實驗三-藥物敏感試驗和消毒滅菌課件

實驗三消毒滅菌和藥敏試驗實驗內(nèi)容和要求1.掌握藥敏試驗的原理、步驟、結(jié)果及意義2.掌握常用的消毒與滅菌技術(shù)3.熟悉紫外線殺菌試驗的原理4.了解細(xì)菌L型的誘導(dǎo)和菌落類型3一、藥敏試驗在感染性疾病防治中的意義

近年來，由于各種抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致耐藥菌株的迅速增多。尤其是廣譜及超廣譜抗生素的普遍使用，造成耐藥菌株大量出現(xiàn)，給臨床治療帶來極大的困難。同時，由于不合理的使用抗生素，治療的失敗率及不良反應(yīng)均有增加。因此，藥敏試驗在感染性疾病的防治方面具有日益重要的實際意義。5三、什么情況下需要做培養(yǎng)+藥敏？感染原因無法確定。病原菌的耐藥性無法確定，經(jīng)驗用藥可能失敗（尤其是免疫力低下患者、長期使用抗生素者、ICU病房、院內(nèi)感染患者、接受導(dǎo)管插入或其他創(chuàng)傷性治療患者。）病人對可用藥物過敏，需要檢測其他藥物的耐藥性。病人個體情況要求對某些藥物精確用藥，需要測定其最低抑菌濃度（MIC）。 四、常用抗菌藥物敏感性試驗與耐藥檢測方法介紹其原理：體外測定抗生素藥物抑菌或殺菌的能力。可幫助臨床對感染性疾病選擇最佳用藥，還可進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，了解某些致病菌耐藥性變異情況。紙片擴(kuò)散法（Kirby-Bauertest）稀釋法（dilutiontest）E試驗法（Etest）聯(lián)合藥物敏感試驗特殊耐藥菌及耐藥酶的表型檢測耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）的檢測β-內(nèi)酰胺酶、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶檢測等五、紙片擴(kuò)散法（K-B法）原理：含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上，紙片所含的藥物吸取瓊脂中的水分溶解后便不斷向紙片周圍區(qū)域擴(kuò)散，形成遞減的梯度濃度。在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)的細(xì)菌生長被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映測試菌對測定藥物的敏感程度，并與該藥對測試菌的最低抑制濃度（minimalinhibitoryconcentration，MIC）呈負(fù)相關(guān)，即抑菌圈愈大，MIC愈小。方法：菌液制備：挑取孵育16-24h的血平板上數(shù)個菌落置于生理鹽水管中，校正濃度至0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)；涂布接種：無菌棉拭蘸取菌液，在試管壁旋轉(zhuǎn)擠去多余菌液后在MH瓊脂表面均勻涂布接種3次，每次旋轉(zhuǎn)平板60o，最后沿平板內(nèi)緣涂抹1周；貼含藥紙片：平板在室溫下干燥3-5min，用無菌鑷子將含藥紙片緊貼于瓊脂表面，各紙片中心相距應(yīng)大于24mm，紙片距平板內(nèi)緣應(yīng)大于15mm；孵育：35oC16-18h，量取抑菌圈直徑。影響藥敏結(jié)果的因素培養(yǎng)基應(yīng)根據(jù)試驗菌的營養(yǎng)需要進(jìn)行配制。傾注平板時，厚度合適（約5-6mm），不可太薄，一般90mm直徑的培養(yǎng)皿，傾注培養(yǎng)基18-20ml為宜。培養(yǎng)基內(nèi)應(yīng)盡量避免有抗菌藥物的拮抗物質(zhì)，如鈣、鎂離子能減低氨基糖苷類的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和對氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺藥和TMP的活性。細(xì)菌接種量細(xì)菌接種量應(yīng)恒定，如太多，抑菌圈變小，能產(chǎn)酶的菌株更可破壞藥物的抗菌活性。藥物濃度藥物的濃度和總量直接影響抑菌試驗的結(jié)果，需精確配制。商品藥應(yīng)嚴(yán)格按照其推薦治療量配制。培養(yǎng)時間一般培養(yǎng)溫度和時間為37℃，8-18小時，有些抗菌藥擴(kuò)散慢如多粘菌素，可將已放好抗菌藥的平板培養(yǎng)基，先置4℃冰箱內(nèi)2~4小時，使抗菌藥預(yù)擴(kuò)散，然后再放37℃溫箱中培養(yǎng)，可以推遲細(xì)菌的生長，而得到較大的抑菌圈。12六、如何理解MIC值及藥敏結(jié)果？

每種藥物均提供定性和定量兩種結(jié)果。定性：敏感（S）表示該藥物對該細(xì)菌有抑制或殺滅作用。使用常規(guī)劑量可以達(dá)到有效的治療效果。

中介（中度敏感，I）表示細(xì)菌對該藥物治療的敏感性低于敏感菌株，必須加大劑量以達(dá)到更高的血藥濃度才能在特定的生理部位獲得有效的臨床效力；對于使用劑量有嚴(yán)格限制的藥物則必須重復(fù)測試以確定敏感還是耐藥。

耐藥（R）表示藥物常規(guī)劑量所達(dá)到的藥物濃度不能抑制或殺死細(xì)菌，即使加大劑量也不能達(dá)到治療效果或者超過了人體的正常耐受水平。定量：MIC（最低抑菌濃度）表示在體外達(dá)到抑制細(xì)菌生長所需要的最低的藥物濃度。臨床治療要求的血藥濃度一般為MIC值（μg/ml）的4-8倍。對于不同部位的不同藥物，其濃度可能更高或更低。應(yīng)具體情況具體分析，不可一概而論。

形成條件：生物學(xué)特性：與醫(yī)學(xué)關(guān)系：細(xì)胞壁中肽聚糖結(jié)構(gòu)受理化或生物因素的直接破壞或合成抑制而形成。形態(tài)多形性；染色革蘭陰性；培養(yǎng)高滲培養(yǎng)基；菌落油煎蛋樣

仍有一定致病性細(xì)菌L型－細(xì)胞壁缺陷細(xì)菌臨床分離葡萄球菌L型葡萄球菌L型回復(fù)后15滅菌－殺滅或除去所有微生物的繁殖體和芽胞。消毒－殺滅或除去病原微生物。防腐－抑制微生物的生長與繁殖。抑菌劑或防腐劑。除菌:用沖洗、過濾等機(jī)械手段除去微生物的方法化療：用對病原菌有毒力但對機(jī)體無害的化學(xué)物質(zhì)殺滅或抑制機(jī)體內(nèi)病原微生物的方法消毒與滅菌技術(shù)

基本概念擦拭法高壓蒸汽滅菌法常用消毒滅菌的方法物理法

化學(xué)法浸泡法熏蒸法噴霧法熱力消毒法生物凈化法輻射消毒法燃燒法烤箱法煮沸法干熱法濕熱法日光曝曬法紫外線燈照射法電子滅菌燈法電離輻射法煮沸消毒法操作規(guī)程將物品刷洗干凈，全部浸沒在水中，或在水中加入碳酸氫鈉配成1％一2％的濃度，可將沸點提高到105℃．還可去污防銹。加熱煮沸。水沸后開始計時5—10min，如中途加入物品，則在第二次水沸后重新計時。關(guān)閉熱源，用無菌持物鉗取出消毒物品。

焚燒----最徹底的滅菌方法燒灼----直接用火焰滅菌方法如接種環(huán)、試管口、三角瓶口干烤----加熱160-170℃2h

玻璃器皿、陶瓷1、干熱滅菌法紅外線----熱效應(yīng)，與干烤類似滅菌效果：可殺死營養(yǎng)體和芽胞壓力蒸汽滅菌的效果監(jiān)測

物理監(jiān)測法用150℃或200℃的留點溫度計。使用前將溫度計汞柱甩至50℃以下，放入包裹內(nèi)，滅菌后檢查其讀數(shù)是否達(dá)到滅菌溫度化學(xué)監(jiān)測法主要是通過化學(xué)指示劑的化學(xué)反應(yīng)，滅菌后呈現(xiàn)的顏色變化來辨別是否達(dá)到滅菌的要求。臨床常用的化學(xué)指示卡與化學(xué)指示膠帶，化學(xué)指示卡放在包的中央，化學(xué)指示膠帶粘貼在包的外面。生物監(jiān)測法是最可靠的監(jiān)測法，利用對熱耐受力較強(qiáng)的非致病性嗜熱脂肪桿菌芽孢作為指示劑，制成每片含106個嗜熱脂肪桿菌芽孢的菌紙片,使用時將10片菌紙片分別放于滅菌器四角及中央，待滅菌完畢，用無菌鑷取出后．再放人培養(yǎng)基內(nèi)，在56℃溫箱中培養(yǎng)48h至1周，若全部菌紙片無細(xì)菌生長則表示滅菌合格。消毒與滅菌技術(shù)

輻射滅菌法?非電離輻射：紫外線最佳殺菌波長為250～270nm殺菌機(jī)理：干擾DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄

特點：紫外線穿透力較弱適應(yīng)范圍：紫外線消毒適用于空氣消毒與物品表面的消毒。促進(jìn)菌體蛋白質(zhì)變性凝固（酚、醇、醛、酸堿類等）干擾細(xì)菌酶系統(tǒng)和代謝（氧化劑、重金屬鹽類等）損傷細(xì)菌細(xì)胞膜，增加其通透性（表面活性劑、脂溶劑等）菌體成分氧化、水解或結(jié)構(gòu)改變（氧化劑、鹵素、醛、酚等）消毒與滅菌技術(shù)

化學(xué)消毒劑作用機(jī)制消毒劑類別名稱濃度(%)用途重金屬鹽紅汞2皮膚、粘膜、小創(chuàng)面消毒硫柳汞0.01生物制品防腐氧化劑高錳酸鉀0.1皮膚、尿道、水果、蔬菜消毒過氧化氫3皮膚、粘膜、創(chuàng)傷消毒過氧乙酸0.2～0.5塑料、玻璃、人造纖維消毒鹵素類碘液2.5皮膚消毒醇類乙醇70～75皮膚、體溫計消毒酚類石炭酸3～5地面、器皿表面和排泄物消毒來蘇3～5同上、也常用于手及皮膚消毒表面活性劑新潔爾滅0.1手術(shù)器械消毒酸堿類生石灰1:4～1:8排泄物、地面消毒染料龍膽紫2～4表淺創(chuàng)傷消毒化學(xué)消毒