化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀教材課件

上海豐匯生物研究有限公司化學(xué)發(fā)光介紹上海豐匯生物研究有限公司化學(xué)發(fā)光介紹發(fā)光免疫技術(shù)發(fā)光免疫技術(shù)(luminescenceimmunoassay,LIA)是將發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種新的免疫分析技術(shù)。這種方法不僅具有發(fā)光分析的高靈敏度和抗原抗體反應(yīng)的高度特異性,而且還具有分離簡(jiǎn)便,可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析特點(diǎn),使之成為醫(yī)學(xué)、生物學(xué)研究領(lǐng)域中一種新的重要的免疫學(xué)分析手段。發(fā)光免疫技術(shù)發(fā)光免疫技術(shù)(luminescenceimmu2按化學(xué)反應(yīng)類型化學(xué)發(fā)光的分類酶促化學(xué)發(fā)光：辣根過(guò)氧化物酶系統(tǒng)：豐匯、強(qiáng)生堿性磷酸酶系統(tǒng)：貝克曼非酶促化學(xué)發(fā)光：

吖啶酯系統(tǒng)：雅培電化學(xué)發(fā)光：羅氏閃光（Flash）:按發(fā)光持續(xù)時(shí)間發(fā)光時(shí)間在數(shù)十分鐘以上，如：

HRP-Luminol系統(tǒng)

AP-AMPPD系統(tǒng)無(wú)須原位進(jìn)樣、以速率法測(cè)量。發(fā)光時(shí)間在數(shù)秒內(nèi)，如吖啶酯以原位進(jìn)樣(InSituInjector)和時(shí)間積分法測(cè)量輝光（Glow）:按化學(xué)反應(yīng)類型3時(shí)間發(fā)光信號(hào)輝光坪區(qū)速率法測(cè)量原位進(jìn)樣積分法測(cè)量閃光尖峰閃光與輝光及其測(cè)量方式的差別時(shí)間發(fā)光信號(hào)輝光坪區(qū)速率法測(cè)量原位進(jìn)樣積分法測(cè)量閃光尖峰閃光4

發(fā)光與化學(xué)發(fā)光劑一、發(fā)光一種物質(zhì)由電子激發(fā)態(tài)回復(fù)到基態(tài)時(shí)，釋放出的能量表現(xiàn)為光的發(fā)射，稱為發(fā)光(luminescence)。根據(jù)形成激發(fā)態(tài)分子的激發(fā)能可將發(fā)光分為三種類型:1.光照發(fā)光2.生物發(fā)光3.化學(xué)發(fā)光。發(fā)光與化學(xué)發(fā)光劑一、發(fā)光51.光照發(fā)光發(fā)光劑經(jīng)短波長(zhǎng)入射光照射后進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng)回復(fù)至基態(tài)時(shí)發(fā)出較長(zhǎng)波長(zhǎng)的可見(jiàn)光

。電子e光子基態(tài)能級(jí)1.光照發(fā)光發(fā)光劑經(jīng)短波長(zhǎng)入射光照射后進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng)回復(fù)至62.生物發(fā)光典型例子為螢火蟲(chóng)發(fā)光。反應(yīng)底物為螢火蟲(chóng)熒光素(fireflyluciferin)，在熒光素酶(luciferase)的催化下利用ATP產(chǎn)能，生成激發(fā)態(tài)的氧化螢火蟲(chóng)熒光素(oxyluciferin)，后者在回復(fù)到基態(tài)時(shí)多余的能量以光子形式放出。2.生物發(fā)光典型例子為螢火蟲(chóng)發(fā)光。反應(yīng)底物為螢火蟲(chóng)熒光素73.化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光是在常溫下經(jīng)化學(xué)反應(yīng)所產(chǎn)生的發(fā)射光?；瘜W(xué)發(fā)光是一個(gè)多步驟的過(guò)程，其機(jī)制為某些化合物(發(fā)光劑或發(fā)光底物)可以利用一個(gè)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的能量使其產(chǎn)物分子或反應(yīng)中間態(tài)分子上升至電子激發(fā)態(tài)。當(dāng)此產(chǎn)物分子或中間態(tài)分子衰退至基態(tài)時(shí)，以發(fā)射光子的形式釋放能量(即發(fā)光)。3.化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光是在常溫下經(jīng)化學(xué)反應(yīng)所產(chǎn)生的發(fā)射光。8化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)中常用的化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物

酶促反應(yīng)的發(fā)光底物直接化學(xué)發(fā)光劑電化學(xué)發(fā)光劑化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)中常用的化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物酶促反應(yīng)的91．酶促反應(yīng)的發(fā)光底物酶促反應(yīng)的發(fā)光底物是指經(jīng)酶的降解作用而發(fā)出光的一類發(fā)光底物，目前化學(xué)發(fā)光酶免疫技術(shù)中常用的酶有辣根過(guò)氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（ALP），相應(yīng)發(fā)光底物為：

HRP的發(fā)光底物：價(jià)格低廉、國(guó)內(nèi)技術(shù)成熟

ALP的發(fā)光底物：價(jià)格昂貴、國(guó)內(nèi)無(wú)成熟技術(shù)1．酶促反應(yīng)的發(fā)光底物酶促反應(yīng)的發(fā)光底物是指經(jīng)酶的降解作用而10(1)HRP的發(fā)光底物

常用的底物為魯米諾或其衍生物。魯米諾或其衍生物魯米諾的氧化反應(yīng)在堿性緩沖液中進(jìn)行。(1)HRP的發(fā)光底物常用的底物為魯米諾或其衍生物11（2）ALP的發(fā)光底物常用的底物為3-（2-螺旋金剛烷-4-甲氧基-4-甲基-4-（3-磷酸氧基）-苯基-1，2-二氧乙烷（AMPPD）和4-甲基傘形酮磷酸鹽（4-MUP，熒光底物）。（2）ALP的發(fā)光底物常用的底物為3-（2-螺旋金剛烷-4-12AMPPD

AMPPD在堿性條件下，被ALP酶解生成相當(dāng)穩(wěn)定的AMP-D陰離子，其有2-30min的分解半衰期，發(fā)出波長(zhǎng)為470nm的持續(xù)性光，在15min時(shí)其強(qiáng)度達(dá)到高峰，15~60min內(nèi)光強(qiáng)度保持相對(duì)穩(wěn)定。AMPPDAMPPD在堿性條件下，被ALP酶解生成相當(dāng)穩(wěn)定132．直接化學(xué)發(fā)光劑這類發(fā)光劑不需酶的催化作用，只需改變?nèi)芤旱膒H等條件就能發(fā)光，如吖啶酯（acridinium,AE）在含過(guò)氧化氫的稀堿溶液中即能發(fā)光。2．直接化學(xué)發(fā)光劑這類發(fā)光劑不需酶的催化作用，只需改變?nèi)芤旱?43.電化學(xué)發(fā)光劑是指通過(guò)在電極表面進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)而發(fā)出光的物質(zhì)?；瘜W(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]2+（圖19-1）和電子供體三丙胺（TPA）在陽(yáng)性電極表面可同時(shí)失去一個(gè)電子而發(fā)生氧化反應(yīng)。二價(jià)的[Ru(bpy)3]2+被氧化成三價(jià)，成為強(qiáng)氧化劑，TPA失去電子后被氧化成陽(yáng)離子自由基TPA+，它很不穩(wěn)定，可自發(fā)地失去一個(gè)質(zhì)子（H+），形成自由基TPA.，成為一種很強(qiáng)的還原劑，可將一個(gè)高能量的電子遞給三價(jià)的[Ru(bpy)3]3+使其形成激發(fā)態(tài)的[Ru(bpy)3]2+.。3.電化學(xué)發(fā)光劑是指通過(guò)在電極表面進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)而發(fā)出光的物153.電化學(xué)發(fā)光劑激發(fā)態(tài)的三聯(lián)吡啶釕不穩(wěn)定，很快發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)為620nm的光子，回復(fù)到基態(tài)的三聯(lián)吡啶釕。這一過(guò)程可在電極表面周而復(fù)始地進(jìn)行，產(chǎn)生許多光子，使光信號(hào)增強(qiáng)。3.電化學(xué)發(fā)光劑激發(fā)態(tài)的三聯(lián)吡啶釕不穩(wěn)定，很快發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)16酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析就是利用酶對(duì)發(fā)光底物催化作用而直接發(fā)光，通過(guò)光強(qiáng)度的測(cè)定而直接進(jìn)行定量。酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析（雙抗體夾心法）

酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析就是利用酶對(duì)發(fā)光底物催化作用而直接發(fā)光，17化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)是免疫測(cè)定技術(shù)繼酶免技術(shù)（EIA）、放免技術(shù)（RIA）、熒光免疫技術(shù)（FIA）和時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)（TRFIA）之后發(fā)展的一項(xiàng)新興測(cè)定技術(shù)?；瘜W(xué)發(fā)光免疫技術(shù)是免疫測(cè)定技術(shù)繼酶免技術(shù)（EIA）、放免技術(shù)18化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)是一種高度敏感的微量測(cè)定技術(shù)，凡具有抗原性的物質(zhì)（包括半抗原）都可以用化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)測(cè)定。其起步于80年代初，快速發(fā)展于90年代，在國(guó)外化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的應(yīng)用處于蓬勃發(fā)展的階段。

化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)是一種高度敏感的微量測(cè)定技術(shù)，凡具有抗原性的19化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)具備以下特點(diǎn)：①高度敏感，極限達(dá)10-17~10-19M/L，遠(yuǎn)高于RIA、EIA、TRFIA。②特異性強(qiáng)，重復(fù)性好C.V.＜10％。③測(cè)定范圍寬，可達(dá)7個(gè)數(shù)量級(jí)。④試劑穩(wěn)定性好，無(wú)污染有效期6－12月。⑤操作簡(jiǎn)單，易于自動(dòng)化。在對(duì)環(huán)保很重視的國(guó)家，CLIA成了取代RIA的首選方法?；瘜W(xué)發(fā)光免疫技術(shù)具備以下特點(diǎn)：①高度敏感，極限達(dá)10-1720化學(xué)發(fā)光原理

化學(xué)發(fā)光檢測(cè)主要是借助抗原和抗體在體外特異結(jié)合后出現(xiàn)的各種現(xiàn)象，對(duì)樣品中的抗原或抗體進(jìn)行定性、定量、定位的檢測(cè)?？乖嚎烧T導(dǎo)動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的物質(zhì)?？贵w：由動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生，可特異性結(jié)合某種物質(zhì)的球蛋白。

化學(xué)發(fā)光原理化學(xué)發(fā)光檢測(cè)主要是借助抗原和抗體在體外特21化學(xué)發(fā)光反應(yīng)基本原理化學(xué)發(fā)光反應(yīng)基本原理22雙抗體夾心法（三明志法）原理試劑1酶標(biāo)記抗體待測(cè)物超順磁珠雙抗體夾心法（三明志法）原理試劑1酶標(biāo)記抗體待測(cè)物超順磁珠23夾心法的劑量--反應(yīng)關(guān)系曲線信號(hào)強(qiáng)度（Y）線性范圍待測(cè)物濃度（X）Hook(前滯)效應(yīng)分析靈敏度（最低檢測(cè)限）（95%可信度）：

S0+2SD在該曲線上所對(duì)應(yīng)的濃度值。功能靈敏度：測(cè)定誤差（變異）≤20%的最低可檢測(cè)濃度。線性范圍：（分析）功能靈敏度---變異≤20%的最高檢測(cè)濃度相關(guān)系數(shù)≥0.99的曲線范圍夾心法的劑量--反應(yīng)關(guān)系曲線信號(hào)強(qiáng)度（Y）線性范圍待測(cè)物濃度24競(jìng)爭(zhēng)法的原理待測(cè)物試劑1酶標(biāo)記抗原超順磁珠競(jìng)爭(zhēng)法的原理待測(cè)物試劑1酶標(biāo)記抗原超順磁珠25競(jìng)爭(zhēng)法的劑量--反應(yīng)關(guān)系曲線待測(cè)物濃度（X）信號(hào)強(qiáng)度（Y）線性范圍分析靈敏度（最低檢測(cè)限）（95%可信度）：

S0-2SD在該曲線上所對(duì)應(yīng)的濃度值功能靈敏度：測(cè)定誤差（變異）≤20%的最低可檢測(cè)濃度線性范圍：

（分析）功能靈敏度---變異≤20%的最高檢測(cè)濃度相關(guān)系數(shù)≥0.99的曲線范圍競(jìng)爭(zhēng)法的劑量--反應(yīng)關(guān)系曲線待測(cè)物濃度（X）信號(hào)強(qiáng)度（26發(fā)光免疫分析基本操作步驟（一步法）待測(cè)樣品酶標(biāo)記抗體或抗原磁場(chǎng)中洗滌去除未結(jié)合的反應(yīng)物發(fā)光底物儀器檢測(cè)反應(yīng)管反應(yīng)10分鐘反應(yīng)0-5分鐘超順磁珠標(biāo)記生物素的抗體或抗原發(fā)光免疫分析基本操作步驟（一步法）待測(cè)樣品酶標(biāo)記抗體或抗27發(fā)光免疫分析基本操作步驟（二步法）待測(cè)樣品洗滌去除未結(jié)合的反應(yīng)物發(fā)光底物儀器檢測(cè)反應(yīng)管反應(yīng)10分鐘反應(yīng)0-5分鐘酶標(biāo)記抗體或抗原洗滌去除未結(jié)合的反應(yīng)物反應(yīng)10分鐘超順磁珠標(biāo)記生物素的抗體或抗原發(fā)光免疫分析基本操作步驟（二步法）待測(cè)樣品洗滌去除未結(jié)合28化學(xué)發(fā)光的應(yīng)用傳染性疾病的檢測(cè)：HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb、anti-HCV、HIV等甲狀腺功能檢測(cè)：TT3、TT4、T3、T4、TSH糖尿病檢測(cè)：INS、C-P等腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)：AFP、CEA、PSA、fPSA、NSE、CA50、CA12-5、CA15-9、CA19-9等性腺激素檢測(cè)：E2、Testo、Prog、PRL、FSH、LH、HCG等化學(xué)發(fā)光的應(yīng)用傳染性疾病的檢測(cè)：HBsAg、HBsAb、HB29各品牌對(duì)比類別豐匯雅培羅氏貝克曼方法學(xué)檢測(cè)試劑酶促化學(xué)發(fā)光純液相反應(yīng)通用型納米免疫磁珠親和素-生物素免疫放大系統(tǒng)成熟的增強(qiáng)型魯米諾發(fā)光體系吖啶酯直接化學(xué)發(fā)光半液相反應(yīng)非通用型磁珠，磁珠上標(biāo)記抗體（抗原）電化學(xué)發(fā)光純液相反應(yīng)通用型納米免疫磁珠親和素-生物素免疫放大系統(tǒng)酶促化學(xué)發(fā)光純液相反應(yīng)通用型納米免疫磁珠親和素-生物素免疫放大系統(tǒng)堿性磷酸酶發(fā)光體系儀器性能及參數(shù)自動(dòng)化程度真正的全自動(dòng)無(wú)人伺候真正的全自動(dòng)無(wú)人伺候真正的全自動(dòng)無(wú)人伺候真正的全自動(dòng)無(wú)人伺候檢測(cè)速度單機(jī)檢測(cè)速度最快一步法：恒速400test/h；兩步法：恒速200test/h，自測(cè)試開(kāi)始第16.5分鐘出第一個(gè)測(cè)試結(jié)果，以后每隔9秒出一個(gè)結(jié)果最高速度200test/h最高速度180test/h100test/h操作模式隨機(jī)檢測(cè)，急診插入功能隨機(jī)檢測(cè)，急診插入功能隨機(jī)檢測(cè)，急診插入功能隨機(jī)檢測(cè)，急診插入功能反應(yīng)杯120個(gè)永久性免維護(hù)反應(yīng)杯一次性塑料杯，成本高一次性塑料杯，成本高一次性塑料杯，成本高各品牌對(duì)比類別豐匯雅培羅氏貝克曼方檢測(cè)酶促化學(xué)發(fā)光吖啶酯直接30各品牌對(duì)比(續(xù)上表）

豐匯雅培羅氏貝克曼儀器性能及參數(shù)加樣方式四智能加樣手，各試劑獨(dú)立加樣，杜絕交叉污染智能加樣手智能加樣手智能加樣手試劑位83個(gè)，超大獨(dú)立冷藏雙試劑盤獨(dú)立冷藏試劑位獨(dú)立冷藏試劑位獨(dú)立冷藏試劑位孵育方式金屬浴，溫度控制隨意可調(diào)，精度達(dá)±0.1度金屬浴金屬浴金屬浴攪拌方式雙獨(dú)立攪拌手單獨(dú)立攪拌手單獨(dú)立攪拌手單獨(dú)立攪拌手可用方法學(xué)夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法、間接法、特殊方法學(xué)可隨機(jī)編輯夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法、間接法夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法、間接法夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法、間接法最小反應(yīng)體積100ul＞200ul＞200ul＞200ul檢測(cè)方法單光子計(jì)數(shù)單光子計(jì)數(shù)單光子計(jì)數(shù)單光子計(jì)數(shù)靈敏度10pg/ml10pg/ml10pg/ml10pg/ml一次性耗材無(wú)有≥5元/test有≥5元/test有≥5元/test各品牌對(duì)比(續(xù)上表）

豐匯雅培羅氏貝克曼儀器性能及參數(shù)加樣31豐匯化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀豐匯化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀磁力清洗站磁力清洗站十二步清洗工作站十二步清洗工作站獨(dú)立的攪拌系統(tǒng)獨(dú)立的攪拌系統(tǒng)獨(dú)創(chuàng)永久性反應(yīng)裝置獨(dú)創(chuàng)永久性反應(yīng)裝置高精密度單光子計(jì)數(shù)系統(tǒng)高精密度單光子計(jì)數(shù)系統(tǒng)單光子計(jì)數(shù)器是目前高靈敏度發(fā)光檢測(cè)儀的核心部件光電倍增管高壓高速放大器高速比較器高速分頻器發(fā)光樣品產(chǎn)生光子激發(fā)光陰極產(chǎn)生光電子在陽(yáng)極上形成較強(qiáng)信號(hào)脈沖信號(hào)相對(duì)發(fā)光單位數(shù)字脈沖(RLU)在各打拿極之間得到能量和數(shù)目的倍增單光子計(jì)數(shù)器是目前高靈敏度光電倍增管高壓高速放大器高速比較器高精密度微量加樣系統(tǒng)高精密度微量加樣系統(tǒng)精準(zhǔn)的加樣手系統(tǒng)精準(zhǔn)的加樣手系統(tǒng)豐匯全自動(dòng)液相化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)具有完全自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)；速度快：全球最快的全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光，最高恒速可達(dá)600test/小時(shí)，目前雅培i2000理論速度為200test/小時(shí)實(shí)際速度為165test/小時(shí)左右；羅氏的電化學(xué)發(fā)光理論速度為180test/小時(shí)，實(shí)際速度150test/小時(shí)左右；全球首創(chuàng)永久性反應(yīng)杯：無(wú)一次性耗材（如一次性反應(yīng)杯、TIP頭等），大大節(jié)省用戶成本。豐匯全自動(dòng)液相化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)具有完全自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)；獨(dú)到、靈巧的暗室設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)為快速、準(zhǔn)確檢測(cè)反應(yīng)結(jié)果創(chuàng)造了有利條件；采用高靈敏度的PMT（光電倍增管）檢測(cè)系統(tǒng)?？梢赃_(dá)到快速檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定，靈敏度高，設(shè)備運(yùn)行無(wú)成本維護(hù)；樣品針采用特殊清洗方式，杜決交叉污染；化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀教材課件獨(dú)立的磁珠試劑攪拌工作站，磁珠試劑分布更加均勻，杜絕交叉污染；維護(hù)成本低、無(wú)一次性耗材，采用永久反應(yīng)杯，無(wú)需更換；操作簡(jiǎn)單方便，檢測(cè)速度快，大大減小醫(yī)護(hù)工作者的勞動(dòng)強(qiáng)度；儀器成本適中，適合各級(jí)別醫(yī)院使用，市場(chǎng)潛力巨大；獨(dú)立的磁珠試劑攪拌工作站，磁珠試劑分布更加均勻，杜絕交叉污染Thankyou!上海豐匯Thankyou!上海豐匯上海豐匯生物研究有限公司化學(xué)發(fā)光介紹上海豐匯生物研究有限公司化學(xué)發(fā)光介紹發(fā)光免疫技術(shù)發(fā)光免疫技術(shù)(luminescenceimmunoassay,LIA)是將發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種新的免疫分析技術(shù)。這種方法不僅具有發(fā)光分析的高靈敏度和抗原抗體反應(yīng)的高度特異性,而且還具有分離簡(jiǎn)便,可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析特點(diǎn),使之成為醫(yī)學(xué)、生物學(xué)研究領(lǐng)域中一種新的重要的免疫學(xué)分析手段。發(fā)光免疫技術(shù)發(fā)光免疫技術(shù)(luminescenceimmu46按化學(xué)反應(yīng)類型化學(xué)發(fā)光的分類酶促化學(xué)發(fā)光：辣根過(guò)氧化物酶系統(tǒng)：豐匯、強(qiáng)生堿性磷酸酶系統(tǒng)：貝克曼非酶促化學(xué)發(fā)光：

吖啶酯系統(tǒng)：雅培電化學(xué)發(fā)光：羅氏閃光（Flash）:按發(fā)光持續(xù)時(shí)間發(fā)光時(shí)間在數(shù)十分鐘以上，如：

HRP-Luminol系統(tǒng)

AP-AMPPD系統(tǒng)無(wú)須原位進(jìn)樣、以速率法測(cè)量。發(fā)光時(shí)間在數(shù)秒內(nèi)，如吖啶酯以原位進(jìn)樣(InSituInjector)和時(shí)間積分法測(cè)量輝光（Glow）:按化學(xué)反應(yīng)類型47時(shí)間發(fā)光信號(hào)輝光坪區(qū)速率法測(cè)量原位進(jìn)樣積分法測(cè)量閃光尖峰閃光與輝光及其測(cè)量方式的差別時(shí)間發(fā)光信號(hào)輝光坪區(qū)速率法測(cè)量原位進(jìn)樣積分法測(cè)量閃光尖峰閃光48

發(fā)光與化學(xué)發(fā)光劑一、發(fā)光一種物質(zhì)由電子激發(fā)態(tài)回復(fù)到基態(tài)時(shí)，釋放出的能量表現(xiàn)為光的發(fā)射，稱為發(fā)光(luminescence)。根據(jù)形成激發(fā)態(tài)分子的激發(fā)能可將發(fā)光分為三種類型:1.光照發(fā)光2.生物發(fā)光3.化學(xué)發(fā)光。發(fā)光與化學(xué)發(fā)光劑一、發(fā)光491.光照發(fā)光發(fā)光劑經(jīng)短波長(zhǎng)入射光照射后進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng)回復(fù)至基態(tài)時(shí)發(fā)出較長(zhǎng)波長(zhǎng)的可見(jiàn)光

。電子e光子基態(tài)能級(jí)1.光照發(fā)光發(fā)光劑經(jīng)短波長(zhǎng)入射光照射后進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng)回復(fù)至502.生物發(fā)光典型例子為螢火蟲(chóng)發(fā)光。反應(yīng)底物為螢火蟲(chóng)熒光素(fireflyluciferin)，在熒光素酶(luciferase)的催化下利用ATP產(chǎn)能，生成激發(fā)態(tài)的氧化螢火蟲(chóng)熒光素(oxyluciferin)，后者在回復(fù)到基態(tài)時(shí)多余的能量以光子形式放出。2.生物發(fā)光典型例子為螢火蟲(chóng)發(fā)光。反應(yīng)底物為螢火蟲(chóng)熒光素513.化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光是在常溫下經(jīng)化學(xué)反應(yīng)所產(chǎn)生的發(fā)射光?；瘜W(xué)發(fā)光是一個(gè)多步驟的過(guò)程，其機(jī)制為某些化合物(發(fā)光劑或發(fā)光底物)可以利用一個(gè)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的能量使其產(chǎn)物分子或反應(yīng)中間態(tài)分子上升至電子激發(fā)態(tài)。當(dāng)此產(chǎn)物分子或中間態(tài)分子衰退至基態(tài)時(shí)，以發(fā)射光子的形式釋放能量(即發(fā)光)。3.化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光是在常溫下經(jīng)化學(xué)反應(yīng)所產(chǎn)生的發(fā)射光。52化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)中常用的化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物

酶促反應(yīng)的發(fā)光底物直接化學(xué)發(fā)光劑電化學(xué)發(fā)光劑化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)中常用的化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物酶促反應(yīng)的531．酶促反應(yīng)的發(fā)光底物酶促反應(yīng)的發(fā)光底物是指經(jīng)酶的降解作用而發(fā)出光的一類發(fā)光底物，目前化學(xué)發(fā)光酶免疫技術(shù)中常用的酶有辣根過(guò)氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（ALP），相應(yīng)發(fā)光底物為：

HRP的發(fā)光底物：價(jià)格低廉、國(guó)內(nèi)技術(shù)成熟

ALP的發(fā)光底物：價(jià)格昂貴、國(guó)內(nèi)無(wú)成熟技術(shù)1．酶促反應(yīng)的發(fā)光底物酶促反應(yīng)的發(fā)光底物是指經(jīng)酶的降解作用而54(1)HRP的發(fā)光底物

常用的底物為魯米諾或其衍生物。魯米諾或其衍生物魯米諾的氧化反應(yīng)在堿性緩沖液中進(jìn)行。(1)HRP的發(fā)光底物常用的底物為魯米諾或其衍生物55（2）ALP的發(fā)光底物常用的底物為3-（2-螺旋金剛烷-4-甲氧基-4-甲基-4-（3-磷酸氧基）-苯基-1，2-二氧乙烷（AMPPD）和4-甲基傘形酮磷酸鹽（4-MUP，熒光底物）。（2）ALP的發(fā)光底物常用的底物為3-（2-螺旋金剛烷-4-56AMPPD

AMPPD在堿性條件下，被ALP酶解生成相當(dāng)穩(wěn)定的AMP-D陰離子，其有2-30min的分解半衰期，發(fā)出波長(zhǎng)為470nm的持續(xù)性光，在15min時(shí)其強(qiáng)度達(dá)到高峰，15~60min內(nèi)光強(qiáng)度保持相對(duì)穩(wěn)定。AMPPDAMPPD在堿性條件下，被ALP酶解生成相當(dāng)穩(wěn)定572．直接化學(xué)發(fā)光劑這類發(fā)光劑不需酶的催化作用，只需改變?nèi)芤旱膒H等條件就能發(fā)光，如吖啶酯（acridinium,AE）在含過(guò)氧化氫的稀堿溶液中即能發(fā)光。2．直接化學(xué)發(fā)光劑這類發(fā)光劑不需酶的催化作用，只需改變?nèi)芤旱?83.電化學(xué)發(fā)光劑是指通過(guò)在電極表面進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)而發(fā)出光的物質(zhì)?；瘜W(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]2+（圖19-1）和電子供體三丙胺（TPA）在陽(yáng)性電極表面可同時(shí)失去一個(gè)電子而發(fā)生氧化反應(yīng)。二價(jià)的[Ru(bpy)3]2+被氧化成三價(jià)，成為強(qiáng)氧化劑，TPA失去電子后被氧化成陽(yáng)離子自由基TPA+，它很不穩(wěn)定，可自發(fā)地失去一個(gè)質(zhì)子（H+），形成自由基TPA.，成為一種很強(qiáng)的還原劑，可將一個(gè)高能量的電子遞給三價(jià)的[Ru(bpy)3]3+使其形成激發(fā)態(tài)的[Ru(bpy)3]2+.。3.電化學(xué)發(fā)光劑是指通過(guò)在電極表面進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)而發(fā)出光的物593.電化學(xué)發(fā)光劑激發(fā)態(tài)的三聯(lián)吡啶釕不穩(wěn)定，很快發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)為620nm的光子，回復(fù)到基態(tài)的三聯(lián)吡啶釕。這一過(guò)程可在電極表面周而復(fù)始地進(jìn)行，產(chǎn)生許多光子，使光信號(hào)增強(qiáng)。3.電化學(xué)發(fā)光劑激發(fā)態(tài)的三聯(lián)吡啶釕不穩(wěn)定，很快發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)60酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析就是利用酶對(duì)發(fā)光底物催化作用而直接發(fā)光，通過(guò)光強(qiáng)度的測(cè)定而直接進(jìn)行定量。酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析（雙抗體夾心法）

酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析就是利用酶對(duì)發(fā)光底物催化作用而直接發(fā)光，61化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)是免疫測(cè)定技術(shù)繼酶免技術(shù)（EIA）、放免技術(shù)（RIA）、熒光免疫技術(shù)（FIA）和時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)（TRFIA）之后發(fā)展的一項(xiàng)新興測(cè)定技術(shù)?；瘜W(xué)發(fā)光免疫技術(shù)是免疫測(cè)定技術(shù)繼酶免技術(shù)（EIA）、放免技術(shù)62化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)是一種高度敏感的微量測(cè)定技術(shù)，凡具有抗原性的物質(zhì)（包括半抗原）都可以用化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)測(cè)定。其起步于80年代初，快速發(fā)展于90年代，在國(guó)外化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的應(yīng)用處于蓬勃發(fā)展的階段。

化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)是一種高度敏感的微量測(cè)定技術(shù)，凡具有抗原性的63化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)具備以下特點(diǎn)：①高度敏感，極限達(dá)10-17~10-19M/L，遠(yuǎn)高于RIA、EIA、TRFIA。②特異性強(qiáng)，重復(fù)性好C.V.＜10％。③測(cè)定范圍寬，可達(dá)7個(gè)數(shù)量級(jí)。④試劑穩(wěn)定性好，無(wú)污染有效期6－12月。⑤操作簡(jiǎn)單，易于自動(dòng)化。在對(duì)環(huán)保很重視的國(guó)家，CLIA成了取代RIA的首選方法?；瘜W(xué)發(fā)光免疫技術(shù)具備以下特點(diǎn)：①高度敏感，極限達(dá)10-1764化學(xué)發(fā)光原理

化學(xué)發(fā)光檢測(cè)主要是借助抗原和抗體在體外特異結(jié)合后出現(xiàn)的各種現(xiàn)象，對(duì)樣品中的抗原或抗體進(jìn)行定性、定量、定位的檢測(cè)?？乖嚎烧T導(dǎo)動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的物質(zhì)?？贵w：由動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生，可特異性結(jié)合某種物質(zhì)的球蛋白。

化學(xué)發(fā)光原理化學(xué)發(fā)光檢測(cè)主要是借助抗原和抗體在體外特65化學(xué)發(fā)光反應(yīng)基本原理化學(xué)發(fā)光反應(yīng)基本原理66雙抗體夾心法（三明志法）原理試劑1酶標(biāo)記抗體待測(cè)物超順磁珠雙抗體夾心法（三明志法）原理試劑1酶標(biāo)記抗體待測(cè)物超順磁珠67夾心法的劑量--反應(yīng)關(guān)系曲線信號(hào)強(qiáng)度（Y）線性范圍待測(cè)物濃度（X）Hook(前滯)效應(yīng)分析靈敏度（最低檢測(cè)限）（95%可信度）：

S0+2SD在該曲線上所對(duì)應(yīng)的濃度值。功能靈敏度：測(cè)定誤差（變異）≤20%的最低可檢測(cè)濃度。線性范圍：（分析）功能靈敏度---變異≤20%的最高檢測(cè)濃度相關(guān)系數(shù)≥0.99的曲線范圍夾心法的劑量--反應(yīng)關(guān)系曲線信號(hào)強(qiáng)度（Y）線性范圍待測(cè)物濃度68競(jìng)爭(zhēng)法的原理待測(cè)物試劑1酶標(biāo)記抗原超順磁珠競(jìng)爭(zhēng)法的原理待測(cè)物試劑1酶標(biāo)記抗原超順磁珠69競(jìng)爭(zhēng)法的劑量--反應(yīng)關(guān)系曲線待測(cè)物濃度（X）信號(hào)強(qiáng)度（Y）線性范圍分析靈敏度（最低檢測(cè)限）（95%可信度）：

S0-2SD在該曲線上所對(duì)應(yīng)的濃度值功能靈敏度：測(cè)定誤差（變異）≤20%的最低可檢測(cè)濃度線性范圍：

（分析）功能靈敏度---變異≤20%的最高檢測(cè)濃度相關(guān)系數(shù)≥0.99的曲線范圍競(jìng)爭(zhēng)法的劑量--反應(yīng)關(guān)系曲線待測(cè)物濃度（X）信號(hào)強(qiáng)度（70發(fā)光免疫分析基本操作步驟（一步法）待測(cè)樣品酶標(biāo)記抗體或抗原磁場(chǎng)中洗滌去除未結(jié)合的反應(yīng)物發(fā)光底物儀器檢測(cè)反應(yīng)管反應(yīng)10分鐘反應(yīng)0-5分鐘超順磁珠標(biāo)記生物素的抗體或抗原發(fā)光免疫分析基本操作步驟（一步法）待測(cè)樣品酶標(biāo)記抗體或抗71發(fā)光免疫分析基本操作步驟（二步法）待測(cè)樣品洗滌去除未結(jié)合的反應(yīng)物發(fā)光底物儀器檢測(cè)反應(yīng)管反應(yīng)10分鐘反應(yīng)0-5分鐘酶標(biāo)記抗體或抗原洗滌去除未結(jié)合的反應(yīng)物反應(yīng)10分鐘超順磁珠標(biāo)記生物素的抗體或抗原發(fā)光免疫分析基本操作步驟（二步法）待測(cè)樣品洗滌去除未結(jié)合72化學(xué)發(fā)光的應(yīng)用傳染性疾病的檢測(cè)：HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb、anti-HCV、HIV等甲狀腺功能檢測(cè)：TT3、TT4、T3、T4、TSH糖尿病檢測(cè)：INS、C-P等腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)：AFP、CEA、PSA、fPSA、NSE、CA50、CA12-5、CA15-9、CA19-9等性腺激素檢測(cè)：E2、Testo、Prog、PRL、FSH、LH、HCG等化學(xué)發(fā)光的應(yīng)用傳染性疾病的檢測(cè)：HBsAg、HBsAb、HB73各品牌對(duì)比類別豐匯雅培羅氏貝克曼方法學(xué)檢測(cè)試劑酶促化學(xué)發(fā)光純液相反應(yīng)通用型納米免疫磁珠親和素-生物素免疫放大系統(tǒng)成熟的增強(qiáng)型魯米諾發(fā)光體系吖啶酯直接化學(xué)發(fā)光半液相反應(yīng)非通用型磁珠，磁珠上標(biāo)記抗體（抗原）電化學(xué)發(fā)光純液相反應(yīng)通用型納米免疫磁珠親和素-生物素免疫放大系統(tǒng)酶促化學(xué)發(fā)光純液相反應(yīng)通用型納米免疫磁珠親和素-生物素免疫放大系統(tǒng)堿性磷酸酶發(fā)光體系儀器性能及參數(shù)自動(dòng)化程度真正的全自動(dòng)無(wú)人伺候真正的全自動(dòng)無(wú)人伺候真正的全自動(dòng)無(wú)人伺候真正的全自動(dòng)無(wú)人伺候檢測(cè)速度單機(jī)檢測(cè)速度最快一步法：恒速400test/h；兩步法：恒速200test/h，自測(cè)試開(kāi)始第16.5分鐘出第一個(gè)測(cè)試結(jié)果，以后每隔9秒出一個(gè)結(jié)果最高速度200test/h最高速度180test/h100test/h操作模式隨機(jī)檢測(cè)，急診插入功能隨機(jī)檢測(cè)，急診插入功能隨機(jī)檢測(cè)，急診插入功能隨機(jī)檢測(cè)，急診插入功能反應(yīng)杯120個(gè)永久性免維護(hù)反應(yīng)杯一次性塑料杯，成本高一次性塑料杯，成本高一次性塑料杯，成本高各品牌對(duì)比類別豐匯雅培羅氏貝克曼方檢測(cè)酶促化學(xué)發(fā)光吖啶酯直接74各品牌對(duì)比(續(xù)上表）

豐匯雅培羅氏貝克曼儀器性能及參數(shù)加樣方式四智能加樣手，各試劑獨(dú)立加樣，杜絕交叉污染智能加樣手智能加樣手智能加樣手試劑位