各生理指標實驗步驟

.z.1丙二醛〔MDA〕含量的測定丙二醛在酸性和高溫的條件下，可以和硫代巴比妥酸〔TBA〕反響生成紅棕色的三甲川，在532nm處有最大光吸收。植物組織中可溶性糖與TBA的顯色反響產(chǎn)物在450nm和532nm處也有吸收。測定時要排除可溶性糖的干擾，因此分別測定532nm和450nm處的吸光值，直接求得植物樣品提取液中MDA的濃度；MDA含量采用硫代巴比妥酸法測定。計算公式如下:C(μmol.L-1)=6.45OD532-0.56OD450進一步算出每克樣品鮮重中丙二醛的含量〔μmolg-1FW〕。試劑：10%三氯乙酸〔TCA〕：10g三氯乙酸定容于100ml0.6%硫代巴比妥酸：0.6g用10%三氯乙酸TCA定容于100ml試驗步驟:〔1〕取植物材料用液氮迅速研磨成粉，取0.2g左右材料，放入5ml離心管內(nèi)?！?〕參加5ml10%的三氯乙酸，提取30min后，10000r/min離心15min?！?〕取上清液2ml，參加2ml0.6%TBA，混勻，在100℃水浴中煮15min，冷卻，冷卻后再測量。〔4〕分別測定532nm和450nm處的吸光值。以2ml〔加TBA,水〕水代替提取液作為對照管。2蛋白質(zhì)含量測定考馬斯亮藍G-250法實驗原理：考馬斯亮藍G-250在游離狀態(tài)下呈紅色，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，前者最大光吸收?65nm，后者在595nm。在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)一色素結(jié)合物在595nm波長下的光吸收與蛋白質(zhì)含量成正比，故可用于蛋白質(zhì)的定量測定。儀器和試劑：牛血清白蛋白500微克/毫升：10ｍｇ蒸餾水定溶至100ｍｌ考馬斯亮藍G-250：10ｍｇ溶于5ml90％乙醇中，參加10ml85％的磷酸，用蒸餾水定溶于100ｍｌ操作步驟：1.標準曲線的制作：取4支試管，按下表配制不同濃度的牛血清白蛋白溶液各1毫升,參加5毫升考馬斯亮藍G-250試劑，搖勻，放置2分鐘后用10毫米光徑的比色杯在595nm下比色。做出標準曲線。管號1234蛋白質(zhì)含量(微克)050100150500微克/毫升牛血00.10.20.3清白蛋白量〔毫升〕蒸餾水量(毫升)1.00.90.80.7考馬斯亮藍-G2505555〔毫升〕2.樣品中可溶性蛋白質(zhì)的提取測定：稱取植物葉片0.2克，用5ml蒸餾水或緩沖液研磨成勻漿后，過濾，取濾液l.0ml(視蛋白質(zhì)含量適當(dāng)稀釋)于試管中，參加5毫升考馬斯亮藍G-250試劑，搖勻，放置2分鐘后用10毫米光徑的比色杯在595nm下比色，以空白管調(diào)零，測定吸光度。根據(jù)吸光度查標準曲線，求出樣品中的蛋白質(zhì)含量。3.結(jié)果計算樣品中的蛋白質(zhì)含量(mg/g)=(C·Vt)/(1000Vs·WF)式中：C--查標準曲線值〔ug〕Vt一提取液總體積(ml)WF一樣品鮮重(g):Vs一測定時加樣量(ml)。

3脯氨酸〔Pro〕含量的測定藥品：3%的磺基水楊酸：3g磺基水楊酸溶在100ml水中。2.5%酸性茚三酮顯色液：冰乙酸和6mol/l磷酸以3：2混合，作為溶劑進展配制：即2.5g茚三酮溶解在60ml冰乙酸和40ml磷酸中，磷酸是16.4ml和23.6ml水中。脯氨酸標準溶液：稱取25mg脯氨酸，用蒸餾水定溶至250ml。1.標準曲線制作〔1〕取4支具塞刻度試管按下表參加各試劑。試管號0246脯氨酸標準溶液(ml)00.20.61.0水〔ml〕1.00.80.40冰乙酸〔ml〕1111茚三酮顯色液〔ml〕1.51.51.51.5脯氨酸含量〔μg〕02610混勻后在沸水中加熱20min?！?〕取出冷卻后向各管參加5ml甲苯充分振蕩，以萃取紅色物質(zhì)。靜置待分層后吸取甲苯層以0號管為對照在520nm波長下比色。〔3〕以消光值為縱坐標，脯氨酸含量為橫坐標，繪制標準曲線，求線性回歸方程。2.樣品提取測定〔l〕提?。杭羲槿~片0.2g，置于大試管中，參加5m13%磺基水楊酸溶液，管口加蓋保鮮膜，于沸水浴中浸提l0min?！?〕取出試管，待冷卻至室溫后，吸取上清液2ml，加2m1冰乙酸、2m1水和4ml顯色液，于沸水浴中加熱4從標準曲線中查出測定液中脯氨酸濃度，按下式計算樣品中脯氨酸含量脯氨酸含量〔μg?g-1〕〔鮮重〕＝〔C·V〕·〔a·W〕-1式中：C一提取液中脯氨酸含量，由標準曲線求得；V一提取液總體積〔ml〕；a一測定時所吸取的體積〔ml〕：W一樣品重〔g〕4相對電導(dǎo)率的測定1.取已處理的葉片,用打孔器取小圓葉片20片〔或稱取0.5克〕,放入小燒杯中，每個處理三次重復(fù)。2．向燒杯中各參加25ml蒸餾水浸半小時。3．用電導(dǎo)儀測各個處理松針外滲液的電導(dǎo)率和蒸餾水電導(dǎo)率。4.各燒杯用保鮮膜蓋上，于水浴鍋中沸水浴半小時，冷卻補充蒸餾水25ml，測定煮沸電導(dǎo)率。令測蒸餾水電導(dǎo)率葉綠素含量的測定：丙酮乙醇混合法1將丙酮、無水乙醇按照1:1=5ml:5ml比例配成混合浸提液。2.稱取0.2克葉片，剪成細絲于盛有混合液的試管中，加保鮮膜蓋于暗處，浸提，隔一定時間觀察浸提情況，以材料完全變白為準，用混合液作空白調(diào)零，測定663nm、645nm處光密度，一般隔夜測定。1取葉片剪碎0.2克，用少量80%的丙酮研磨至勻漿，過濾，用80%丙酮定溶至25ML，測測定663nm、645nm處光密度。每次測量做3次重復(fù)。4超氧化物岐化酶活性〔SOD〕的測定其中:ACK:照光對照管的吸光度AE:樣品管的吸光度VT:提取的酶液總體積Vt:反響時所用酶液體積WF:植物材料的鮮重試劑：磷酸緩沖液pH=7.8：內(nèi)含1%聚乙烯毗咯烷酮PVP微量取A:Na2HPO4溶液91.5ml,取B：NaH2PO4溶液8.5ml，稀釋至200ml即為緩沖液。A:Na2HPO4溶液：Na2HPO412H2O71.64g,用蒸餾水定溶至1000ml.B：NaH2PO4溶液：NaH2PO42H2O31.2g,用蒸餾水定溶至1000ml.0.013mol/L甲硫氨酸溶液(Met)：稱取1.9399gMet,用磷酸緩沖液溶解并定溶至100ml.自配6.3×10-6氮藍四唑〔NBT〕:稱取0.06133gNBT，用磷酸緩沖液溶解并定溶至100ml,避光保存。自配6.5×10-6molL-1核黃素：稱取0.0075g核黃素，定溶至100ml,避光保存，隨用隨配。自配1×10-4molL-1乙二胺四乙酸鈉EDTA-Na2:0.003721g用磷酸緩沖液溶解并定溶至100ml.反響液：0.3ml0.013mol/L甲硫氨酸，0.3ml63×10-6氮藍四唑，0.3ml1×10-4molL-1乙二胺四乙酸鈉,2.4ml磷酸緩沖液,0.5ml蒸餾水H2O，總計3.8ml。試驗步驟:〔1〕取植物材料0.2g用磷酸緩沖液迅速研磨成粉，放入5ml離心管內(nèi)。〔2〕參加5ml磷酸緩沖液，提取30min后，在4℃下10000r/min離心15min?！?〕取上清液0.1ml放在試管中，加反響液，加0.3ml核黃素，于30℃、4級光照培養(yǎng)箱內(nèi)反響7-8min。〔4〕立即測定560nm處的吸光值。另準備2個管，一個黑暗作為調(diào)零，一個作為對照照光。參加如下試劑〔0.1ml緩沖液，3.8ml反響液,加0.3ml核黃素〕。注意：做之前先做幾個，看看酶液濃度，切勿大量做。過氧化物酶活性〔POD〕的測定磷酸緩沖液〔100mmol/LPH=6〕配制:12.3mlNa2HPO4和87.7mlNaH2PO4混合，稀釋至200ml。Na2HPO4和NaH2PO4配法與SOD一樣。反響混合液:100mmol/L磷酸緩沖液100ml，參加愈創(chuàng)木酚56微升，于磁力攪拌器上加熱攪拌，直至愈創(chuàng)木酚溶解，待冷卻后參加30%H2O238微升，混合均勻，保存于冰箱中。酶活性的測定:取2只比色杯，一只中參加反響混合液3ml,磷酸緩沖液1ml作為校零對照，另一只參加反響混和液3ml,上述酶液1ml,立即開動秒表計時，與分光光度計470nm波長下測量值，每隔1min讀數(shù)一次，以每分鐘OD變化值表示酶活性的大小，POD活性=OD470·Vt/w·vs·t·0.01OD470–反響時間內(nèi)吸光度的變化W–葉片鮮重gt反響時間minVt提取液總體積Vs測定時取用酶液體積CAT過氧化氫酶的測定粗酶液0.2ML加PH7.8的緩沖液1.5ML，加蒸餾水1ML，于25度預(yù)熱10min，加0.3ml0.1mol/lH2O2,立即計時比色，240nm下測定，每隔1min讀數(shù)一次，4min.0.1mol/lH2O2配制：取30%的H2O2溶液5.6ml,用蒸餾水稀釋至1000ml.

4抗壞血酸〔維生素c〕含量的測定--滴定法維生素c具有很強的復(fù)原性，染料2,6-二氯酚靛酚具有較強的氧化性，在酸性溶液中呈紅色，在中性或堿性溶液中呈藍色。因此當(dāng)用藍色的堿性2,6-二氯酚靛酚溶液滴定含有抗壞血酸的草酸溶液時，其中的抗壞血酸可以將2,6-二氯酚靛酚復(fù)原成無色的復(fù)原型。但當(dāng)溶液中的抗壞血酸完全被氧化之后，則再滴2,6-二氯酚靛酚就會使溶液呈紅色。借此可以指示滴定終點，根據(jù)滴定用去的標準2,6-二氯酚靛酚溶液的量，可以計算出被測樣品中抗壞血酸的含量。植物材料：試劑：2%草酸:2，6-二氯酚靛酚溶液：50mg2，6-二氯酚靛酚溶解于200ml含有52mg的NaHCO3的熱水中，冷卻后，稀釋至250ml.標準抗壞血酸溶液：50mg抗壞血酸溶解于少量的2%的草酸溶液中，然后用2%草酸定溶至500ml.操作方法：〔1〕稱取樣品10g，放在研缽中參加2%草酸溶液研磨，定容100ml，過濾，濾液備用?！?〕染料的標定：取10ml標準抗壞血酸溶液至蒸發(fā)皿中，以2，6—二氯酚靛酚溶液滴定至粉紅色，并在30s內(nèi)不褪色為終點。計算lml染料相當(dāng)于抗壞血酸的毫克數(shù)〔重復(fù)2次，取平均值〕。〔3〕樣品滴定：取濾液10ml于蒸發(fā)皿中，用已標定過的2，6—二氯酚靛酚溶液滴定至粉紅色，并且在30s內(nèi)不褪色為止，記下染料的用量〔重復(fù)2次，取平均值〕。〔4〕空白滴定：取2%草酸10ml于蒸發(fā)皿中，用已標定過的2，6—二氯酚靛酚溶液滴定至粉紅色，并且在30s內(nèi)不褪色為止，記下染料的用量式中：W為100g樣品中含維生素c的毫克數(shù)；Y0為滴定空白所用染料毫升數(shù)；y1為滴定樣品所用染料毫升數(shù)；A為與1ml染料溶液相當(dāng)?shù)目箟难岬暮量藬?shù)；B為樣品的克數(shù)；*為滴定時吸取樣品溶液的體積，ml；Z為樣品溶液定容后的總體積。植物體內(nèi)可溶性糖含量的測定〔蒽酮法〕〔1〕200μg/ml蔗糖糖：100mg，蒸餾水溶解，定容至500ml〔2〕蒽酮試劑：0.5g蒽酮，用乙酸乙酯溶解，定容至25ml，棕色瓶避光〔3〕濃硫酸：實驗方法1．葡萄糖標準曲線的制作：取6支20ml具塞試管，編號，按下表數(shù)據(jù)配制一系列不同濃度的標準葡萄糖溶液。在每管中均參加0.5ml蒽酮試劑，再緩慢地參加5ml濃H2SO4，搖勻后，翻開試管塞，置沸水浴中煮沸10分鐘，取出冷卻至室溫，在630nm波長下比色，測各管溶液的光密度值〔OD〕，以標準葡萄糖含量為橫坐標，光密度值為縱坐標，作出標準曲線。

2．樣品中可溶