DNA片段的擴增及電泳鑒定-高二下學期生物人教版選擇性必修3

DNA片段的擴增及電泳鑒定

基因工程1.引物的作用：使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始延伸DNA鏈2.需要引物的原因：DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，而只能從3’端延伸DNA鏈，因此DNA的復制需要引物3.設計兩種引物的原因：基因的兩條反向平行鏈都做模板，其堿基序列不同，且DNA聚合酶只能從3’端延伸子鏈，用兩種引物才能確保DNA兩條鏈同時被擴增4.需要大量引物的原因：子鏈是在引物的引導下合成的，引物隨子鏈DNA數(shù)量的增多而被消耗5.PCR擴增的產(chǎn)物的特異性：由引物的特異性決定；引物是根據(jù)目的基因兩端的核苷酸序列設計的6.兩引物間固定長度(等長)的DNA序列在PCR擴增3次后首先出現(xiàn)7.復制方向:是沿子鏈5’→3’，從引物的3’端延伸子鏈8.如果需要在引物上加限制酶的識別序列：需要在引物的5’加9.在引物的5’端設計兩種限制酶識別序列的原因：便于目的基因和載體的定向正確連接10.如果引物中GC含量較高，可適當提高退火溫度11.設計引物時，引物自身不能有堿基互補配對的序列：避免引物自連，不能得到目的產(chǎn)物12.設計引物時，兩引物之間不能有堿基互補配對的序列：防止兩引物之間結合形成雙鏈，降低引物與DNA模板鏈結合的效率13.引物設計不能太短：防止非目的基因的獲得14.退火溫度過高，得不到產(chǎn)物的原因：引物不能穩(wěn)定的與模板結合（引物與模板結合的穩(wěn)定性遭到破壞）15.PCR后期，反應速率下降的原因：酶的活性降低、引物和dNTP濃度降低、反應產(chǎn)物增多16.變性溫度過低會導致雙鏈不能充分解開；17.退火溫度過高會導致引物不能充分與模板鏈結合，導致目標產(chǎn)物的量減少引物的設計DNA片段的擴增及電泳鑒定一、實驗原理1.利用PCR在體外進行DNA片段擴增的原理①PCR利用了DNA的______原理，通過_________來控制DNA雙鏈的解聚與結合，PCR儀實質上就是一臺能夠_____________的儀器，一次PCR一般要經(jīng)歷___次循環(huán)；熱變性調節(jié)溫度自動調控溫度30②PCR擴增DNA片段還利用了______________的原理；DNA半保留復制2.DNA片段電泳鑒定的原理①DNA分子具有_____________，在一定的___下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷，在_____的作用下，這些________會向著________________的電極移動，這個過程就是_____；可解離的基團pH電場帶電分子電泳與它所帶電荷相反②PCR的產(chǎn)物一般通過_______________來鑒定；③在凝膠中DNA分子的遷移速率與___________、______________和_____等有關④凝膠中的DNA分子通過_____，可以在波長為______的______下被檢測出來。瓊脂糖凝膠電泳凝膠的濃度染色300nm紫外燈DNA分子的大小構象*因此，離加樣孔遠的DNA片段____，近的DNA片段____小大*因此，離加樣孔遠的DNA片段____，近的DNA片段____小大二、材料用具①PCR儀（自動控溫，實現(xiàn)DNA的擴增）②微量離心管（實際上是進行PCR反應的場所）③微量移液器（用于向微量離心管轉移PCR配方中的液體）④一次性吸液槍頭（微量移液器吸取一種試劑更換一次槍頭）⑤電泳裝置（包括電泳儀、電泳槽等）10倍濃縮的擴增緩沖液（含Mg2+）5μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液（實為dNTP）1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1-5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高溫的DNA聚合酶）1～2U模板DNA（用量為1pg-1μg）5～10μL總體積50μL⑧PCR反應體系的配方⑥4種脫氧核苷酸等量混合液、2種引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、擴增緩沖液、無菌水。⑦電泳緩沖液、凝膠載樣緩沖液、瓊脂糖和核酸染料等

使DNA充分變性，以利于引物更好地和模板結合。三、方法步驟DNA片段的擴增1、移液：用微量移液器按照PCR反應體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分2、離心：待所有組分都加入后，蓋嚴離心管的蓋子，將微量離心管放入離心機里，離心約10s，使反應液集中在離心管的底部（提高反應速率）3、反應：參照下表的參數(shù)，設置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應液的微量離心管放入PCR儀中進行反應。循環(huán)程序變性復性延伸預變性94℃,5min//30次94℃,30s55℃,30s72℃,1min最后一次94℃,1min55℃,30s72℃,1min預變性：對擴增后的DNA染色處理后凝膠電泳分離。DNA電泳是根據(jù)DNA分子大小來分離和識別DNA片段的技術。較小的DNA片段在凝膠中的移動相對容易，較大的DNA片段移動難。當電泳結束時，比較DNA樣品所在的位置和一系列已知大小的DNA片段的位置，這些已知大小的片段稱為DNA分子量標準樣。DNA片段的電泳鑒定1、配制瓊脂糖溶液

根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質量體積比0.8%-1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻2、制備凝膠①將溫熱的瓊脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。③將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜②待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內。3、加樣

將擴增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液（內含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內。留一個加樣孔加入指示分子大小的標準參照物4、電泳

接通電源，根據(jù)電泳槽陽極至陰極之間的距離來設定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳5、觀察記錄取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相將擴增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液（內含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內注意1.為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。2.該實驗所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應分裝成小份，并在-20℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。3.在向微量離心管中添加反應組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。4.在進行操作時，一定要戴好一次性手套。5.PCR擴增不能隨意加大試劑用量。該過程中有幾種緩沖液？1.電泳緩沖液（TAE或TBE）*為DNA分子帶上電荷提供一定的pH2.凝膠載樣緩沖液（內含指示劑——溴酚藍）*指示劑前沿遷移到凝膠邊緣時，停止電泳3.擴增緩沖液（內含Mg2+）*為PCR提供一定的液體環(huán)境和pH等條件四、結果分析與評價1.你是否成功擴增出DNA片段？判斷的依據(jù)是什么？2.你進行電泳鑒定的結果是幾條條帶？如果不止一條條帶，請分析產(chǎn)生這個結果的可能原因。

可以在紫外燈下直接觀察到DNA條