細(xì)胞自噬與神經(jīng)疾退行性疾病課件

細(xì)胞自噬

及其在神經(jīng)退行性疾病中的作用目錄神經(jīng)退行性疾病發(fā)生過程調(diào)控特點檢測基本概念細(xì)胞自噬ADPDHDAutophagy一詞來源于希臘語，auto指自身、phagy是吃的意思，autophagy意為自體吞噬，簡稱自噬。溶酶體基本概念自噬自噬在進(jìn)化過程中高度保守，從酵母、果蠅到脊椎動物和人都可以找到參與自噬的同源基因。目前至少已經(jīng)鑒定出33種參與酵母自噬的特異性基因。其命名從最初稱為APG，AUT和CVT，現(xiàn)已被統(tǒng)一命名為酵母自噬相關(guān)基因ATG(autophagy-relatedgene，ATG)。哺乳動物自噬基因的命名和酵母相似，但也有個別差異，如酵母的ATG8在哺乳動物稱為LC3，酵母晦ATG6在哺乳動物則稱為Beclin1?；靖拍钭允上嚓P(guān)基因主要自噬相關(guān)蛋白（Atg）基本概念自噬相關(guān)蛋白分類根據(jù)其降解底物的特異性分類非選擇性自噬：隨機選擇性自噬：專一線粒體自噬(Mitophagy)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬(ER-phagy)過氧化物酶體自噬(Pexophagy)細(xì)胞核自噬(Nucleophagy)基本概念根據(jù)自噬的過程分類大自噬(Macroautophagy)—主要小自噬(Microautophagy):指溶酶體膜直接內(nèi)陷包裹底物并降解的過程。分子伴侶介導(dǎo)的自噬(Chaperone-mediatedautophagy，CMA):熱休克蛋白70(Hsp70)與溶酶體相關(guān)膜蛋白2A(AMP2A)基本概念分類調(diào)控模式圖自噬上游調(diào)控自噬過程調(diào)節(jié)調(diào)控生理條件下,細(xì)胞自噬受到嚴(yán)格的調(diào)控?，F(xiàn)在了解得比較多的細(xì)胞自噬調(diào)控通路主要有兩條:mTOR通路和Ⅲ型PI3K通路。很多其他細(xì)胞自噬調(diào)控信號直接或間接的通過這兩條通路發(fā)揮作用。上游調(diào)控mTOR對細(xì)胞自噬起到負(fù)調(diào)控作用。在正常生長條件下,mTOR處于激活狀態(tài),細(xì)胞自噬受到抑制;當(dāng)細(xì)胞處于饑餓或受到雷帕霉素刺激時,mTOR被抑制,細(xì)胞自噬被誘導(dǎo)增強。調(diào)控mTOR通路絲裂原刺激信號能量感受信號胰島素信號氨基酸信號p53通路調(diào)控PI3KⅢ通路Ⅲ型磷脂酰肌醇3激酶(PI3KⅢ)是一個正調(diào)控蛋白，它能夠磷酸化磷脂酰肌醇(PI),生成3-磷酸磷脂酰肌醇(PI3P)，而后PI3P利用胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)形成自噬體膜。PI3KⅢ也能與Beclin-1形成復(fù)合體，該復(fù)合物在自噬體形成的起始階段起重要作用。自噬過程調(diào)節(jié)起始:Atg1復(fù)合體膜的擴增與底物識別選擇:

Atg12-Atg5和Atg8分別泛素化修飾

自噬體成熟與降解自噬過程中的其他重要成員:分泌與內(nèi)吞途徑和細(xì)胞骨架調(diào)控調(diào)控自噬的調(diào)控泛素化修飾

調(diào)控1電鏡技術(shù)普通透射電鏡技術(shù)免疫電鏡技術(shù)2化學(xué)和免疫化學(xué)染色法基于自噬標(biāo)記蛋白的檢測方法標(biāo)記自噬溶酶體結(jié)構(gòu)的檢測技術(shù)檢測電鏡技術(shù)普通透射電鏡技術(shù)在超薄切片上可清晰地觀察到自噬結(jié)構(gòu)的形態(tài)和構(gòu)造，實驗指標(biāo)包括細(xì)胞自噬水平和自噬結(jié)構(gòu)的變化，前者是指發(fā)生自噬的細(xì)胞出現(xiàn)率，后者以自噬細(xì)胞內(nèi)自噬結(jié)構(gòu)數(shù)目或自噬結(jié)構(gòu)與細(xì)胞質(zhì)的斷面面積之比衡量免疫電鏡技術(shù)可標(biāo)記位于自噬前體和自噬體內(nèi)外膜上的LC3，該方法可用于鑒別自噬前體，自噬體和自噬溶酶體檢測檢測普通透射電鏡技術(shù)檢測普通透射電鏡技術(shù)化學(xué)和免疫化學(xué)染色法1基于自噬標(biāo)記蛋白的檢測方法自噬體數(shù)量檢測—免疫熒光/組織化學(xué)技術(shù)蛋白表達(dá)量檢測—Western-blot2標(biāo)記自噬溶酶體結(jié)構(gòu)的檢測技術(shù)單丹磺酸戊二胺（MDC）染色吖啶橙（AO）染色檢測自噬類別相關(guān)環(huán)節(jié)標(biāo)志物大自噬自噬體的形成LC3(Atg8)Beclin1(Atg6)Atg5-Atg12Atg16LAtg9Atg14DRAM1ZFYVE1/DFCP1溶酶體LAMP-1LAMP-2自噬底物p62分子伴侶自噬LAMP2AHSC70線粒體自噬Atg32BNIP3自噬標(biāo)記蛋白檢測檢測GFP-LC3指示技術(shù)陰性對照雷帕霉素處理NDV感染檢測免疫熒光染色-LC3B對照組氯奎處理組檢測WesternBlot標(biāo)記自噬溶酶體結(jié)構(gòu)是以往應(yīng)用較為廣泛的活體檢測技術(shù)。MDC和AO是常用的嗜酸性染料，用于標(biāo)記酸性細(xì)胞器。當(dāng)溶酶體內(nèi)容物為酸性時，可獲得陽性染色信號。檢測染色技術(shù)檢測MDC染色自噬標(biāo)志物的檢測在自噬研究中發(fā)揮了巨大的作用，使得人們可以簡便、動態(tài)、實時并定量地檢測細(xì)胞內(nèi)自噬水平。然而單獨檢測每一種自噬標(biāo)志物都有一定的局限性和影響因素，在研究自噬時必須慎重考慮研究條件，適當(dāng)設(shè)置陰性與陽性對照，使用多種自噬抑制劑或者基因沉默等技術(shù)，多方面、多層次進(jìn)行實驗以確認(rèn)細(xì)胞的自噬水平。檢測在該疾病的早期階段自噬起保護性作用，激活自噬可加速變性蛋白的清除來阻止疾病的進(jìn)一步發(fā)展。然而，隨著疾病的進(jìn)展，蛋白質(zhì)聚積物越來越多，對溶酶體蛋白酶降解的敏感性下降，自噬的持續(xù)性激活最終引發(fā)自噬性細(xì)胞死亡，這樣自噬又促進(jìn)了神經(jīng)元的死亡。阿爾茨海默氏?。ˋlzheimer’s）、亨廷頓氏?。℉untington’s）和帕金森氏病（Parkinson’s）等神經(jīng)變性性疾病兩個最主要的特征是：胞漿中蛋白聚集物的存在和大的蛋白裂解體系活性的改變。神經(jīng)退行性疾病細(xì)胞自噬自噬的基本概念自噬的發(fā)生過程自噬的調(diào)控自噬的特點自噬的檢測自噬與神經(jīng)退行性疾病ADPDHD自噬與AD細(xì)胞自噬