齊魯醫(yī)學流式細胞儀分析技術應用

實驗室流式細胞儀單細胞分選技術流式細胞儀分析技術應用共51頁，您現在瀏覽的是第1頁!流式細胞術(flowcytometry,FCM)是以流式細胞儀為檢測手段的一項能快速、精確的對單個細胞理化特性進行多參數定量分析和分選的新技術。流式細胞儀分析技術應用共51頁，您現在瀏覽的是第2頁!流式細胞術最大的特點是能在保持細胞及細胞器或微粒的結構及功能不被破壞的狀態(tài)下，通過熒光探針的協助，從分子水平上獲取多種信號對細胞進行定量分析或純化分選。細胞不被破壞，測量快速、大量、準確、靈敏、定量流式細胞術的特點流式細胞儀分析技術應用共51頁，您現在瀏覽的是第3頁!（1）液流系統(tǒng)（2）光學系統(tǒng)（3）數據處理系統(tǒng)1.流式細胞儀的基本結構：流式細胞儀分析技術應用共51頁，您現在瀏覽的是第4頁!細胞懸液形成液流柱流動室振動液流斷裂成液滴空白液滴含細胞的液滴棄去偏轉落入收集器壓電晶體產生機械振動不充電充電（一）分選基本原理流式細胞儀分析技術應用共51頁，您現在瀏覽的是第5頁!參數：FS,SS,FL數據顯示方式（單參數直方圖、雙參數散點圖、二維等高圖、假三維等高圖、三參數散點圖）設門分析技術第二節(jié)數據的顯示與分析流式細胞儀分析技術應用共51頁，您現在瀏覽的是第6頁!單參數直方圖雙參數直方圖:點圖 二維等高圖 假三維等高圖三參數直方圖多參數分析直分析方圖設門分析:REGION和GATE設置二、數據顯示方式流式細胞儀分析技術應用共51頁，您現在瀏覽的是第7頁!單參數直方圖細胞相對數量流式細胞儀分析技術應用共51頁，您現在瀏覽的是第8頁!1.雙參數直方圖點圖綠色熒光強度紅色熒光強度流式細胞儀分析技術應用共51頁，您現在瀏覽的是第9頁!二維等高圖流式細胞儀分析技術應用共51頁，您現在瀏覽的是第10頁!（三）三參數直方圖流式細胞儀分析技術應用共51頁，您現在瀏覽的是第11頁!Gate設置：指在某一張選定參數的直方圖上，根據該圖的細胞群分布選定其中想要分析的特定細胞群，并要求該樣本所有其他參數組合的直方圖只體現這群細胞的分布情況。根據門的形狀又分為了線性門、矩形門、圓形門、多邊形門、任意形狀門和十字門。三、設門分析技術流式細胞儀分析技術應用共51頁，您現在瀏覽的是第12頁!線性門流式細胞儀分析技術應用共51頁，您現在瀏覽的是第13頁!外周血淋巴細胞樣品的制備 分離單個核細胞培養(yǎng)細胞的樣品制備蛋白酶消化機械吹打使貼壁細胞脫落 洗滌尼龍網過濾單細胞懸液一、免疫檢測樣品制備流式細胞儀分析技術應用共51頁，您現在瀏覽的是第14頁!1×PhosphateBufferSalineorHBSS(Ca/Mg++free)1mMEDTA25mMHEPESpH7.01%FetalBovineSerum(Heat-inactivated)SortingBuffer流式細胞儀分析技術應用共51頁，您現在瀏覽的是第15頁!貼壁型細胞株(Adherentcells)：

以Trypsin處理后去準備單細胞懸液時，待細胞變圓(切記不可過度作用)，便以5ml含5%血清培養(yǎng)液收取細胞，并均勻地打散細胞懸液。離心后，用sortingbuffer調整細胞濃度。如果需要的話，可以提高EDTA的濃度(至5mM)以避免細胞重新黏聚。含有高比例死細胞的樣本：

Sortingbuffer加5mMMgCl2以及25~50μg/mLDNAaseI(SigmaD-4513)或是Sortingbuffer加0.83mMMgCl2以及20UDNAaseII(SigmaD-4138)。這些配方可減少因死細胞釋放出來的DNA所造成的細胞黏聚現象。流式細胞儀分析技術應用共51頁，您現在瀏覽的是第16頁!盡量選擇熒光光譜重疊小的熒光素MinimizethepotentialforspectraloverlapSpilloverestimatesavailableinthespectraviewer2流式細胞儀分析技術應用共51頁，您現在瀏覽的是第17頁!名稱染料激發(fā)波長熒光顏色溶解性對PH敏感性特點異硫氰酸熒光素FITC488綠525易敏感易溶于水，與抗體結合不影響特異性得州紅Texasred568紅615不易不敏感穩(wěn)定，偶聯后量子產額低藻紅蛋白PE488橙575易不敏感具較多發(fā)光基團，消光系數和量子產額高藻青蛋白PC488別藻青蛋白APC633紅670能量傳遞復合染料PEcy5488紅670易不敏感減少交叉，成本高常用的幾類熒光染料流式細胞儀分析技術應用共51頁，您現在瀏覽的是第18頁!PECY5CY5CY5488nm575nm670nm紅色熒光花青苷5藻紅蛋白能量傳遞復合染料機制流式細胞儀分析技術應用共51頁，您現在瀏覽的是第19頁!血液系統(tǒng)單細胞分選標準化的建立流式細胞儀分析技術應用共51頁，您現在瀏覽的是第20頁!擬解決的關鍵科學問題所有的單細胞實驗技術中，干細胞的單細胞分選是最為關鍵，也是最為基礎的一個環(huán)節(jié)。影響單細胞分選效果的因素有很多。（比如目的分離細胞群的不同，分選的儀器選擇，抗體標記的染料的選擇，不同熒光顏色之間的補償計算，樣品的準備，收集工具的不同等。)單細胞分選的標準化建立非常重要，尤其我重點實驗室研究工作主要以血液系統(tǒng)為研究對象，更加有意義。流式細胞儀分析技術應用共51頁，您現在瀏覽的是第21頁!研究方法熒光抗體的選擇分選儀器的比較補償計算的量化精確調整接收工具的模板標準化單細胞的培養(yǎng)鑒定流式細胞儀分析技術應用共51頁，您現在瀏覽的是第22頁!分選儀器的比較石英杯激發(fā)原理：激光檢測是在石英杯中進行的優(yōu)點：比色皿提供層流和增強的樣品聚焦，對于敏感性來說，石英杯激發(fā)系統(tǒng)明顯占優(yōu)。缺點：石英杯長度有限，而且激光光學裝置需要足夠空間避免不同通道間的串擾，細胞需要通過不同的介質，且速度不一樣，高速下細胞密度變大，與流動池和噴嘴接觸面變大，不能保證在液滴延遲時間內到。空氣激發(fā)原理：激光檢測是在細胞通過噴嘴后的液滴中。優(yōu)點：硬件設備簡單，檢測點與收集裝置間距離較短，檢測樣品的可用的激光數多，液流更穩(wěn)定，能在高速情況下準確在液滴延遲時間內到達。保持細胞清潔的更好，并且能提供額外的激光束。缺點：對于敏感性來說，空氣激發(fā)不那么敏感。流式細胞儀分析技術應用共51頁，您現在瀏覽的是第23頁!接收工具的模板標準化

因為實驗的需求不同，所以單細胞分選到不同接收器中，這其中包括24孔板，96孔板，72孔板乃至384孔板等，在每個機器上調整相應模板，使其固定為標準化的模板，每次使用直接調用，不需要重復進行調整。這將極大提高分選效率和精確性。流式細胞儀分析技術應用共51頁，您現在瀏覽的是第24頁!技術路線流式細胞儀分析技術應用共51頁，您現在瀏覽的是第25頁!CD34-PECD38-FITCCD34+CD38-細胞

1/PE-Isotype;FITC-Isotype:設置陰性對照門,去除抗體非特異性吸附的影響2/CD34-PE;FITC-Isotype:單陽管對照,設置補償3/CD38-FITC;PE-Isotype:單陽管對照,設置補償4/CD34-PE;CD38-FITC:檢測分選管流式細胞儀分析技術應用共51頁，您現在瀏覽的是第26頁!溫度pH染料濃度固定劑（二）免疫熒光染色的質控流式細胞儀分析技術應用共51頁，您現在瀏覽的是第27頁!通過流式細胞儀進行細胞分選主要是在對具有某種特征的細胞需進一步培養(yǎng)和研究時進行的。細胞分選原理流式細胞儀分析技術應用共51頁，您現在瀏覽的是第28頁!分選速度：單位時間內分選的細胞數量。與懸液中細胞的含量成正比。分選純度：分選出的目的細胞占所有收獲細胞的百分率。分選收獲率：實際收獲的分選細胞與設定通過測量點的分選細胞之間的比率。與純度成反比。分選得率：從一群體細胞懸液中分辨出目的細胞的總量，再經分選后得到目的細胞的實際得率。與分選速度成反比。（二）分選的技術要求流式細胞儀分析技術應用共51頁，您現在瀏覽的是第29頁!FS：反映顆粒的大小SS：反映顆粒的內部結構復雜程度FL：反映顆粒被染上的熒光數量多少一、參數流式細胞儀分析技術應用共51頁，您現在瀏覽的是第30頁!由一維參數(散射光或熒光)與顆粒計數(COUNT)構成，反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數量的多少。（一）單參數直方圖流式細胞儀分析技術應用共51頁，您現在瀏覽的是第31頁!雙參數直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測量細胞的兩個測量參數，根據這兩個參數就可以確定細胞在圖上的表達位置。雙參數信號通常采用對數信號，最常用的是點密圖，在圖中，每個點代表一個細胞，點圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數量的多少。（二）雙參數直方圖流式細胞儀分析技術應用共51頁，您現在瀏覽的是第32頁!2.二維等高圖由類似地圖上的等高線組成，其本質也是雙參數直方圖。等高圖上每一條連續(xù)曲線上具有相同的細胞相對或絕對數，即“等高”。曲線層次越高(越里面的線)所代表的細胞數愈多。等高線越密集則表示細胞數變化率越大。流式細胞儀分析技術應用共51頁，您現在瀏覽的是第33頁!3.假三維等高圖流式細胞儀分析技術應用共51頁，您現在瀏覽的是第34頁!多參數分析：當細胞標記了多色熒光，被激發(fā)光激發(fā)后，得到的熒光信號和散射光信號可根據需要進行組合分析。（四）流式細胞儀的多參數分析流式細胞儀分析技術應用共51頁，您現在瀏覽的是第35頁!A淋巴細胞B單核細胞C中性粒細胞A、B、C均為任意門流式細胞儀分析技術應用共51頁，您現在瀏覽的是第36頁!樣本制備標記染色液相芯片技術質量控制第四節(jié)流式細胞儀免疫分析的技術要求

流式細胞儀分析技術應用共51頁，您現在瀏覽的是第37頁!新鮮實體組織單細胞懸液的制備機械法酶處理法化學試劑處理法表面活性劑處理法單細胞懸液的保存深低溫保存法（一年）乙醇或甲醇保存法（2周）甲醛或多聚甲醛保存法（2月）流式細胞儀分析技術應用共51頁，您現在瀏覽的是第38頁!淋巴細胞：

1xHBSS(withCa++/Mg++)含1%FBS

HBSS配方中的陽離子可增加細胞的生存力。由于這些細胞并非易于聚集，即便配方中沒有EDTA也不會造成問題。較黏著的細胞(stickycells)：

提高EDTA到5mM并使用透析過的FBS(againstCa++/Mg++freePBS)。某些細胞在活化會比較黏著而EDTA可抑制此作用流式細胞儀分析技術應用共51頁，您現在瀏覽的是第39頁!盡量選擇熒光光譜重疊小的熒光素PE-Cy5/APC&PerCP-Cy5.5/APC為弱表達的抗原選擇較亮的熒光素CD62LonCD8+T防止耦聯染料降解（光照/固定/升溫等）造成的干擾APC-Cy7/PE-Cy7二、常用的熒光染料與標記染色流式細胞儀分析技術應用共51頁，您現在瀏覽的是第40頁!FITCTexasredPE.PC.APCPEcy5FL1FL2FL3FL4激光細胞懸液異硫氰酸熒光素得州紅能量傳遞復合染料藻膽蛋白類（一）幾種常見的熒光染料流式細胞儀分析技術應用共51頁，您現在瀏覽的是第41頁! 用化學法將兩種不同激發(fā)波長的染料結合在一起，在488nm激發(fā)光照射下，通過一個熒光染料被激發(fā)后產生的發(fā)射波長再激發(fā)另一熒光染料產生熒光信號，從而檢測到該特定熒光信號。能量傳遞復合染料流式細胞儀分析技術應用共51頁，您現在瀏覽的是第42頁!多色分析時組合抗體的使用原則在免疫表型分析中，常常把多種熒光素標記抗體同時組合在一起進行多色分析，但并非多種抗體均可以自由組合在一起使用。在多數熒光素標記抗體組合應用之前，必須將每種抗體單獨應用和組合應用的結果進行比較，一旦這種組合顯示出與單獨應用時無差別的結果時，這種組合才可以應用于多色免疫表型分析。在單獨或組合應用時，應注意抗體的稀釋度。如3種抗體單獨使用時的最佳用量為20μl，而3種抗體組合應用時如果各加20μl，總體積會增至60μl，因此每種抗體的濃度被稀釋成原來的1/3，不再是最佳用量。因此組合抗體應用濃度應比單獨抗體使用濃度高。一種新的抗體組合設計后必須進行這種比對試驗，這種組合一旦應用與臨床，不可隨便改換抗體組合或抗體的克隆。一般情況下多色分析熒光素標記抗體組合最好采用同一種工藝制作的為佳。流式細胞儀分析技術應用共51頁，您現在瀏覽的是第43頁!背景干細胞的研究意義現在已經越來越重要。白血病干細胞的研究一直走在整個學科的前沿，引領學科的發(fā)展。越來越多的證據顯示干細胞自我更新及分化的分子機制都是在單細胞水平上發(fā)生的，單細胞技術的發(fā)展為干細胞的研究奠定了重要基礎?，F有的單細胞技術主要包括單細胞分選、培養(yǎng)、單細胞PCR、單細胞多色Fish、單細胞基因組及表觀遺傳學分析、免疫缺陷鼠移植鑒定在內的單細胞技術。流式細胞儀分析技術應用共51頁，您現在瀏覽的是第44頁!研究目標

通過對機器參數的調整，激光功率的確認，補償的量化處理，接收工具的模板化和抗體組合的優(yōu)化建立一套針對白血病干細胞和正常造血干細胞的分選標準。流式細胞儀分析技術應用共51頁，您現在瀏覽的是第45頁!熒光抗體的選擇種屬來源：人正常造血干細胞分選標記：Lin-CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+Rholow白血病干細胞的分選標記：CD34+CD38-CD71-CD90-CD117-CD123+CD96+CD47+種屬來源：鼠正常造血干細胞分選標記:Lin-Sca-1+c-Kit+CD34-Flk2-

或者Lin-Sca-1+c-Kit+CD150+CD48-MLL-AF9AML白血病干細胞的分選標記:Lin-Sca-1-c-