蛋白質研究技術平臺

蛋白質研究技術平臺梁潔開放實驗室2008.6.19蛋白質研究技術平臺共32頁，您現在瀏覽的是第1頁!蛋白質相關技術蛋白質樣品的制備蛋白質濃度的測定蛋白質免疫印跡（westernblot)蛋白質相互作用研究蛋白質研究技術平臺共32頁，您現在瀏覽的是第2頁!蛋白質樣品制備單層貼壁細胞總蛋白的提?。?1)收集細胞（1*106以上）(2)加入適量含蛋白酶抑制劑的裂解液(3)冰上裂解(4)4℃下12000rpm離心5min,取上清，-20℃保存組織中總蛋白的提取(1)取組織塊（約0.1g)剪碎,加液氮磨碎、勻漿、超聲處理(2)4℃下12000rpm離心15min,取上清，-20℃保存(3)膜蛋白需用更劇烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要超濾(4)組織中的蛋白酶活性更強，需要注意抑制蛋白酶的活性蛋白質研究技術平臺共32頁，您現在瀏覽的是第3頁!產品名稱

Western及IP裂解液RIPA裂解液（強）)RIPA裂解液（中）RIPA裂解液（弱）NP-40裂解液

SDS裂解液產品價格138.00元168.00元168.00元168.00元168.00元168.00元有效裂解成分

1%TritonX-1001%TritonX-100,1%deoxycholate,0.1%SDS1%NP-40,0.5%deoxycholate,0.1%SDS1%NP-40,0.25%deoxycholate1%NP-401%SDS裂解強度

溫和

強

中

溫和

溫和

強

對膜蛋白的裂解一般很好較好一般一般很好對胞漿蛋白的裂解很好很好很好很好很好很好對核蛋白的裂解較好很好較好較好較好很好胞漿磷酸化蛋白檢測很好很好很好很好很好很好細胞核轉錄因子檢測很好很好很好很好很好很好含蛋白酶抑制劑

是

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是

是

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含磷酸酯酶抑制劑是

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是

各種細胞裂解液比較蛋白質研究技術平臺共32頁，您現在瀏覽的是第4頁!蛋白質濃度測定Bradford法測定蛋白質濃度試劑G250考馬斯亮藍溶液：

0.15mol/LNaCl：

1mg/ml牛血清白蛋白（BSA）標準曲線

0μg2.5μg5.0μg10.0μ20.0μg40.0μg1mg/mlBSA2.5μl5.0μl10.0μl20.0μl40.0μl0.15mol/LNaCl100μl97.5μl95.0μl95.0μl80.0μl60.0μlG250考馬斯亮藍溶液1ml1ml1ml1ml1ml1mlR2=0.999蛋白質研究技術平臺共32頁，您現在瀏覽的是第5頁!蛋白質核酸測定儀蛋白質研究技術平臺共32頁，您現在瀏覽的是第6頁!蛋白質免疫印跡（WB)過程Figure1.SDS蛋白質研究技術平臺共32頁，您現在瀏覽的是第7頁!SDS所需儀器蛋白質電泳儀蛋白質研究技術平臺共32頁，您現在瀏覽的是第8頁!配膠所需材料試劑10％分離膠（10ml）4％濃縮膠（5ml）超純水4ml3.6ml30％Acr/Bic（29：1）3.33ml0.66ml1.5mol/LTris·HCl（pH8.8）2.5ml－0.5mol/LTris·HCl（pH6.8）－0.63ml10％SDS100l50l10%AP（過硫酸胺）100l50lTEMED5l5l蛋白質研究技術平臺共32頁，您現在瀏覽的是第9頁!半干法轉移槽使用說明膜濾紙膠濾紙正極負極蛋白質研究技術平臺共32頁，您現在瀏覽的是第10頁!Westernblot操作流程配膠：根據蛋白質分子量配制相應濃度的SDS電泳：以5－100μg蛋白量上樣，電泳至溴酚蘭跑到底部。轉印：剪下適當大小的PVDF膜，把膠鋪在負極濾紙上，上面小心覆蓋泡好的PVDF膜，夾好后倒入電轉緩沖液，加入冰格，100V轉移1小時。封閉：膜加封閉液（5％脫脂牛奶inTBS-T）,室溫1h.抗體孵育：加一抗（1：1000）4℃孵育過夜，TBST洗三次，3x10min；加二抗（1：20000）室溫1h，TBS-T洗三次，3x10min；顯影：膜上加同體積ECLA，B液（100μl/cm2),依照熒光強度而定曝光時間，顯影1、5、15min,定影10min.保存：X-膠片干后，將分子量和加樣順序標記上，把日期，抗體名稱，孵育時間寫上。把膜保存在－20℃以備以后使用。蛋白質研究技術平臺共32頁，您現在瀏覽的是第11頁!Westernblot常見問題1、技術問題（1）電泳（2）轉膜2、抗體問題（特異性、濃度）3、蛋白質豐度4、熒光淬滅（蛋白量過大）蛋白質研究技術平臺共32頁，您現在瀏覽的是第12頁!Westernblot常見問題1、加樣量2、ECL試劑3、曝光時間蛋白質研究技術平臺共32頁，您現在瀏覽的是第13頁!Westernblot常見問題4#：加樣量過多蛋白質研究技術平臺共32頁，您現在瀏覽的是第14頁!在做WesternBlot時，PBDF膜用甲醇浸泡的目的？

解答：PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團，使它更容易跟帶負電的蛋白質結合，做小分子的蛋白轉移時多加甲醇也是這個目的。Westernblot常見問題蛋白質研究技術平臺共32頁，您現在瀏覽的是第15頁!蛋白分子量大小分別為21kd、28kd，用的是濕轉，請問多大電流，多長時間比較合適？

解答：分子量比較小，最好是用干轉，濕轉效率太高，易轉過了。干轉的話，用2.5A/cm2，30min就應該夠了。濕轉，按照bio-rad的說明，用100mA，也得要半個多小時吧。Westernblot常見問題蛋白質研究技術平臺共32頁，您現在瀏覽的是第16頁!Westernblot結果如何分析目的蛋白110kd蛋白質研究技術平臺共32頁，您現在瀏覽的是第17頁!蛋白質樣品制備試劑RIPA裂解配方：50mMTris-HClpH7.4、150mMNaCl、1mMPMSF、1mMEDTA、1%Tritonx-100、1%脫氧膽酸鈉、0.1%SDS蛋白酶抑制劑：1mMPMSF,Aprotinin1μg/ml,Leupeptin5μg/ml,pepestatin1μg/ml,AEBSF50μg/ml,Bestatin10μg/ml,E-641μg/mlPMSF儲存液：溶于異丙醇1.74mg/ml(10mmol/L)或17.4mg/ml(100mmol/L),分裝后保存于-20℃，使用時稀釋至1mmol/L，現用現加。蛋白質研究技術平臺共32頁，您現在瀏覽的是第18頁!方法靈敏度時間原理干擾物質說明紫外吸收法較為靈敏50～100mg，比色杯的最小測量體積為0.1ml快速5～10分鐘蛋白質中的酪氨酸和色氨酸殘基在280nm處的光吸收各種嘌吟和嘧啶；各種核苷酸用于層析柱流出液的檢測；不消耗樣品，測定后樣品仍能回收利用Folin－酚試劑法（Lowry法）靈敏度高～5mg慢速

40～60分鐘雙縮脲反應；磷鉬酸－磷鎢酸試劑被Tyr和Phe還原硫酸銨；Tris緩沖液；甘氨酸；各種硫醇耗費時間長；操作要嚴格計時；顏色深淺隨不同蛋白質變化;標準曲線不是嚴格的直線形式，且專一性差考馬斯亮藍法(Bradford法)靈敏度更高1～5mg,最小測量體積0.1ml快速5～15分鐘考馬斯亮藍染料與蛋白質結合時，其lmax由465nm變?yōu)?95nm強堿性緩沖液；TritonX-100;SDS較好的方法；干擾物質少；顏色穩(wěn)定；顏色深淺隨不同蛋白質變化;標準曲線有輕微的非線性BCA法靈敏度非常高20～200mg,微量BCA為0.5～10mg較快速,40分鐘內在堿性環(huán)境下蛋白質與Cu2+絡合并將Cu2+還原成Cu1+螯合劑；略高濃度的還原劑抗干擾能力強，蛋白不可逆的變性蛋白質測定方法比較蛋白質研究技術平臺共32頁，您現在瀏覽的是第19頁!Bradford蛋白濃度測定試劑盒1.完全溶解蛋白標準品，取10l稀釋至100l

，使終濃度為0.5mg/ml?？梢杂?.9%NaCl或PBS稀釋標準品。2.將標準品按0,1,2,4,8,12,16,20微升分別加到96孔板中，加標準品稀釋液補足到20微升。3.

加適當體積樣品到96孔板的樣品孔中，加標準品稀釋液到20微升。4.

各孔加入200微升G250染色液，室溫放置3-5分鐘。5.

用酶標儀測定A595，或560-610nm之間的其它波長的吸光度。6.

根據標準曲線計算出樣品中的蛋白濃度。蛋白質研究技術平臺共32頁，您現在瀏覽的是第20頁!蛋白質免疫印跡(WB)原理protein.molecularstation./id/protein/western-blot/蛋白質研究技術平臺共32頁，您現在瀏覽的是第21頁!蛋白質免疫印跡（WB)過程Figure2.WesternBlot蛋白質研究技術平臺共32頁，您現在瀏覽的是第22頁!SDS聚丙烯酰胺凝膠（SDS)的有效分離范圍丙烯酰胺濃度（%)線性分離范圍（kDa)1510-431212-601020-807.536-94蛋白質研究技術平臺共32頁，您現在瀏覽的是第23頁!蛋白質轉印槽半干轉印槽浸漬轉印槽蛋白質研究技術平臺共32頁，您現在瀏覽的是第24頁!Westernblot所需材料還原型5×SDS上樣緩沖液

5×電泳液緩沖液浸漬式轉移緩沖液或半干式轉移緩沖液TBST或PBST緩沖液封閉液（抗體稀釋液）

洗脫抗體緩沖液化學發(fā)光試劑（ECL）顯影液和定影液抗體Mark蛋白質研究技術平臺共32頁，您現在瀏覽的是第25頁!紋理和脫尾現象：樣品溶解不佳，加樣前離心蛋白帶過寬：鄰近泳道的蛋白加樣量過多指示劑成微笑符號：凝膠不均勻冷卻指示劑成哭泣符號：凝膠和玻璃板組成“三明治”底部有氣泡凝膠時間不對：凝膠太慢可能是TEMED、APS劑量不足或失效；凝膠太快：TEMED、APS用量過多，膠太硬易裂SDS常見問題蛋白質研究技術平臺共32頁，您現在瀏覽的是第26頁!1、背景過深2、抗體特異性3、洗膜時間Westernblot常見問題蛋白質研究技術平臺共32頁，您現在瀏覽的是第27頁!Westernblot常見問題1、蛋白質降解2、蛋白質分子量內參蛋白質研究技術平臺共32頁，您現在瀏覽的是第28頁!Westernblot常見問題

免疫組化和WesternBlot可以用同一種抗體嗎？

解答：免疫組化時抗體識別的是未經變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬于構象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構象型表位由于受蛋白空間結構限制，煮后變性會消失。如果抗體識別的是蛋白上連續(xù)的幾個氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時用于免疫組化和Western，而如果抗體識別構象形表位，則只能用于免疫組化。一般抗體說明書上都有注明此種抗體識別的氨基酸區(qū)間。蛋白質研究技術平臺共32頁，您現在瀏覽的是第29頁!不能很好地將大分子量蛋白轉移到膜上，轉移效率低怎么樣解決？

解答：可以考慮：轉移緩沖液中加入20%甲醇（是指終濃度）(優(yōu)化的轉移緩沖液，可以參考《蛋白質技術手冊》)，因為甲醇可降低蛋白質洗脫效率，但可增加蛋白質和PVDF膜的結合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對高分子量蛋白質可延長轉移時間；轉移緩沖液加入終濃度0.1%SDS，也是為了增加轉移效率；用優(yōu)質的轉移膜，或使用小孔徑的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交聯；低濃度膠，如低至6％。太大時還可以考慮用瓊脂糖膠；提高轉移電壓／電流；增加轉移時間。Westernblot常見問題