綜合設計性實驗-化學抑殺菌劑的效果評價課件

化學抑殺菌劑的效果評價

實驗匯報一、前言（一）實驗目的自主設計方案，通過濾紙片法研究一些常用抗生素、中藥復方劑、消毒劑和防腐劑的抑殺菌效果，掌握評價化學抑殺菌劑作用效果的方法。了解一些常用化學抑殺菌劑的作用機理以及效果差異。通過實驗操作，進一步鞏固已學習的微生物實驗技能，學以致用。（二）實驗原理1.抗生素的特點（1）作用機理的選擇性抑制細胞壁合成：青霉素、頭孢菌素干擾細胞膜（破壞膜的選擇透過性）：多粘菌素、桿菌肽抑制蛋白質(zhì)合成：與核糖體50S亞基（氯霉素，紅霉素）或30S亞基結(jié)合（卡那霉素、鏈霉素、四環(huán)素）抑制核酸合成：抑制DNA復制（絲裂霉素）抑制RNA轉(zhuǎn)錄或合成（放線菌素D、利福平）

抗菌效果：抑菌、殺菌和溶菌2.消毒劑

可以抑制或殺滅微生物，但對人體也可能產(chǎn)生有害作用的化學試劑，主要用于抑制或殺滅物體表面、器械、排泄物和周圍環(huán)境中的微生物，不能用于活細胞或體內(nèi)治療用。

作用機理：蛋白質(zhì)變性、損傷細胞膜、氧化作用3.防腐劑可以抑制微生物生長，但對人體或微生物的毒性較低的化學試劑。常用于皮膚、黏膜、傷口等處的防止感染，也可用于食品、飲料、藥品的防腐。4.研究方法

可以通過擴散法（濾紙片法、牛津杯法）、比濁（測吸光值）等方法檢測不同抑殺菌劑的作用。濾紙片法

適用條件——不易揮發(fā)的化學藥劑測定抑菌圈直徑大小，抑菌圈直徑越大，該消毒劑的殺菌能力越強。

注意事項——濾紙片大小一致（6mm）、濾紙片吸附量一致（本實驗采取浸泡法來保證濾紙片吸附量一致）、菌苔均勻。

比濁法

在一定范圍內(nèi)，微生物細胞濃度與透光度呈反比，與光密度呈正比。而光密度或透光度可以通過光電池測出。通過對比不同抑菌劑作用的同一菌液的光密度或透光度而比較出不同抑菌劑的作用效果好壞。二、材料與方法（一）材料及試劑待測菌種：大腸桿菌（G-），白色葡萄球菌（G+）藥劑消毒劑：龍膽紫（0.1%、0.05%）、碘酒（0.5%、0.25%）抗生素：氨芐青霉素(10、50、100μg/ml)；鏈霉素(10、25、50μg/ml)；卡那霉素(10、25、50μg/ml)；四環(huán)素(10、25、50μg/ml)中藥：雙黃連口服液原液、清熱解毒口服液原液(二)實驗方法濾紙片法：選幾種藥劑（及濃度）進行

無菌操作下將滅過菌且冷卻至50℃左右的培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿（約15ml）。待其凝固后用移液槍移取0.1ml菌懸液，然后用無菌涂布棒將菌懸液涂布均勻，制成含菌平板，備用。在無菌條件下，將滅菌后直徑為6mm的濾紙圓片在待測藥劑中浸泡至少5min后取出，自然瀝干后貼在含菌平板上，每皿放六片，以無菌水作對照，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。用十字交叉法測量抑菌圈直徑，取平均值。

判定標準：

抑菌圈直徑大于6mm者判定為有抑菌作用，無菌水對照組應無抑菌作用。2ml無菌生理鹽水10ml無菌生理鹽水藥品(二)實驗方法本實驗采取濾紙片法，操作步驟如下：1.配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基

牛肉膏5g、蛋白胨10g、NaCl5g、瓊脂15-20g、水1000mlpH7.0-7.2，121℃滅菌20min2.所需用品的滅菌及配制藥劑稀釋液3.制大腸桿菌、白色葡萄球菌菌懸液

用滅菌后的生理鹽水稀釋菌種并搖勻。注意：每次移液槍取菌液前均需搖勻。4.涂板用移液槍準確移取100ul菌液于培養(yǎng)基表面，用滅菌后的涂布棒將菌液涂抹均勻。5.貼浸有藥劑的濾紙片

含藥劑濾紙片貼到涂菌的平板表面，每濃度浸泡至少5min，每平板貼7片，中間為對照37℃培養(yǎng)16~20h6.測抑菌圈直徑

大于濾紙片直徑1mm以上的最低濃度視為最低抑殺菌濃度。實驗結(jié)果與分析白葡萄球菌結(jié)果圖大腸桿菌結(jié)果圖不同濃度碘酒對大腸桿菌的抑制作用0.50%：9mm0.25%：8mm不同濃度碘酒對白葡萄球菌的抑制作用0.50%：8mm0.25%：10mm5、6、7（濃度依次增加）表現(xiàn)出不同濃度氨芐青霉素對白葡萄球菌的影響8、9、10（濃度一次增加）表現(xiàn)出不同濃度鏈霉素對白葡萄球菌生長的影響11、12、13（濃度依次增加）表現(xiàn)出不同濃度卡那霉素對大腸桿菌的影響14、15、16（濃度一次增加）表現(xiàn)出不同濃度四環(huán)素對大腸桿菌生長的影響大腸桿菌：在雙黃連口服液原液中的平均直徑：8mm清熱解毒口服液原液中的平均直徑：7mm白葡萄球菌：在雙黃連口服液原液中的平均直徑：7mm清熱解毒口服液原液中的平均直徑：7mm四、分析與討論（一）實驗分析1.同一藥劑不同濃度對細菌的抑殺作用

從實驗結(jié)果可以看出，低濃度的藥劑對細菌抑殺效果不明顯而隨著濃度的增大其抑殺效果越來越明顯。如，濃度分別為10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml的氨芐青霉素對白色葡萄球菌抑殺作用的實驗中三者抑菌圈直徑分別為9mm、18mm、27mm。2.同一藥劑對不同細菌的抑殺效果觀察同一濃度的同一藥劑對不同細菌的抑殺實驗結(jié)果可以看出，同一濃度的同一藥劑對不同細菌有不同的抑殺效果。如，0.10%的龍膽紫對大腸桿菌的抑菌圈平均直徑為10mm，而對白色葡萄球菌的抑菌圈平均直徑為15mm；0.05%的龍膽紫對大腸桿菌的抑菌圈平均直徑為7mm，表現(xiàn)為低敏感的效果，而對白色葡萄球菌的抑菌圈平均直徑為13mm，表現(xiàn)為中度敏感的效果。3．不同藥劑對同一細菌的抑殺效果通過觀察不同細菌對同一細菌抑殺作用的結(jié)果可以看出，不同細菌對同一細菌的抑殺效果是不同的。如，同樣是50μg/ml的濃度，氨芐青霉素對白色葡萄球菌的抑菌圈平均直徑為18mm表現(xiàn)為高度敏感的抑殺作用，而鏈霉素對白色葡萄球菌的抑菌圈平均直徑為13mm表現(xiàn)為中度敏感的抑殺作用。四、分析與討論（一）實驗分析6.四環(huán)素對大腸桿菌的殺菌效果較弱，大于50ug/ml時對白色葡萄球菌的殺菌效果為強效。7.中藥（雙黃連口服液原液、清熱解毒口服液）對大腸桿菌和白色葡萄球菌都是弱效的殺菌效果。

綜上，大于50ug/ml的氨芐青霉素、鏈霉素、卡那霉素對大腸桿菌有強效的殺菌效果。龍膽紫、大于50ug/ml的氨芐青霉素、卡那霉素、四環(huán)素度白色葡萄球菌有強效的殺菌效果。進一步篩選出，大于50ug/ml的氨芐青霉素、卡那霉素對大腸桿菌和白色葡萄球菌都有很強的殺菌效果。雙黃連口服液：金銀花、黃芩、連翹。輔料為蔗糖、香精等清熱解毒口服液主要成分：石膏、知母、金銀花、連翹、黃芩、梔子、龍膽、板藍根、甜地丁、玄參、地黃、麥冬。輔料為蔗糖。（二）實驗討論（二）實驗討論2．細菌菌臺的厚薄對抑殺實驗結(jié)果的影響

通過觀察實驗現(xiàn)象可以看出，細菌菌臺較薄的培養(yǎng)基內(nèi)抑菌圈的大小相比于菌臺厚薄適宜的培養(yǎng)基內(nèi)抑菌圈大小均明顯較大，但抑菌圈比較模糊。如鏈霉素對白色葡萄球菌抑殺實驗中10μg/ml的藥劑抑菌圈平均直徑為12mm，而25μg/ml的藥劑抑菌圈平均直徑為10mm，同一藥劑低濃度的抑殺實驗結(jié)果反而比高濃度藥劑的抑殺實驗結(jié)果好，原因就是前者細菌菌臺較薄。

3．空白對照的濾紙片表現(xiàn)出“假抑菌圈”

本實驗中用滅菌水浸泡的濾紙片本不該出現(xiàn)抑菌圈，但有的培養(yǎng)基內(nèi)的空白濾紙片仍出現(xiàn)“假抑菌圈”，原因是在貼濾紙片時濾紙片上有很多滅菌水，貼到菌臺上后將周圍菌臺沖到外圍，形成了“假抑菌圈”。因此，實驗過程中不論是貼空白濾紙片還是貼藥劑浸泡的濾紙片都應先將濾紙片上多余的液體揩凈后再貼濾紙片，并且菌臺表面也應是干的。

（二）實驗討論4．接種細菌時涂布的注意事項

涂布棒一定要提前滅好菌，先將同一菌種涂布完了，再涂布另一菌種。涂布另一菌種前先用酒精燈將涂布棒滅菌，待涂布棒冷卻后再進行涂布，以免涂布棒溫度較高將細菌燙死。涂布一定要均勻，且每次取菌前應將菌液搖勻，取相同量的菌液進行涂布，以確保不同培養(yǎng)基表面菌臺厚薄相同。

5．注意各個環(huán)節(jié)無菌操作的規(guī)范

如應在酒精燈附近10—15cm處進行操作；手拿培養(yǎng)皿的姿勢；濾紙片、無菌水、生理鹽水及液體培養(yǎng)基的滅菌條件等。五、實驗結(jié)論我們組通過分析實驗結(jié)果，將試驗中的抑菌劑效果進行排順：對大腸桿菌而