微生物試驗(yàn) 抑菌效果預(yù)測(cè)

化學(xué)抑殺菌劑的效果評(píng)價(jià)第五小組：蘭玉蓓張冬

吳立音富爽爽前言抗病原體藥物抗生素消毒劑防腐劑抗生素不同與化學(xué)藥物的特點(diǎn)（1

）作用機(jī)理的選擇性

抑制細(xì)胞壁合成、干擾細(xì)胞膜、抑制蛋白質(zhì)合成、抑制核酸合成

抗菌效果：抑菌、殺菌和溶菌（

2

）對(duì)微生物有選擇性：青霉素對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌都有良好藥效，鏈霉素對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌都有良好藥效，對(duì)結(jié)核桿菌有特殊的療效；氯霉素、四環(huán)素、金霉素、土霉素對(duì)G-和G+、立克次氏體、衣原體均有作用，屬于廣譜型抗生素；放線菌酮、兩性霉素B、灰黃霉素對(duì)真菌有抑制作用。（

3

）一般都在很低濃度下對(duì)病原菌就發(fā)生作用

有效濃度：抑制微生物生長(zhǎng)的最低濃度。低強(qiáng)度抗生素：有效濃度≥100

mg/L

高強(qiáng)度抗生素：有效濃度≤1

mg/L

在這么多抗病原體藥物中，到底哪種藥物的抗菌效果最好呢？

本次實(shí)驗(yàn)，我們選取了氨芐青霉素、鏈霉素、紅藥水、丙酸，分別對(duì)大腸桿菌（G-）、枯草芽孢桿菌（G+）作用，比較它們的抗菌效果氨芐青霉素是殺菌性的抗生素。能滲透革蘭氏陽(yáng)性菌及部份革蘭氏陰性菌。經(jīng)由結(jié)合在細(xì)菌細(xì)胞壁上的青霉素結(jié)合蛋白（penicillin-bindingproteins，PBPs），阻礙細(xì)菌合成細(xì)胞壁的第三及最后階段，最終引致細(xì)胞裂解。鏈霉素主要與原核細(xì)胞(如細(xì)菌)核糖體30S亞單位結(jié)合，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)(酶)的合成,使細(xì)菌不能正常生長(zhǎng)或者代謝而死亡。紅藥水紅藥水的有效成分是汞溴紅，其中的陽(yáng)離子汞能與細(xì)菌蛋白質(zhì)結(jié)合，影響細(xì)菌的代謝過(guò)程，從而達(dá)到抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的目的。丙酸的防霉機(jī)理目前公認(rèn)的有兩個(gè)1、非解離的丙酸活性分子在霉菌細(xì)胞外形成高滲透壓是霉菌細(xì)胞內(nèi)脫水而失去繁殖能力2、丙酸活性分子可穿透霉菌細(xì)胞壁，抑制細(xì)胞內(nèi)的酶活性而阻止霉菌的繁殖本次試驗(yàn)選擇的四種藥品作用機(jī)理如下

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)自主設(shè)計(jì)，研究一些常用抗生素、消毒劑的抑殺菌效果掌握檢測(cè)化學(xué)抑殺菌劑作用效果的方法了解一些常用化學(xué)抑殺菌劑的作用機(jī)理以及效果差異。通過(guò)實(shí)驗(yàn)操作，進(jìn)一步鞏固已學(xué)習(xí)的微生物實(shí)驗(yàn)技能，學(xué)以致用。實(shí)驗(yàn)?zāi)康拇郎y(cè)菌種：大腸桿菌（G-），枯草芽孢桿菌（G+）藥劑：抗生素類藥物——氨芐青霉素、鏈霉素(50μg/μL)消毒劑和防腐劑——紅藥水、丙酸材料：LB培養(yǎng)基，移液槍100uL，培養(yǎng)皿20個(gè)，小試管32支(20mL)，移液槍（藍(lán)、黃槍頭各一盒），濾紙片100個(gè)，生理鹽水，高壓蒸汽滅菌鍋，150ml錐形瓶4個(gè)，500ml錐形瓶2個(gè)，酒精燈，接種環(huán)。材料與試劑1、配制培養(yǎng)基：LB固體培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L(1g/100mL)牛肉膏5g/L(0.5g/100mL)瓊脂6g/L(0.6g/100mL)NaCl10g/L(1g/100mL)調(diào)pH7.0~7.2與生理鹽水、移液槍置于高壓蒸汽，滅菌。2、稀釋：（如下表）

氨芐青霉素：濃度5ug/mL10ug/mL50ug/mL250ug/mL1250ug/mL水2mL1mL199uL156uL105uL氨芐青霉素1uL1uL1uL4uL15uL實(shí)驗(yàn)步驟

鏈霉素：濃度5%10%50%80%100%水152uL180uL75uL120uL0uL紅藥水8uL70uL75uL30uL150uL濃度0.08%0.4%2%10%50%水1249uL249uL147uL180uL75uL丙酸1uL1uL3uL20uL75uL濃度4ug/mL20ug/mL100ug/mL500ug/mL2500ug/mL水2mL1mL180uL190uL150uL鏈霉素1uL1uL2uL10uL40uL紅藥水：丙酸：實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟3、混菌：（45℃時(shí)）將大腸桿菌、枯草芽孢桿菌接種至培養(yǎng)基并注入培養(yǎng)皿，混勻，自然冷卻至凝固。平板個(gè)數(shù)：20mL/皿*20個(gè)4、點(diǎn)樣：用移液槍分別移取30uL所選試劑，如下圖點(diǎn)樣，第一個(gè)皿點(diǎn)四種藥物的最低濃度，其余四個(gè)皿依次按濃度梯度點(diǎn)樣，中心濾紙點(diǎn)生理鹽水，為空白對(duì)照，并重復(fù)一皿。（2菌種*2.5皿/1菌*4藥品）藥1對(duì)照藥4藥3藥25、培養(yǎng)養(yǎng)：37℃下下培養(yǎng)20h，，觀察。。測(cè)抑菌菌圈直徑徑，做直直徑-藥藥劑濃度度對(duì)數(shù)曲曲線。6、配置置菌懸液液：分別取一一定量大大腸桿菌菌、枯草草芽孢桿桿菌制作作菌懸液液。7、配制制培養(yǎng)基基：LB液體體培養(yǎng)基基：蛋白白胨10g/L(4g/400mL)牛牛肉膏5g/L(2g/400mL)NaCl10g/L(4g/400mL)調(diào)調(diào)pH7.0~7.2高高壓壓蒸汽滅滅菌。實(shí)驗(yàn)步驟驟比濁法：：選取上述述實(shí)驗(yàn)所所得抑菌菌效果較較好的藥藥品、大大腸桿菌菌和枯草草芽孢桿桿菌的菌菌懸液、、LB液液體培養(yǎng)養(yǎng)基如下下表裝入入30支支試管中中：按上述方方法平行行配制3組，其其中一組組未加藥藥品，用用生理鹽鹽水補(bǔ)充充容積，，共30支。實(shí)驗(yàn)步驟驟紅藥水濃度70ug/mL120ug/mL170ug/mL220ug/mL270ug/mL加入藥品量uL3uL6uL8uL11uL13uL加菌懸液uL987uL987uL987uL987uL987uL加生理鹽水uL10uL7uL5uL2uL0uL實(shí)驗(yàn)步驟驟9、培養(yǎng)養(yǎng)：將1組、、2組（（未加藥藥品）置置于37℃下培培養(yǎng)12h，3組置于于0℃冰冰箱中培養(yǎng)12h。10、測(cè)測(cè)量及處處理：在600nm下下測(cè)量各各試管吸吸光度，，做OD值—藥藥劑濃度度對(duì)數(shù)曲曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果果與分析析1、濾紙紙法測(cè)抑抑菌效果果實(shí)驗(yàn)分分析：氨芐青霉霉素濃度度梯度配配置2ug/mL10ug/mL50ug/mL250ug/mL1250ug/mL加入藥品量uL1uL1uL1uL4uL15uL加入蒸餾水量uL2mL1mL199uL156uL105uL氨芐青霉霉素（1×104ug/mL）對(duì)細(xì)細(xì)菌的直直徑-藥藥劑濃度度對(duì)數(shù)曲曲線數(shù)值值藥物濃度藥劑對(duì)數(shù)濃度大腸桿菌抑菌圈平均直徑/mm枯草芽孢桿菌抑菌圈平均直徑/mm5ug/mL0.717.5010ug/mL118050ug/mL1.720.50250ug/mL2.423.501250ug/mL3.1270從氨芐青青霉素對(duì)對(duì)細(xì)菌的的直徑-藥劑濃濃度對(duì)數(shù)數(shù)曲線中中可以看看出：1、氨芐芐青霉素素對(duì)大腸腸桿菌有有抑制作作用，但但即使其其濃度達(dá)達(dá)到1250ug/mL時(shí)時(shí)，抑抑菌效果果相對(duì)其其他藥品品仍要弱弱，經(jīng)查查閱文獻(xiàn)獻(xiàn)，氨芐芐青霉素素的最低低抑菌濃濃度為64ug/mL，由由此可見(jiàn)見(jiàn)其抑菌菌效果并并不十分分顯著；；2、氨芐芐青霉素素對(duì)枯草草芽孢桿桿菌無(wú)抑抑制作用用，未出出現(xiàn)抑菌菌圈；3、氨芐芐青霉素素對(duì)革蘭蘭氏陽(yáng)性性細(xì)菌無(wú)無(wú)抑制作作用，對(duì)對(duì)陰性細(xì)細(xì)菌有抑抑制作用用；4、在比比濁法選選用藥品品時(shí)，可可將氨芐芐青霉素素排除。鏈霉素濃濃度梯度度配置5ug/mL10ug/mL100ug/mL500ug/mL2500ug/mL加入藥品量uL1uL1uL2uL10uL40uL加入蒸餾水量uL2mL1mL180uL190uL160uL鏈霉素（（1×104ug/mL）對(duì)對(duì)細(xì)菌的的直徑-藥劑濃濃度對(duì)數(shù)數(shù)曲線數(shù)數(shù)值藥物濃度藥劑對(duì)數(shù)濃度大腸桿菌抑菌圈平均直徑/mm枯草芽孢桿菌抑菌圈平均直徑/mm5ug/mL0.719.517.510ug/mL120.519100ug/mL22326500ug/mL2.723.5282500ug/mL3.42633.5由鏈霉素素對(duì)細(xì)菌菌的直徑徑-藥劑劑濃度對(duì)對(duì)數(shù)曲線線可以看看出：1、鏈霉霉素對(duì)大大腸桿菌菌和枯草草芽孢桿桿菌均有有不同程程度的抑抑制作用用；2、相同同濃度的的鏈霉素素對(duì)枯草草芽孢桿桿菌的抑抑制作用用大于對(duì)對(duì)大腸桿桿菌的抑抑制作用用；3、鏈霉霉素對(duì)大大腸桿菌菌的抑制制作用隨隨著藥劑劑濃度的的增加而而緩慢增增加。在在濃度為為100ug/mL至500ug/mL時(shí)，，出現(xiàn)為為平穩(wěn)期期，但過(guò)過(guò)短。而而后隨著著藥劑濃濃度的增增加，抑抑制作用用又加強(qiáng)強(qiáng)。4、鏈霉霉素對(duì)枯枯草芽孢孢桿菌的的抑制作作用隨著著藥劑濃濃度的增增加而緩緩慢增加加。在濃濃度度為為100ug/mL至至500ug/mL時(shí)時(shí)，，出出現(xiàn)現(xiàn)為為平平穩(wěn)穩(wěn)期期，，但但過(guò)過(guò)短短。。而而后后隨隨著著藥藥劑劑濃濃度度的的增增加加，，抑抑制制作作用用又又加加強(qiáng)強(qiáng)。。5、、鏈鏈霉霉素素對(duì)對(duì)大大腸腸桿桿菌菌和和枯枯草草芽芽孢孢桿桿菌菌的的抑抑制制曲曲線線未未出出現(xiàn)現(xiàn)平平穩(wěn)穩(wěn)期期或或平平穩(wěn)穩(wěn)期期過(guò)過(guò)短短，，故故不不選選用用該該藥藥物物進(jìn)進(jìn)行行下下一一步步實(shí)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)。。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)結(jié)結(jié)果果與與分分析析紅藥藥水水濃濃度度梯梯度度配配置置5%10%50%80%100%加入藥品量uL8uL70uL75uL30uL150uL加入蒸餾水量uL152uL180uL75uL120uL0uL紅藥藥水水（（2××104ug/mL））對(duì)對(duì)細(xì)細(xì)菌菌的的直直徑徑-藥藥劑劑濃濃度度對(duì)對(duì)數(shù)數(shù)曲曲線線數(shù)數(shù)值值藥劑濃度藥劑對(duì)數(shù)濃度大腸桿菌抑菌圈平均直徑/mm枯草芽孢桿菌抑菌圈平均直徑/mm5%3192110%3.325.529.550%42630.580%4.225.523.5100%4.329.531.51、、紅紅藥藥水水對(duì)對(duì)大大腸腸桿桿菌菌和和枯枯草草芽芽孢孢桿桿菌菌均均有有明明顯顯的的殺殺菌菌作作用用；；2、、相相同同濃濃度度的的紅紅藥藥水水對(duì)對(duì)枯枯草草芽芽孢孢桿桿菌菌的的殺殺菌菌作作用用明明顯顯大大于于對(duì)對(duì)大大腸腸桿桿菌菌的的殺殺菌菌作作用用；；3、、紅紅藥藥水水對(duì)對(duì)大大腸腸桿桿菌菌的的抑抑制制作作用用隨隨著著藥藥劑劑濃濃度度的的增增加加而而明明顯顯增增加加。。在在紅紅藥藥水水濃濃度度達(dá)達(dá)到到10%至至80%時(shí)時(shí)，，抑抑制制效效果果達(dá)達(dá)到到平平穩(wěn)穩(wěn)，，在在藥藥劑劑濃濃度度達(dá)達(dá)到到100%時(shí)時(shí)的的抑抑制制作作用用大大大大加加強(qiáng)強(qiáng)，，呈呈直直線線上上升升。。4、、紅紅藥藥水水對(duì)對(duì)枯枯草草芽芽孢孢桿桿菌菌的的殺殺菌菌作作用用隨隨著著藥藥劑劑濃濃度度的的增增加加而而明明顯顯增增加加。。在在藥藥劑劑濃濃度度達(dá)達(dá)到到對(duì)對(duì)枯枯草草芽芽孢孢桿桿菌菌的的抑抑菌菌作作用用在在10%至至50%時(shí)時(shí)，，抑抑制制效效果果達(dá)達(dá)到到平平穩(wěn)穩(wěn)期期，，50%至至80%抑抑菌菌作作用用明明顯顯減減弱弱，，呈呈直直線線下下降降，，可可能能是是由由于于枯枯草草芽芽孢孢桿桿菌菌對(duì)對(duì)80%的的紅紅藥藥水水出出現(xiàn)現(xiàn)耐耐受受性性所所致致。。藥藥劑劑濃濃度度進(jìn)進(jìn)一一步步加加大大，，達(dá)達(dá)到到100%××(2××104ug/mL)時(shí)時(shí)的的抑抑制制作作用用又又大大大大加加強(qiáng)強(qiáng)，，呈呈直直線線上上升升，，此此時(shí)時(shí)的的枯枯草草芽芽孢孢桿桿菌菌對(duì)對(duì)紅紅藥藥水水的的耐耐受受性性已已被被藥藥物物的的高高濃濃度度掩掩蔽蔽。。5、由實(shí)驗(yàn)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)前前期經(jīng)討論論所選擇的的5個(gè)紅藥藥水濃度梯梯度較合適適，得出的的曲線出現(xiàn)現(xiàn)同樣抑菌菌圈時(shí)的最最小藥物濃濃度。2、比濁法法測(cè)抑菌效效果實(shí)驗(yàn)分分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果與與分析丙酸濃度梯梯度配置0.08%0.4%2%10%50%加入藥品量uL1uL1uL3uL20uL75uL加入蒸餾水量uL1249uL249uL147uL180uL75uL丙酸（分析析純100%）對(duì)細(xì)細(xì)菌的直徑徑-藥劑濃濃度對(duì)數(shù)曲曲線數(shù)值藥劑濃度藥劑對(duì)數(shù)濃度大腸桿菌抑菌圈平均直徑/mm枯草芽孢桿菌抑菌圈平均直徑/mm0.08%1.918.519.50.4%2.622.524.52%3.3252810%4283450%4.744.548.5分析結(jié)果從丙酸對(duì)細(xì)細(xì)菌的直徑徑-藥劑濃濃度對(duì)數(shù)曲曲線中可以以看出：1、丙酸對(duì)對(duì)大腸桿菌菌和枯草芽芽孢桿菌均均有明顯的的殺菌作用用，50%的丙酸甚甚至出現(xiàn)了了49mm的抑菌圈圈；2、相同濃濃度的丙酸酸對(duì)枯草芽芽孢桿菌的的殺菌作用用大于對(duì)大大腸桿菌的的殺菌作用用；3、丙酸對(duì)對(duì)大腸桿菌菌的殺菌作作用隨著藥藥劑濃度的的增加而緩緩慢增加。。在濃度為為2%至10%時(shí)丙丙酸對(duì)大腸腸桿菌的殺殺菌作用為為平穩(wěn)期。。而后隨著著藥劑濃度度的增加，，殺菌作用用又加強(qiáng)。。4、丙酸對(duì)對(duì)枯草芽孢孢桿菌的抑抑制作用隨隨著藥劑濃濃度的增加加而緩慢增增加。5、丙酸的的殺菌作用用雖然在50%出現(xiàn)現(xiàn)了49mm的抑菌菌圈，但在在所選濃度度范圍內(nèi)未未出現(xiàn)平穩(wěn)穩(wěn)期或平穩(wěn)穩(wěn)期過(guò)窄，，因此不選選用此藥物物進(jìn)行下一一步實(shí)驗(yàn)。。大腸桿菌OD值-紅紅藥水濃度度對(duì)數(shù)曲線線紅藥水濃度ug/mL紅藥水濃度對(duì)數(shù)0℃加藥37℃加藥37℃不加藥70ug/mL1.90.860.9070.246120ug/mL2.10.860.9170.252170ug/mL2.20.8730.910.247220ug/mL2.30.871.1490.237270ug/mL2.40.880.9510.228枯草芽孢桿桿菌OD值值-紅藥水水濃度對(duì)數(shù)數(shù)曲線紅藥水濃度ug/mL紅藥水濃度對(duì)數(shù)0℃加藥37℃加藥37℃不加藥70ug/mL1.90.7240.7960.066120ug/mL2.10.7350.8010.08170ug/mL2.20.740.8150.054220ug/mL2.30.761.0120.09270ug/mL2.40.7930.9210.056從大腸桿菌菌OD值-紅藥水濃濃度對(duì)數(shù)曲曲線、枯草草芽孢桿菌菌OD值-紅藥水濃濃度對(duì)數(shù)曲曲線中可以以看出：OD=log（1/A）（