整編生物化學(xué)與分子生物學(xué)試驗(yàn)

生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)1.分光光度計(jì)(1)基本理(1)基本理：溶液溶質(zhì)在其定波長(zhǎng)的吸收光中，其吸光度值與液層厚度和溶液濃度的乘積成正比，即遵循朗伯一比爾定律，通過也在一定液體厚度時(shí)測(cè)定其吸光度來與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較從而測(cè)得待測(cè)液溶質(zhì)濃度。(2)吸光度與液層厚度和溶液濃度的乘積成正比，稱為朗伯一比爾定律，簡(jiǎn)稱比爾定律，即光的吸收定律。其數(shù)學(xué)表達(dá)式為：A=-lgT=ebcA:吸光度，又稱光密度"O.D";「吸光系數(shù)(L-mol-i-cm-i);比例常數(shù)，稱吸光系數(shù)b:樣品光程(cm),通常使用1.0cm的吸收池，則b=1cm;c:樣品濃度(mol/L工吸光度“A”具有加和性，即混合物的總吸光度等于溶液中的各組份各自在該波長(zhǎng)下吸光度的算術(shù)和。這是多元混合物分光光度法定量分析的基礎(chǔ)。若溶液中各溶質(zhì)的吸光系數(shù)￡相同，則各溶質(zhì)吸光度的大小與溶質(zhì)濃度成比例。例：尿嘧啶核昔酸溶液用1cm石英吸收池測(cè)定260nm的吸光度為0.650，用同一吸收池測(cè)定純?nèi)軇┑奈舛葹?.070，已知其摩爾吸光系數(shù)=8.2x103M-icm，計(jì)算其摩爾濃度.vA=￡bC??八二（溶劑加樣品的吸光度）-（溶劑的吸光度）aA=0.650-0.070=0.580vb=1cm.?.C==7.1x10-5mol/L（2）等電點(diǎn)的計(jì)算方法;標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作（1）配置一系列濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)溶液。（2）在測(cè)定條件相同的情況下，分別測(cè)定其吸光度。（3）以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)（不必考慮顯色劑等引起的濃度變化），以相應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制A-C關(guān)系圖。（4）在相同條件下測(cè)出樣品溶液的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出濃度。2、酪蛋白的提取過程:牛乳2nli七水浴獲熱］必H（4）在相同條件下測(cè)出樣品溶液的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出濃度。2、酪蛋白的提取過程:牛乳2nli七水浴獲熱］必H中<jial熨?zèng)_液F1M詼熱〉用油管加入11AC短沖懣為2nli U>離心，,5分鐘（1）.原理；牛乳中主要的蛋白質(zhì)是酪蛋白，它是一些含磷蛋白質(zhì)的混合物，等電點(diǎn)為4.8。近淀用4nuL蒸鐲水洗濯離心徒/分盧先沖〔除譏院中可溶物）近程9b%N南0I洗滌離心，IQQQCtt/分，吊分鐘（陳膈）沉淀W.ltnoilXLX30H2ttil力至lOrnl沉淀內(nèi)耐4ml選泮離心，IflOOOK■分，5分鐘［脫水）潔液潔、液利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低的性質(zhì)，將牛乳的PH調(diào)至4.8時(shí)，酪蛋白就沉淀出來。用乙醇洗滌沉淀物，除去脂類雜質(zhì)后便可得到純化的酪蛋白。(2).主要試劑：牛乳醋酸鈉緩沖液0.2M,PH4.6，乙醇，乙醚，氫氧化鈉PPT后面問題：(1)醋酸緩沖液、蒸餾水、乙醇、丙酮洗滌沉淀的目的分別是什么？醋酸緩沖液：調(diào)節(jié)PH到等電點(diǎn)4.8。蒸餾水：出去沉淀中的可溶物。乙醇：除去沉淀中的脂類物質(zhì)。丙酮洗滌：脫水。(2)最后所得的沉淀中加入0.1m。l/LNaOH的作用是什么？酪蛋白是酸性蛋白質(zhì)，溶解于堿性溶液中，方便下次雙縮脲法測(cè)定。(3)制備高產(chǎn)率酪蛋白的關(guān)鍵是什么？剛開始時(shí)對(duì)牛奶的ph的調(diào)節(jié)，最好是調(diào)節(jié)到4.7，越接近越好，這是最主要的。(4)請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)另一種提取酪蛋白的方法。1、向酪蛋白溶液中加入高濃度(NH4)2SO4溶液2、10000轉(zhuǎn)/分,5分鐘，去上清液3、95%乙醇4ml洗滌離心，10000轉(zhuǎn)/分，5分鐘，去上清液4、丙酮4ml洗滌離心，10000轉(zhuǎn)/分，5分鐘，去上清液5、0.1mol/LNaOH2ml加水至10ml3、雙縮脲法測(cè)蛋白質(zhì)含量（1）.蛋白質(zhì)測(cè)定的5種方法：凱式定氮法（Kjedahl法）紫外吸收法雙縮脲法（Biuret法）Folin-酚試劑法（Lorry法）考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）思緒二五種不同蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法的比較方法靈敏度時(shí)同原理干擾物質(zhì)說明凱氏定氮注（Kjedahte）靈敏度相,，適用于口上~1.0電且氮1景若為±2%費(fèi)時(shí)8—10小時(shí)將費(fèi)白氮酎化為氨L用酸吸收后浦定北串白氮（可用ica沉浣里白質(zhì)而分離）用丁標(biāo)在樂白質(zhì)含量的暹確測(cè)定；十?dāng)_少;費(fèi)時(shí)太長(zhǎng)雙縮服法（Biuret^）靈敏度低工--20mg中速多肽犍+喊性Cu?T紫色絡(luò)合物硫酸鉉二如緩沖液，某些氨基酸用于快速測(cè)定，但不太靈敏;不信蛋白質(zhì)顯色相似紫外吸收法較為靈敏到快速5—10■各種法白質(zhì)中的T燈和Trp殘基在280nm士卜的引1吸收喋1鉗W密麻；各種核甘酸用于層析柱流出強(qiáng)的檢根h梯&的吸收可校正Folin-醐試劑法[Lgriy法》靈敢度回-T世g慢速4。?石儕鐘雙縮眠反應(yīng)；璘相酸一硝4懶試劑被T/和Ph。耕硫酸餒:Tris緩沖液用氨釀;各種旃耗費(fèi)時(shí)間L操作要嚴(yán)格計(jì)M；顏色深淺隨不同走白質(zhì)變化老馬斯犬聶法（Bradford^）靈敏度最圖快速5?1S考弓斯虎籃染料與蛋白質(zhì)結(jié)合產(chǎn),其丸oiax由465um變?yōu)?Htim強(qiáng)減注第中Vfe；TritonX-100;SDS最好的方法;干擾物質(zhì)少3顏色檢定,顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化TCA:三氯乙酸4.考馬斯克藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量實(shí)驗(yàn)步驟管等標(biāo)潴蛋白質(zhì)(0.1管等標(biāo)潴蛋白質(zhì)(0.1mg--t-nr)未知蛋白質(zhì)蒸幄水考馬斯亮曾G-250充分振蕩混勻后k2分鐘于595HII1處比色n以蛋白質(zhì)嫉里知釉，吸光度月為許W-以蛋白質(zhì)嫉里知釉，吸光度月為許W-繪能師淮求出樣后睡白質(zhì)含量〃原理：考馬斯亮藍(lán)G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，染料主要是與蛋白質(zhì)中堿性氨基酸和芳香氨基酸殘基結(jié)合，使染料最大吸收峰位置由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樗{(lán)色。在595nm下測(cè)定的吸光度A595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。⑴.干擾物質(zhì)有哪些？TritonX-100、SDS、強(qiáng)堿性緩沖液等.G250與R250的區(qū)別：比考馬斯亮藍(lán)R250多二個(gè)甲基，染色靈敏度不如R250，但比氨基黑高3倍。優(yōu)點(diǎn)在于它在三氯乙酸中不溶而成膠體，能選擇地染色蛋白而幾乎無本底色。所以常用于需要重復(fù)性好和穩(wěn)定的染色，適于作定量分析。⑶所后的4個(gè)思考題。說明各種蛋白質(zhì)含量測(cè)定法中哪幾種可以測(cè)出蛋白質(zhì)的絕對(duì)含量哪幾種只能測(cè)定其相對(duì)含■，為什么？只有凱氏定氮法可以測(cè)定蛋白質(zhì)的絕對(duì)含量，因?yàn)槊?.25蛋白質(zhì)含1g氮，試驗(yàn)中可以除去非蛋白氮，所以，通過氮含量的測(cè)定，可以得到蛋白質(zhì)的絕對(duì)含量。其他的幾種方法，由于都使用了標(biāo)準(zhǔn)蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，所以，所測(cè)得的未知蛋白的含量，都是相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量而言的?？捡R斯克藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量使用的局限性有哪些？(1)由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)時(shí)有較大的偏差，最好選用與待測(cè)樣品氨基酸成份相同的標(biāo)準(zhǔn)蛋白。(2)仍有一些物質(zhì)干擾此法的測(cè)定，主要的TritonX-100、SDS、強(qiáng)堿性緩沖液等。(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線形，因而不能用比爾定律進(jìn)行計(jì)算而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來測(cè)定未知蛋白質(zhì)的濃度。在實(shí)驗(yàn)中，使用的水一定是蒸餾水嗎？為什么？因?yàn)锽radford檢測(cè)中要用的試劑配制標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作都要用到水.如果不是使用蒸餾水，可能水里面會(huì)有一些游離的離子或者電解質(zhì)會(huì)影響試劑配制的準(zhǔn)確性,干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果.而水中殘留的有機(jī)物等可能會(huì)和考馬斯亮藍(lán)發(fā)生變色反應(yīng)這樣制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線會(huì)比實(shí)際值偏高，導(dǎo)致最終濃度檢測(cè)的結(jié)果比實(shí)際結(jié)果偏低。SDS干擾考馬斯克藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理是什么？當(dāng)溶液中存在一定量的SDS后所測(cè)得的吸光度比正常值相對(duì)減小。但是隨著SDS濃度的增加，吸光度的減小量應(yīng)沒有呈現(xiàn)出很明顯的規(guī)律。由于SDS的存在，阻礙了染料與堿性氨基酸和芳香族氨基酸的結(jié)合使得吸光度減小。由于SDS與染料分子對(duì)蛋白質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，使得顯色減弱，吸光度值降低，因此在曲線前段呈下降趨勢(shì)；但由于SDS破壞氫鍵，使得蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)更加伸展，一些原來包裹在結(jié)構(gòu)中的堿性氨基酸和芳香族氨基酸暴露出來，所以會(huì)有少量的吸光度回升；

但最終SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合達(dá)到所處溶液條件下的“飽和"時(shí)，過量的SDS就不起作用了，曲線是最后為平緩段。要去除SDS的干擾，可以利用它與K+結(jié)合生成沉淀的性質(zhì)將其去除。K+對(duì)考馬斯亮藍(lán)方法不產(chǎn)生干擾。5、醋酸纖維薄膜電泳原理：生物分子在某個(gè)特定的pH值下可以帶正電或負(fù)電，在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷極性相反的電極方向不同分子以不同速度移動(dòng)。電泳影響因素： 蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中移動(dòng)的速度取決于蛋白質(zhì)所帶的電荷性質(zhì)、數(shù)量、自身大小和形狀；此外還受外界因素的影響如，電場(chǎng)強(qiáng)度、溶液的PH、離子強(qiáng)度等。.結(jié)合實(shí)驗(yàn)報(bào)告冊(cè)，回憶操作過程，首先醋酸纖維薄膜先看粗糙面，在粗糙面上畫點(diǎn)樣線，畫好后做標(biāo)記，泡在緩沖溶液中浸泡完全（上面無白斑，然后點(diǎn)樣，點(diǎn)樣后放掉電泳槽中電泳，電泳后染色，然后脫色。（熟悉整個(gè)過程，如果把過程打亂，能否正確排序？）（選擇題）3、平衡工3、平衡工無光澤面朝下，點(diǎn)樣例位于陰極（5nir）4、電泳:打開電源，U=160丫或1=1.刎t=45—50tnin：小時(shí)5、染色;氨基黑IOB染色充分,5—lOuiit6、漂洗:3—4個(gè)漂洗皿，洗去蝴至背景無色.實(shí)驗(yàn)操作1、準(zhǔn)備（1）電泳儀的準(zhǔn)備⑵薄膜的準(zhǔn)備：■在薄膜無光澤面標(biāo)H點(diǎn)樣位置■將薄膜置于巴比妥緩沖液中浸泡2,點(diǎn)樣（1）無光澤面朝上，吸去多余Buffer,色，用蓋城片播取少量血.蒙，垂直印在劃稿處.lew注意，不能超出邊緣；不能重豆點(diǎn)樣；必須與邊緣中行要適量、均勻和垂直，并避免弄破薄膜,結(jié)果是5條帶，哪條帶最接近點(diǎn)樣線，哪條線最遠(yuǎn)。要求會(huì)畫圖，畫圖要記得畫點(diǎn)樣醋酸纖維薄膜法顯示血清蛋白質(zhì)從正極起依次為白蛋白、al壬蛋白、a2聲蛋白、回白和下-球蛋白五條區(qū)帶口白茶口=Bal-5^蛋白垢自=3R-整系口厚冢白點(diǎn)樣處I !三里殍、線。.血清蛋白的臨床意義。組成：白蛋白、a1、a2、B和y-球蛋白；功能：維持血漿膠體滲透壓；調(diào)節(jié)血漿pH值，維持酸堿平衡；運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、代謝物、激素、藥物及金屬離子等；免疫作用。血清蛋白是血漿中最主要的固體成分，含量為60~80g/L減少：長(zhǎng)期慢性發(fā)熱、大面積燒傷（白細(xì)胞增多），惡性腫瘤、肝癌（淋巴細(xì)胞和核細(xì)胞增多），肝功能嚴(yán)重受損、肝壞死、肝硬化（谷丙轉(zhuǎn)氨酶增多），甲狀腺功能亢進(jìn)、漿膜滲出性損害、結(jié)核病、慢性腹瀉、慢性肝炎、腎病綜合征、吸收不良綜合征，營(yíng)養(yǎng)不良、貧血（紅細(xì)胞，紅蛋白稍偏低）等。增加：大量出汗、多發(fā)性骨髓瘤、腹瀉、巨球蛋白血癥、嚴(yán)重嘔吐、中毒等。6、血糖測(cè)定（吳憲血糖測(cè)定法）⑴.吳憲血糖測(cè)定法的優(yōu)勢(shì)（波長(zhǎng)620nm）:優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，比雙縮尿法靈敏得多工作原理：葡萄糖+Cu（OH）2 - Cu2OlCu2O +磷鉬酸一鉬藍(lán)鉬藍(lán)的藍(lán)色深淺與葡萄糖的含量成正比所以可以用比色法來測(cè)定鉬藍(lán)的光吸收值來測(cè)定血糖的含量（波長(zhǎng)620nm）。（2）為什么選用無蛋白血濾液？有蛋白的話會(huì)與堿性銅試劑發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，也呈藍(lán)色，干擾最后的結(jié)果（3）水浴8min后，取出為何切記搖動(dòng)？ 氧化亞銅易已被氧化（4）空腹血糖的正常范圍：一般空腹全血血糖為3.9?6.1mmol/L（70?110毫克/分升），血漿血糖為3.9?6.9mmol/L（70?125毫克/分升）?？崭谷侵?.7mmol/L（120毫克/分升）、血漿血糖"8mmol/L（140毫克/分升），2次重復(fù)測(cè)定可診斷為糖尿當(dāng)空腹全血血糖在5.6mmol/L（100毫克/分升）以上，血漿血糖在6.4mmol/L（115毫克/分升）以上，應(yīng)做糖耐量試驗(yàn)。當(dāng)空腹全血血糖超過11.1mmol/L（200毫克/分升）時(shí)，表示胰島素分泌極少或缺乏。因此，空腹血糖顯著增高時(shí)，不必進(jìn)行其它檢查，即可診斷為糖尿病。(5)PPT后的3個(gè)思考題Folin-吳憲法為什么要用無蛋白血濾液？有蛋白的話會(huì)與堿性銅試劑發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，也呈藍(lán)色，干擾最后的結(jié)果Folin-吳法測(cè)定血糖的優(yōu)缺點(diǎn)是什么優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，比雙縮尿法靈敏得多，缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)，要精確控操作時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式，且專一性比較差，干擾物質(zhì)比較多進(jìn)行比色法測(cè)定時(shí)，如果測(cè)得樣品的A值超過100%，該如何處理，為什么？測(cè)得樣品值超過100%是因?yàn)橛衅渌€原物質(zhì)，使其待測(cè)液中血糖的濃度過高所造成的，應(yīng)該將待測(cè)液稀釋后再進(jìn)行比色。7、谷丙氨酸酶的臨床意義；臨床意義丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AlanineTransaminase,ALT)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GlutamicpyruvicTransaminase,GPT)ALT(GPT)廣泛存在于機(jī)體各種組織中，但在肝細(xì)胞中含量最多.當(dāng)肝臟有病變，特別是急性肝炎及肝細(xì)胞抹死，血清中谷丙轉(zhuǎn)氨疇活性顯著升高.在肝癌.肝硬變以及膽道疾睛時(shí)，此峰活性也可中度或輕度增高.(11谷丙氨酸酶的測(cè)定方法；知道什么是賴氏法，什么是改良賴氏法？拉門氏法分光光度法谷氮酸十拉門氏法分光光度法谷氮酸十丙酮酸-賴氏法(Reitman)本身并未對(duì)普氨彝活，性單位提出規(guī)定，吊包是_用卡門氏法(Karman)來定單隹的門即用卡門氏法所,測(cè)出的單餞據(jù)H自當(dāng)于林氏法所產(chǎn)生的丙陋酸量的相關(guān)系藪，受用卡門氏單4立而來^山由此可見，刑定向,一份血清的樗-氫酶活?吐，用不同方法測(cè)笄，其值不一樣“因而它們的工帑值危國(guó)也可南疆著.差異.(21改良后的方法優(yōu)勢(shì)在哪？.反應(yīng)溫度：40℃改為37℃;.底物濃度：高改低；.套用卡門氏單位，與速率法一致，反映了酶的真實(shí)活性(3人在做實(shí)驗(yàn)時(shí)用到。一酮戊二酸、丙酮酸、硝基苯肼，他們的原理以及試劑的作用；(4\該實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)：2，4-二硝基苯肼可與有酮基的化合物作用形成苯腙硝醌化合物；溶血標(biāo)本不宜采用，因血細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶活力較高，影響測(cè)定結(jié)果；在測(cè)定時(shí)，如酶活力較大(大于150KarU)，應(yīng)將樣品稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。(51PPT后的6個(gè)思考題1、ALT的臨床意義？AST的測(cè)定對(duì)于肝病的診斷具有十分重要的意義，特別是AST/ALT比值大小對(duì)于臨床判定肝病嚴(yán)重程度具有十分重要的意義，是臨床診治肝病的重要指標(biāo)之一2、血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定的注”項(xiàng)？以及為何要避免溶血？常溫下標(biāo)本不宜久存，（2）嚴(yán)重脂血、黃疸、溶血和糖尿病酮癥酸中毒病人血清標(biāo)本可增加測(cè)定的吸光度，測(cè)定這類標(biāo)本應(yīng)做血清標(biāo)本對(duì)照組（3）當(dāng)標(biāo)本的酶活性超過150K時(shí)，應(yīng)將血清中用0.145mol/L氯化鈉稀釋重做，其結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)（4）酮戊二酸，2,4-二硝基甲苯肼是直接顯色物，NAOH的濃度與顯色深淺有關(guān)，因此它們的濃度必須很準(zhǔn)確（5）丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)濃度要求十分精確（6）加入2,4-二硝基苯肼溶液之后應(yīng)充分混勻當(dāng)溶血之后，紅細(xì)胞中的ALT會(huì)進(jìn)入血液中，導(dǎo)致測(cè)得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)較大，不符合實(shí)際情況3、對(duì)照管的意義是什么？減少非試驗(yàn)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響4、底物液為何要37℃預(yù)溫5min?人體的體溫為37℃，只有在此溫度下酶的活性才會(huì)達(dá)到最大，因此必須先讓酶的活性達(dá)到最大才與底物反應(yīng)5、為什么在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)要加入基質(zhì)液？使反應(yīng)的溶液體積相同，減少因體積不同而造成的實(shí)驗(yàn)非決定性因素的影響6、為什么在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)加入基質(zhì)液的體積不同，對(duì)反應(yīng)沒有影響？基底液與底物和酶都不反應(yīng)，它的作用只是調(diào)節(jié)溶液的體積酶活性的單位：國(guó)際單位：1961年酶學(xué)委員會(huì)建議使用統(tǒng)一單位，在規(guī)定條件下，1分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化1pmol底物所需的酶量，稱為一個(gè)國(guó)際單位（IU，又稱U）。

卡門氏單住的定義為；在紫外分光用度計(jì)中，1ml血清（反應(yīng)謬液思量為3mL）在34Onm波長(zhǎng)下，用內(nèi)程為L(zhǎng)0cm的比色皿，在25XJ,1分鐘內(nèi)生般的丙酮酸，在乳酸脫氫晦催4匕下，在NADH+H*變成NAD+,使光密度下降CL001為1個(gè)轉(zhuǎn)氨醯活牲單住。GPT丙氮酸+B-酮戊一一酸- '?省氨酸十丙酮酸■N.4DH在260nm和340nm處備有一吸q史上粉、而NAD+只有260nm一一處吸耳文心至、國(guó)止匕以NA口II為輔彝的答種脫氫酶.都可通過340nm龍吸收值的法變，定量測(cè)定崎法力.8、豬肝DNA基因組DNA的提取取一支WmlEF管.裝入鞭狀物（基本NAJDH+H+乳酸脫氫酶NAI>++乳酸制備DNA溶液工DNA沉淀溶于O.zLmol/L的NQH<lmL>在沉淀中加入NAJDH+H+乳酸脫氫酶NAI>++乳酸制備DNA溶液工DNA沉淀溶于O.zLmol/L的NQH<lmL>在沉淀中加入N3C1-EDTA溶液洗2次,FW_t/SijC?將沉淀懸于:LOmlNmCI-EDTA溶液中，分裝于2支TOnilEP管離心二4ODOrpimr5min<.絲狀物）t小心吸出上層清液，向上清液中加入1.5—N倍體積的95%乙醇每管痼力［llnil250/oSDS溶液,邊加邊振蕩緩◎加入約1倍體型的氯仿虎醉海合液,蝴蝶形振薄5m『n,離心1口riiin（lOOOOrpm>*6Q1?水塔10Ei門（不停振蕩）5mol/lNaCI迷5mIn,1mL,蝴蝶形振肝臟口NA提取的流程圖實(shí)驗(yàn)原理一定要掌握。提取過程中用到的試劑作用；（1）實(shí)驗(yàn)原理：DNA與RNA的分離：DNP在0.14MNaCl鹽溶液中溶解度很低，而RNP則溶于0.14MNaCl鹽溶液，利用這一性質(zhì)可將生物組織中的DNA與RNA分開。DNA在高濃度的鹽溶液中溶解度最大。去除DNP中的蛋白：SDS使之變性除去（同時(shí)破壞核酸分解酶。進(jìn)一步純化則利用氯仿-異戊醇震蕩除蛋白，震蕩時(shí)，蛋白質(zhì)變性，形成凝膠，并與DNA分開，DNA則留在水層中。沉淀DNA:利用DNA不溶于乙醇，因而用乙醇將DNA從溶液中沉淀出來。提取過程中用到的試劑作用1、取新鮮豬肝4g，用0.14mol/LNaCl-0.15mol/LEDTA溶液洗去血液，剪碎。加入10mL0.14mol/LNaCl-0.15mol/LEDTA溶液，置勻漿器中研磨。（初步破碎細(xì)胞入（已做）2、取一支10mLEP管，裝入糊狀物（基本裝滿），離心5min（10000rpm），棄去上清液。沉淀用0.14mol/lNaCl-0.15mol/LEDTA溶液洗兩次。每次加入溶液后用吸管吹打均勻再離心（同上），直到上清液無血細(xì)胞。棄上清液，所得沉淀為DNP（DNA蛋白復(fù)合物）粗制品3、向上述沉淀物加入0.14mol/LNaCl-0.15mol/LEDTA溶液5mL，然后每管滴加25%的SDS溶液1mL，邊加邊振蕩。加畢，置60℃水浴10min（不停振蕩），直至溶液變得粘稠并略透明，取出冷卻至室溫。此步驟使核酸與蛋白質(zhì)分離。4、每管加入5mol/lNaCl溶液2mL，蝴蝶形振蕩5min。加入約1倍體積的氯仿一異戊醇混合液，蝴蝶形振蕩5min，離心10min（4000rpm）。（此步驟后溶液分三個(gè)相：上層水相（DNA）;中層變性蛋白質(zhì)相；下層有機(jī)相和殘余的RNA。）5、吸出上清液，棄去沉淀。向上清液中緩慢加入1.5—2倍體積的95%乙醇，DNA沉淀析出，［離心（4000rpm）5min］用玻棒攪出的絲狀物則為粗DNA6、制備DNA溶液：用0.1mol/L的NaOH1mL,溶解DNA沉淀，為下次的《DNA含量測(cè)定》提供材料PPT^MS^fi.核酸提取中SDS、氯仿-異戊醇各有什么作用？SDS是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)。而強(qiáng)還原劑如巰基乙醇，二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入還原劑和SDS后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈和SDS結(jié)合成蛋白-SDS膠束，所帶的負(fù)電荷大大超過了蛋白原有的電荷量，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異。氯仿可去除DNA溶液中微量酚的污染，異戊醇還可減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡.結(jié)合本人操作的體會(huì)，試述在提取過程中應(yīng)應(yīng)該注意些什么？且如何避免大分子DNA的降解和斷裂？震蕩過程中力度不能過大，力度過大會(huì)導(dǎo)致DNA分子斷裂，也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。離心時(shí)間應(yīng)適合，時(shí)間太長(zhǎng)可能會(huì)導(dǎo)致DNA分子斷裂，時(shí)間太短，會(huì)導(dǎo)致DNA分子不能得以與蛋白質(zhì)分離，水浴時(shí)間與溫度應(yīng)該適宜，溫度為65度時(shí)間為6分鐘最適合。.核酸提取過程中，除去雜蛋白的方法主要有哪幾種？4種：紫外線吸收法，定磷法，二苯胺法，地衣酚（苔黑酚）法.預(yù)習(xí)：核酸定量測(cè)定方法有幾種？9、DNA樣品含量的測(cè)定（有5種方法；我們做了紫外法和二苯胺法，其他方法要掌握實(shí)驗(yàn)原理，做實(shí)驗(yàn)的兩種方法不僅要掌握實(shí)驗(yàn)原理，還要掌握操作過程。）二苯胺法實(shí)驗(yàn)原理脫氧核糖核酸中的2-脫氧核糖在酸性環(huán)境中與二苯胺試劑一起加熱產(chǎn)生藍(lán)色反應(yīng)，在595nm處有最大光吸收。DNA在40-400ug范圍內(nèi)，光吸收與DNA的濃度成正比。在反應(yīng)液中加入少量乙醛，可以提高反應(yīng)靈敏度。除DNA外，脫氧木糖、阿拉伯糖也有同樣反應(yīng)。其他多數(shù)糖類，包括核糖在內(nèi)，一般無此反應(yīng)。紫外吸收法實(shí)驗(yàn)原理DNA和RNA都有吸收紫外光的性質(zhì)，它們的吸收高峰在260nm波長(zhǎng)處。吸收紫外光的性質(zhì)是瞟呤環(huán)和嘧啶環(huán)的共軛雙鍵系統(tǒng)所具有的，所以瞟呤和嘧啶以及一切含有它們的物質(zhì)，不論是核昔、核昔酸或核酸都有吸收紫外光的特性10、質(zhì)粒DNA提?。ㄕ莆諏?shí)驗(yàn)原理，試劑的作用；什么叫做質(zhì)粒？質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)？質(zhì)粒有什么特點(diǎn)？我們用堿裂解法，該法中用到溶液1、溶液2、溶液3的主要成分和作用；以及最后的實(shí)驗(yàn)步驟和注意事項(xiàng)；PPT后的3個(gè)思考題。）二苯胺法實(shí)驗(yàn)原理脫氧核糖核酸中的2-脫氧核糖在酸性環(huán)境中與二苯胺試劑一起加熱產(chǎn)生藍(lán)色反應(yīng)，在595nm處有最大光吸收。DNA在40-400ug范圍內(nèi)，光吸收與DNA的濃度成正比。在反應(yīng)液中加入少量乙醛，可以提高反應(yīng)靈敏度。除DNA外，脫氧木糖、阿拉伯糖也有同樣反應(yīng)。其他多數(shù)糖類，包括核糖在內(nèi)，一般無此反應(yīng)。質(zhì)粒是一類存在于細(xì)菌和真菌細(xì)胞中具有自主復(fù)制能力的、共價(jià)閉合環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)的小型DNA分子。堿裂解法提取質(zhì)粒是實(shí)驗(yàn)室常用的方法這種方法是根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來分離它們質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：1、染色體外的小型DNA分子；2、共價(jià)閉合環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)3、自主復(fù)制。作用：1、外源DNA的載體2、保存基因3、表達(dá)蛋白用堿裂解法，該法中用到溶液1、溶液2、溶液3的主要成分和作用；溶液工：由葡萄糖、EDTATris-HCl組成（保護(hù)、緩沖）50mmol/L葡萄糖的作用是增加溶液的粘度（懸浮細(xì)胞）25mmol/LEDTA的作用是絡(luò)合掉鎂等二價(jià)金屬離子，防止DNA酶對(duì)質(zhì)粒分子的降解作用（保護(hù)作用）10mmol/LTris-HCl使溶菌液維持溶菌作用的最適PH范圍（緩沖作用）溶液11:由SDS（十二烷基硫酸鈉）與NaOH組成（裂解、變性）0.2mol/LSDS：？1%NaOH（PH>12）:破壞細(xì)胞膜，裂解細(xì)胞注意：堿裂解的時(shí)間不要太長(zhǎng)，以免基因組DNA斷裂成小片段。溶液111:3mol/LHAc（pH4.8）和3mol/LKAc組成的高鹽溶液（復(fù)性，分離）HAc溶液能中和溶液^的堿性，使染色體DNA變性而發(fā)生纏繞，并使質(zhì)粒DNA復(fù)性。KAc會(huì)與SDS形成溶解度很低的鹽POD（十二烷基磺酸鉀），并與蛋白質(zhì)形成沉淀而除去溶液中的DNA也會(huì)與蛋白質(zhì)6。5復(fù)合物纏繞成大分子而與小分子質(zhì)粒DNA分離。PPT后的3個(gè)思考題。質(zhì)粒提取除了堿裂解法，還有其他什么方法？各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)？核酸提取過程中，除去雜蛋白的方法主要有哪幾種？如果質(zhì)粒DNA中有蛋白質(zhì)殘留，如何判斷？在提取過程中應(yīng)如何避免大分子DNA的降解和斷裂？11、PCR技術(shù)（知道操作中加了哪些試劑？試劑的作用是什么？PCR的原理主要是3個(gè)步驟：變性，退火，延伸。過程是什么樣的？PCR的特性。）（11過程：首先95℃預(yù)變性設(shè)置1min，1min后94℃30s進(jìn)入變性過程；然后是退火52℃30min；然后引物的延伸，72℃30s，從這開始循環(huán)，72℃10min，最后0℃保溫。（2）、試劑的作用是什么？（一）DNAB^BTaqDNA聚合酶的用量為1~2.5U/100ul,酶的濃度偏高，非特異性的產(chǎn)物將會(huì)增加，若酶的濃度偏低，側(cè)合成產(chǎn)物偏少。TaqDNA聚合酶可分為兩大類：1、具有校正功能的（有3'-5'核酸酶活性）比如：Vent,pfu,pwo等2、不具有校正功能的（無3'-5'核酸酶活性）比如：一般的TaqDNA聚合酶（二）模板核酸模板的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標(biāo)本。一般臨床檢測(cè)標(biāo)本，可采用快速簡(jiǎn)便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴(kuò)增。RNA模板提取一般采用異硫氨酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。(三)引物引物是待擴(kuò)增核酸片段兩端的已知序列，它決定了PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，引物的選擇是整個(gè)PCR反應(yīng)的關(guān)鍵，引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性及成功與否。 引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。(21PCR的原理主要是3個(gè)步驟：變性，退火，延伸。過程是什么樣的？過程：首先95℃預(yù)變性設(shè)置1min，1min后94℃30s進(jìn)入變性過程然后是退火52℃30min；然后引物的延伸，72℃30s，從這開始循環(huán)，72℃10min，最后0℃保溫1、模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；2、模板DNA與引物的退火：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；3、引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在Ta