流式細胞術基本原理課件

流式細胞術基本原理陳曉東

產品技術專員廣州市珈源醫(yī)學試劑有限公司第1頁，共51頁。流式細胞術流式細胞術（FlowCytometry,簡稱FCM）是一種可以快速、準確、客觀，并且同時檢測單個微粒（通常是細胞）的多項特性的技術，同時可以對特定群體加以分選研究對象為生物顆粒，如各種細胞、染色體、微生物、及人工合成微球等研究的微粒特性包括多種物理及生物學特征，并加以定量第2頁，共51頁。流式細胞儀的特點單個細胞/生物顆粒分析同時多參數、多熒光分析高通量檢測/高速度10000個細胞/秒以上定性/定量分析分選特定性狀或功能的細胞可檢測的樣本種類多樣(1)外周血，骨髓，細針穿刺，洗脫液，實體組織，培養(yǎng)細胞(2)血清、血漿、培養(yǎng)上清、細胞裂解液第3頁，共51頁。目前流式細胞儀可以檢測的類別細菌浮游生物DM：0.2μm——15μm

單核細胞中性粒細胞淋巴細胞紅細胞第4頁，共51頁。第5頁，共51頁。流式細胞儀的基本構造

激光發(fā)射器發(fā)出所需要的波長的激光前向散射光檢測器側向散射光檢測器光學濾鏡流動室與液流系統：將細胞單個壓入流動室信號收集與數據處理系統光源與光學系統第6頁，共51頁。InjectorTip熒光信號聚焦的激光光束鞘液流動室第7頁，共51頁。當光子遇到濾片時，光子或通過濾片，或被濾片吸收，或被濾片反射。光學濾片第8頁，共51頁。光學濾片的種類長通濾片（LP）：630LP短通濾片（SP）：550SP帶通濾片（BP）:488/10第9頁，共51頁。第10頁，共51頁。共有兩類：散射信號與熒光信號前向角散射信號（FSC） 反映細胞大小側向角散射信號（SSC） 反映細胞顆粒度熒光信號（FLSignals）（FL1、2、3……） 胞內、胞外染色情況流式細胞儀可獲取的信號種類第11頁，共51頁。FSC和SSC直方圖流式細胞儀顯示圖的種類第12頁，共51頁。把前向散射光圖和側向散射光圖的一維圖像在二維圖像上投影，便是我們平常所看到的流式圖。所以橫坐標表示的是細胞的直徑大??；縱坐標表示的是細胞的復雜程度。兩者相結合就能說明細胞種類散點圖第13頁，共51頁。二維等高圖和密度圖第14頁，共51頁。假三維圖與三維圖Pseudo3DPlot3DPlot第15頁，共51頁。流式細胞儀如何獲取細胞信號？FSCSSCFL第16頁，共51頁。前向角信號（ForwardScatter，FSC）第17頁，共51頁。前向角信號：細胞的大小第18頁，共51頁。FSCCountFSCCount101000第19頁，共51頁。側向角信號（SideScatter，SSC）第20頁，共51頁。SSCCountSSCCount101000第21頁，共51頁。FL第22頁，共51頁。countFL第23頁，共51頁。FSC、SSC、FL第24頁，共51頁。如何分離90°角內的各種熒光信號？第25頁，共51頁。熒光染料吸收某一波長的光波后能發(fā)射出大于吸收光波長的光波的物質激發(fā)光PI488n>600nm第26頁，共51頁。熒光染料種類熒光染料激發(fā)波長(nm)發(fā)射波長(nm)用途顏色FITC488525免疫熒光綠色PE(RD1)488575免疫熒光橙色

PerCP 488 670免疫熒光

紅色PI488620DNA染色

橙紅ECD488620免疫熒光橙紅PeCy5488675免疫熒光

紅色APC633 670免疫熒光紅色DAPI359462DNA染色藍色第27頁，共51頁。熒光染料光譜特征第28頁，共51頁。熒光分離原則在流式細胞儀中，一般經過LP或SP濾片將熒光大致分開后，再經過一BP濾片分離出特征熒光第29頁，共51頁。開放式光路Calibur、Influx流式細胞儀的光路第30頁，共51頁。封閉式光路（CantoⅡ、LSR系列、Aria系列）第31頁，共51頁。分選將目標細胞分離并富集，進行后續(xù)研究。分選純度>99%第32頁，共51頁。震蕩激光第33頁，共51頁。偏轉板FluorescenceActivatedCellSorting488

nm

laser+-ChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetector第34頁，共51頁。幾個概念信號放大模式信號類型CV值樣本流速激光延遲液滴延遲熒光補償閾值門對照第35頁，共51頁。信號放大PMT將光信號轉換成電信號，調整PMT的電壓，信號強度將隨之改變光信號光電倍增管（PMT）放大器電信號放大器兩種放大方式：線性放大（lin）對數放大（log）第36頁，共51頁。線性放大（lin）按光強度的線性關系輸出信號.適用于在較小范圍內變化的信號以及代表生物過程的信號，如DNA含量、總蛋白含量等。第37頁，共51頁。對數放大（log）按光強度的對數關系輸出信號.在免疫學測量中通常使用對數放大。第38頁，共51頁。電脈沖信號類型將與電脈沖信號強弱相關的電壓數字化有三類電脈沖信號高度信號H面積信號A寬度信號W第39頁，共51頁。CV值CV值（變異系數）：樣品均一度及儀器分辨率的標志CV值一般<2%第40頁，共51頁。樣本流速第41頁，共51頁。高流速：一般用于定性分析，如免疫分型。采集速度快,但分辨率低.低流速：一般用于對分辨率要求較高的分析，如DNA分析。樣本流速選擇第42頁，共51頁。激光延遲（laserdelay）Laser1Laser2第43頁，共51頁。液滴延遲（dropdelay）第44頁，共51頁。顏色補償采用合適的方法校正熒光染料之間疊加所造成的誤差。在完成雙色以上熒光標記的樣本時，都需要作顏色補償。第45頁，共51頁。FITC主要由FITC的檢測器檢測，但部分光也會進入PE檢測器。如果單染FITC，同時打開PE檢測器，則如圖：理想狀態(tài)實際情況補償效果陰性對照第46頁，共51頁。閾值

信號放大過程會產生不需要的脈沖信號，通常來自于碎片。通過設定某一信號的最低強度值，可將不需要的脈沖信號去除，這一設定值稱為閾值。屏蔽噪音信號和碎片信號第47頁，共51頁。門（Gate）分析/分選感興趣的細胞群第48頁，共51頁。對照同型對照：為沒有特異性、與熒光抗體蛋白亞型一致的免疫球蛋白，通常是未進行免疫小鼠血清的純化IgG1或IgG2，用于檢測和消除（一抗）非特異性結合到組織細胞而產生的背景染色?？瞻讓φ眨杭床贿M行標記的細胞。主要用于確定待測標本的基礎熒光閾值或檢測染色方法時候成功。陽性對照：即已知表達某種抗原的細胞（陽性細胞）進行平行實驗，通常用于檢測抗體是否有問題或確定實驗方法的穩(wěn)定性、準確性。第49頁，共51頁。

謝謝！第50頁，共51頁。內容梗概流式細胞術基本原理。陳曉東產品技術專員。研究對象為生物顆粒，如各種細胞、染色體、微生物、及人工合成微球等。高通量檢測/高速度10000個細胞/秒以上。(2)血清、血漿、培養(yǎng)上清、細胞裂解液。DM：0.2μm——15μm。流動室與液流系統：將細胞單個壓入流動室。共有兩類：散射信號與熒光信號。熒光信號（FLSignals）（FL1、2、3。把前向散射光圖和側向散射光圖的一維圖像在二維圖像上投影，便是我們平常所看到的流式圖。所以橫坐標表示的是細胞的直徑大小?？v坐標表示的是細胞的復雜程度。Pseudo3DPlot。側向角信號（SideScatter，SSC）。FSC、SSC、FL。封閉式光路（CantoⅡ、LSR系列、Ar