產(chǎn)青蒿酸的啤酒酵母菌株。該方法通過(guò)表達(dá)amorphadiene合成酶，一種新型的細(xì)胞色素P450和與之相關(guān)的來(lái)自青蒿的氧化還原酶來(lái)提高FPP的產(chǎn)量。據(jù)了解，相關(guān)轉(zhuǎn)化青蒿酸到青蒿素或其他派生物的化學(xué)方法可能還有許多待改進(jìn)之處，但微生物法生產(chǎn)青蒿酸是獲得此類高效抗瘧疾藥物切實(shí)可行的方法。

微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*總的來(lái)說(shuō)，我們采用改造FPP生物合成途徑的方法獲得了能高83六、實(shí)驗(yàn)方法：１、化學(xué)和植物材料：青蒿酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)買(mǎi)于ApinChemicals公司或者直接用己烷從青蒿葉片萃取。青蒿植株被栽培在加州大學(xué)伯克利分校的溫室當(dāng)中，并且都是從種子開(kāi)始培育的。2、GC—MS法分析Amorphadiene：用GC—MS對(duì)不同株系的啤酒酵母的Amorphadiene合成量進(jìn)行測(cè)定，使用十二烷阻止Amorphadiene的揮發(fā)。為了定量衡量Amorphadiene產(chǎn)量水平，用于測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的Amorphadiene（90%純）是通過(guò)大腸桿菌菌株發(fā)酵制備的。微生物發(fā)酵工程案例教學(xué)*六、實(shí)驗(yàn)方法：１、化學(xué)和植物材料：青蒿酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)買(mǎi)于Apin843、青蒿酸的胞內(nèi)發(fā)酵，純化及化學(xué)分析：將經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)的在600nm（A600）下吸光度達(dá)到