教學培訓課件第8章-第1節(jié)-基因診斷(3-LMJ)

第八章基因診斷與基因治療基因診斷（genediagnosis）：——從基因水平探測和分析疾病的起因。基因治療（genetherapy）：——從基因水平干涉和矯正疾病造成的紊亂。1多數(shù)非感染性疾病發(fā)生的根本原因是基因結構的變異或表達水平的異常；感染性疾病則是病原體入侵在體內表達外源性基因所致。授課老師：江黎明2021/7/91第八章基因診斷與基因治療基因診斷（genediagnos一、基因診斷的概念和特點二、基因診斷的主要技術方法三、常見的基因異常及其檢測四、疾病的基因診斷(自習)五、基因診斷在法醫(yī)學上的應用第一節(jié)基因診斷(gene

diagnosis)2021/7/92一、基因診斷的概念和特點二、基因診斷的主要技術方法三、常見的

基因診斷通常是指利用分子生物學的方法技術，直接檢測體內DNA的結構變異或RNA的水平變化，從而對疾病作出診斷的方法。一、基因診斷的概念和特點（一）概念

適用于遺傳性疾病、感染性疾病、腫瘤等多種疾病的診斷，以及個體識別和親子鑒定等法病學領域。2021/7/93基因診斷通常是指利用分子生物學的方法技術，直接檢測體（二）特點--以已知基因作為檢測對象（l）特異性強：直接檢測導致疾病發(fā)生的基因變化；（2）靈敏度高：所采用的分子雜交和聚合酶鏈反應等技術都具有信號放大作用；（3）取樣便利：一般不受組織或時相的限制；（4）早期診斷：易在疾病尚無臨床表現(xiàn)時作出診斷；（5）應用廣泛：可檢測自體基因和外源基因。一、基因診斷的概念和特點2021/7/94（二）特點--以已知基因作為檢測對象（l）特異性強：直接檢測(一)核酸分子雜交（NAhybridization）(二)聚合酶鏈式反應（PCR）技術(三)單鏈構象多態(tài)性分析（SSCP）(四)DNA分子多態(tài)性（DNApolymorphism）分析(五)限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）分析(六)顯微切割（microdissection）技術5(七)DNA序列測定（DNAsequencing）二、基因診斷的主要技術方法2021/7/95(一)核酸分子雜交（NAhybridization）(二(一)核酸分子雜交4.DNA芯片(DNAchip)技術

Southern/DNA印跡、Northern/RNA印跡(第七/六章)和Western/蛋白質印跡(第九/二章)其他雜交方法:1.斑點印跡(dotblotting)與狹縫雜交2.組織原位雜交(tissureinsituhybridization)3.等位基因特異性寡核苷酸雜交(allele-specificoligonucleotidehybridization,ASOH)二、基因診斷的主要技術方法2021/7/96(一)核酸分子雜交4.DNA芯片(DNAchip)技術71.斑點印跡(dotblotting)雜交將核酸(DNA或RNA)樣品點在NC膜上，變性后與標記探針結合，顯影或顯色，密度測量，與對照品比較確定所測核酸量的高低。方法：應用：主要用于檢測細胞基因拷貝數(shù)的變化或者mRNA含量的變化。便于大規(guī)模檢測和篩選；容易出現(xiàn)假陽性。特點：2021/7/9771.斑點印跡(dotblotting)雜交將核酸(DNASlot-blot結果GS-670型光密度掃描儀(Bio-Rad)

2021/7/98Slot-blot結果GS-670型光密度2021/7/9892.組織原位雜交(tissureinsituhybridization)組織或細胞(新鮮組織切片、細胞涂片或石蠟切片)樣品做適當處理(如固定劑固定、蛋白酶消化)，使其通透性增大，標記探針進入細胞內與核酸雜交。方法：應用：被檢測基因或mRNA在細胞內的檢測及定位。特點：不需提取被檢核酸，可確定被檢核酸細胞內定位。1986創(chuàng)建的熒光原位雜交(FISH)用于特定基因的定位及其缺失、擴增或重排的檢測。2021/7/9992.組織原位雜交(tissureinsituhybr2021/7/9102021/7/910原癌基因ERBB-2(Her-2)，基因擴增熒光原位雜交檢測2021/7/911原癌基因ERBB-2(Her-2)，基因擴增熒光原位雜交檢測熒光原位雜交2021/7/912熒光原位雜交2021/7/9123.等位基因特異性寡核苷酸雜交(ASOH)根據(jù)已知基因突變位點的堿基序列，設計和制備與野生型或突變型基因序列片段互補的兩種探針，分別與被檢DNA進行雜交，確定基因突變存在與否，分辨純/雜合子。方法：應用：基因結構變異所致疾病的診斷。特點：雜交條件要求嚴格，以避免出現(xiàn)假陽性或假陰性。2021/7/9133.等位基因特異性寡核苷酸雜交(ASOH)根據(jù)已知基因突變位N：正?；颍籋：雜合子基因；M：突變基因ASO1ASO2NHMASOH示意圖2021/7/914N：正?；颍籋：雜合子基因；M：突變基因ASO1ASO2N4.DNA芯片(DNAchip)技術DNA點陣(DNAarray)——把多種已知序列的DNA片段排列在固體支持物上，同時對樣品中的多種核酸進行檢測和分析。方法：應用：單核苷酸多態(tài)性(SNP)、基因表達譜和遺傳性疾病的分析；病原微生物的大規(guī)模檢測。DNA微陣列(DNAmicroarray)——通過計算機控制點樣和圖像掃描的高密度集成探針的雜交技術。2021/7/9154.DNA芯片(DNAchip)技術DNA點陣(DN(二)PCR技術(第七/七章)1.PCR技術的原理以DNA分子為模板，加入與擬擴增DNA片段兩端分別互補的一對寡核苷酸鏈作為引物，在DNA聚合酶的催化下，按照半保留復制的形式分別合成兩股新的DNA互補鏈，可使兩引物間的DNA片段拷貝數(shù)增加一倍。

多次重復這一過程，可使這段DNA拷貝數(shù)隨復制次數(shù)以指數(shù)形式擴增。二、基因診斷的主要技術方法2021/7/916(二)PCR技術(第七/七章)1.PCR技術的原理2.基因診斷中常用的PCR及其衍生技術(1)DNA的微量分析

總RNA(或mRNA)ss-cDNAds-cDNAPCR擴增PCR法靈敏度高，對模板DNA純度要求不高，且樣品用量極微(如一滴血、一根頭發(fā)等)。(2)RT-PCR(reversetranscriptional-PCR)2021/7/9172.基因診斷中常用的PCR及其衍生技術(1)DNA的微18(3)巢式-PCR(nestedPCR)用2對引物(外引物、內引物)擴增，大大提高了擴增的特異性(4)不對稱PCR(asymmetricPCR)2個引物濃度不等，一般采用50:1或100:1的摩爾比，主要獲取單鏈DNA作構象分析或用作探針。2021/7/91818(3)巢式-PCR(nestedPCR)用2對19(5)多重PCR(multiplexPCR)在同反應體系中加入多對引物，同時擴增同一DNA樣品中的多個不同序列區(qū)域，且每對引物所擴增的產(chǎn)物長度都不同，可根據(jù)電泳結果判斷是否存在某些基因片段的缺失或長度改變。(6)等位基因特異性PCR(AS-PCR)

針對等位基因的序列差異區(qū)域設計引物，使引物的3’端與等位基因序列的差異堿基對應，僅能與突變型或野生型互補。2021/7/91919(5)多重PCR(multiplexPCR)(7)原位PCR(insituPCR,IS-PCR)技術

1)細胞和組織經(jīng)固定劑固定、蛋白酶消化，使細胞獲得適度的通透性，既利于PCR反應試劑到達靶位，又可防止擴增產(chǎn)物從細胞內漏出；

2)把載玻片的靶DNA進行常規(guī)PCR(病毒RNA的擴增用RT-PCR);

3)最后通過間接法(原位雜交)或直接法(PRC過程中加入標記)檢測擴增產(chǎn)物。2021/7/920(7)原位PCR(insituPCR,IS-PCR)（8）實時熒光定量PCR

PCR擴增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而使熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號；每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。2021/7/921（8）實時熒光定量PCRPCR擴增時，Taq酶的5’22(三)單鏈構象多態(tài)性分析利用單個或多個堿基不同、但序列長度相等的雙鏈核酸分子，經(jīng)變性成單鏈后可具有不同的構象而在中性PAGE電泳中的遷移率不同；(singlestrandcomformationpolymorphism,SSCP)與正常的電泳圖型對照，出現(xiàn)新條帶即可判定存在堿基變異。二、基因診斷的主要技術方法2021/7/92222(三)單鏈構象多態(tài)性分析利用單個或多個堿基不同與PCR聯(lián)用稱為PCR-SSCP；廣泛用于大批樣品基因突變的檢測(初篩)。2021/7/923與PCR聯(lián)用稱為PCR-SSCP；廣泛用于大批樣品基因突變的241.限制性片段長度多態(tài)性的檢測3.單核苷酸多態(tài)性2.數(shù)目可變的串聯(lián)重復序列多態(tài)性的檢測(四)DNA分子多態(tài)性(DNApolymorphism)分析(singlenucleotidepolymorphism,SNP)(variablenumberoftandemrepeats,VNTR)(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)二、基因診斷的主要技術方法2021/7/924241.限制性片段長度多態(tài)性的檢測3.單核苷酸多態(tài)性2.數(shù)目25VNTR的重復序列出現(xiàn)次數(shù)在6次100次之間；小衛(wèi)星DNA(minisatelliteDNA):重復單元長度為6~70bp；微衛(wèi)星DNA(microsatelliteDNA):重復單元長度為1~6bp。短串聯(lián)重復DNA(shorttandemrepeatDNA,STRDNA):重復單元長度為2~6bp。根據(jù)重復單元長度可分為：2021/7/92525VNTR的重復序列出現(xiàn)次數(shù)在6次100次之間；小衛(wèi)星DN26不同個體間重復單元[如(CA)n/(TG)n]的拷貝數(shù)(即出現(xiàn)的頻率)不同，因而產(chǎn)生多態(tài)性，稱為VNTR多態(tài)性。VNTR多態(tài)性：限制酶識別位點限制酶識別位點2021/7/92626不同個體間重復單元[如(CA)n/(TG)n]27(五)限制酶譜分析當某種限制酶的切點改變時(由點突變、單個堿基的插入或缺失引起)，用該種限制酶切割后得到的DNA片段的大小和數(shù)目都隨之發(fā)生變化，通過電泳分析即可作出判斷。PCR-RFLP設計適當?shù)臄U增引物，使擴增片段包括某一個或數(shù)個限制性內切酶識別序列，在PCR擴增后用該限制酶切割PCR產(chǎn)物，根據(jù)電泳后酶切片段長度變化，即可作出診斷。二、基因診斷的主要技術方法2021/7/92727(五)限制酶譜分析當某種限制酶的切點改變時(由ABCDEFG－＋DEFBGCA-GAATTC--CTTAAG-EFBG－＋C+DAEcoRⅠ限制性內切酶位點的變化2021/7/928ABCDEFG－＋DEFBGCA-GAATTC-EFBG－29(六)顯微切割(microdissection)技術是應用激光捕獲顯微鏡，在高倍鏡下選擇幾個甚至一個細胞進行分析；可用于石蠟包埋組織進行回顧性診斷。2.染色體的顯微切割。1.組織細胞的顯微切割是切割分裂中期的染色體的目的區(qū)域，如某些斷裂或易位、倒位位點的染色體片段，再進行后續(xù)分析。二、基因診斷的主要技術方法2021/7/92929(六)顯微切割(microdissection)技術

瑞士MIICellCut全自動激光顯微切割（熒光）系統(tǒng)

可通過紫外激光切割需要分離的組織，然后通過有黏性的Eppendorff管蓋進行收集，這樣就可以將特定類型的細胞從組織切片上分離下來。2021/7/930瑞士MIICellCut全自動激光顯微切割（熒可以準確、快速、無損傷地分離出純凈的特定細胞或組織，保持細胞內生物分子的完整性，以便用于后續(xù)的DNA、RNA和蛋白質分析。配有近紅外激光(波長810nm)；紫外激光(波長349nm)；紅色、綠色、藍色三種熒光濾光片。美國Arcturus公司的Veritas激光捕獲顯微分離儀2021/7/931可以準確、快速、無損傷地分離出純凈的特定細胞或組織，PICS

Altra

II流式細胞儀(分析分選)2021/7/932PICS

Altra

II流式細胞儀(分析分選)2021/733(七)DNA序列測定該法是基因診斷所有的技術方法中最準確最可靠的—種。缺點：費時、費力、費用高。二、基因診斷的主要技術方法2021/7/93333(七)DNA序列測定該法是基因診斷所有的技術方法34(一)點突變的檢測三、常見的基因異常及其檢測(二)大片段核苷酸丟失或插入的檢測(三)基因重排的檢測(四)基因擴增的檢測(五)DNA多態(tài)性的檢測(六)基因表達異常的檢測(七)病原體基因的檢測2021/7/93434(一)點突變的檢測三、常見的基因異常及其檢測(二)大片段35(一)點突變的檢測

狹義的點突變指堿基替代，分為單點突變和多點突變；廣義的點突變還包括少數(shù)核苷酸的缺失或插入。1.已知點突變的檢測突變位點已被闡明的遺傳病，可采用PCR等位基因特異性寡核苷酸雜交(PCR/AS0H)檢測。三、常見的基因異常及其檢測2021/7/93535(一)點突變的檢測狹義的點突變指堿基替代，分為單PCR/AS0H

檢測:(1)根據(jù)突變點上下游的序列設計合成引物，PCR擴增出突變區(qū)的DNA片段。(2)將PCR產(chǎn)物用斑點或狹縫點樣器點在尼龍膜上，以紫外線照射固定。(3)針對上述每種突變位點，分別合成2個寡核苷酸探針；其中一個具有正常的堿基序列，另一個則具有突變的堿基序列。(4)分別預雜交、雜交、洗膜、放射自顯影或顯色。(5)分析正常探針及突變探針分別雜交得到的顯影或顯色圖譜，即可作出基因診斷2021/7/936PCR/AS0H檢測:(1)根據(jù)突變點上下游的序列設計N：正?；颍籋：雜合子基因；M：突變基因ASO1ASO2NHM(PCR/AS0H檢測示意圖)2021/7/937N：正?；?；H：雜合子基因；M：突變基因ASO1ASO2N2.未知點突變的檢測初篩：PCR-SSCP分析法確認：DNAsequencing。2021/7/9382.未知點突變的檢測初篩：PCR-SSCP分析法確認：DNAPCR-SSCP:廣泛用于大批樣品基因突變的檢測(初篩)。2021/7/939PCR-SSCP:廣泛用于大批樣品基因突變的檢測(初篩)。3.少數(shù)核苷酸缺失或插入的檢測可供選擇的方法：PCR-RFLP分析、AS-PCR、PCR-SSCP及DNA測序等2021/7/9403.少數(shù)核苷酸缺失或插入的檢測可供選擇的鐮形細胞貧血原因：β-珠蛋白鏈第6位密碼子GAG→GTG，造成Glu→Val所致。方法：設計一對引物PCR擴增可得294bp，OxaNI

消化，電泳。294191103bpAA：正常人BB：純合子病人CC：雜合子病人結果：2021/7/941鐮形細胞貧血原因：β-珠蛋白鏈第6位密碼子GAG→GTG，(二)大片段核苷酸丟失或插入的檢測1.中等長度(0.5-1.5kb)的DNA片段缺失或插入，可用一對引物的普通PCR檢測。2.若基因較大度(大于1.5kb)，且多個位點存在插入或缺失、位點間距離較遠，宜采用多重PCR法檢測。5’3’3’5’（多重PCR的引物設計示意圖）三、常見的基因異常及其檢測2021/7/942(二)大片段核苷酸丟失或插入的檢測1.中等長度DMD基因定位于人類X染色體短臂Xp21.2上。位于該區(qū)的dystrophin(肌營養(yǎng)不良蛋白)基因的突變或部分缺失，是導致DMD的原發(fā)病因。

dystrophin基因中有9個易發(fā)生缺失的熱點區(qū)片段,它們分別位于外顯子4、8、12、17、19、44、45、48和51。杜氏肌營養(yǎng)不良癥(Duchennemusculardystrophy,

DMD)2021/7/943DMD基因定位于人類X染色體短臂Xp21.2上。多重PCR法檢測中的基因突變同時用2對引物雙重擴增dystrophin基因外顯子17和48區(qū)域內的2個片段，可檢測出75％左右的基因缺失型患者；

若同時用9對引物多重擴增，則可以檢測到90％左右的基因缺失型患者。2021/7/944多重PCR法檢測中的基因突變同時用2對引物雙重擴增d(三)基因重排的檢測基因從一條染色體的正常位置轉移到其他染色體的某個位置稱基因易位或重排。1.熒光原位雜交技術(FISH)。2.PCR擴增可用不同顏色的熒光標記DNA探針，可在染色體上定位基因或DNA片段及它們彼此間的排序。

前提條件是已知重排基因和位點的序列。三、常見的基因異常及其檢測2021/7/945(三)基因重排的檢測基因從一條染色體的正常位熒光原位雜交（雙色FISH）2021/7/946熒光原位雜交（雙色FISH）2021/7/946(四)基因擴增的檢測基因擴增指基因拷貝數(shù)增加的現(xiàn)象,可增加幾十到上千倍?？捎么郎y基因的DNA片段或cDNA片段為探針，基因組DNA采用適當?shù)南拗泼该盖泻笞鱏outhern印跡雜交分析。三、常見的基因異常及其檢測2021/7/947(四)基因擴增的檢測基因擴增指基因拷貝數(shù)增加的現(xiàn)象

(五)DNA多態(tài)性的檢測

1.限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)2.數(shù)目可變串聯(lián)重復序列(VNTR)多性多態(tài)性位點周圍DNA序列已知時，可用PCR/RFLP分析。針對串聯(lián)重復序列兩側的DNA序列設計引物，PCR擴增后電泳。三、常見的基因異常及其檢測2021/7/948(五)DNA多態(tài)性的檢測1.限制性片段長度1.mRNA的相對定量分析

(1)斑點雜交或狹線雜交放射或非放射標記的cDNA探針與待測RNA雜交，經(jīng)顯影或顯色，與正常對照比較即可定量待測RNA。(2)RT-PCR法

對電泳凝膠中的擴增產(chǎn)物cDNA行光密度掃描，計算模板mRNA的量；若dNTPs帶放射性標記，作放射活性測定，并由此推算mRNA的含量。(六)基因表達異常的檢測三、常見的基因異常及其檢測2021/7/9491.mRNA的相對定量分析2.mRNA的絕對定量分析

(1)采用一系列已知不同濃度的與待測mRNA序列相同但長度不同的內對照mRNA，在同一體系中一同進行RT-PCR(加32p-dCTP)，擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離，分別測定兩者放射性強度，繪制標準曲線即可查出特異mRNA的量。(2)用熒光定量PCR法對擴增產(chǎn)物定量。3.mRNA的長度分析(2)先分析RT-PCR產(chǎn)物電泳條帶長度，后測序確認。(1)采用Northern印跡雜交法檢測某種特異的mRNA的長度有否改變；2021/7/9502.mRNA的絕對定量分析(1)采用一系列已知不同濃(一)遺傳病的基因診斷1.血紅蛋白?。╤emoglobinopathy）四、疾病的基因診斷(自習)2.苯丙酮尿癥(phenylketonuria,PKU)(二)感染性疾病的基因診斷1.乙型肝炎的基因診斷2.痢疾桿菌和侵襲性大腸桿菌的檢測(三)腫瘤的基因診斷1.肺癌(lungcancer)2.乳腺癌(breastcancer)2021/7/951(一)遺傳病的基因診斷1.血紅蛋白?。╤emoglobino(一)重復序列多態(tài)性與DNA指紋人類基因組DNA序列中存在眾多的多態(tài)遺傳標記，除非同卵雙生，幾乎沒有任何兩個人的DNA分析圖譜會完全相同，稱為DNA指紋。五、基因診斷在法醫(yī)學上的應用人類基因組中存在有大量的數(shù)目可變的串聯(lián)重復序列(VNTR)；可分為小衛(wèi)星DNA、微衛(wèi)星DNA/短串聯(lián)重復(STR)。VNTR位點的平均雜合度在70%左右，存在極為廣泛，分布十分理想，且檢測方法簡便，以取代RFLP而成為構建連鎖圖譜的新標記。2021/7/952(一)重復序列多態(tài)性與DNA指紋人類基因組DNA序列1985年，英國遺傳學家Jeffreys等用串聯(lián)重復序列(TR)的核心序列為探針進行RFLP分析，檢測到許多高度可變區(qū)(HVR)，所得圖譜具有高度的個體特異性，達到了如同人類指紋那樣的高度專一性，稱為DNA指紋圖譜(DNAfingerprinting)。

AlecJohnJeffreysOxford,UnitedKingdom

2021/7/9531985年，英國遺傳學家Jeffreys等用串聯(lián)(二)DNA指紋與法醫(yī)案檢工作法醫(yī)學中基因診斷的目的主要是個體識別和親子鑒定。以往法醫(yī)學鑒定中應用的是血型、血清蛋白型、紅細胞酶型和HLA分型、單位點特異性探針RFLP分析；個體分辨力不夠，只能排除，不能做到統(tǒng)一認證。五、基因診斷在法醫(yī)學上的應用2021/7/954(二)DNA指紋與法醫(yī)案檢工作法醫(yī)學中基因診斷的目法醫(yī)案檢中的基因診斷技術VNTR（可變數(shù)目串聯(lián)重復序列/小衛(wèi)星）的核酸分子雜交分析STR（短串聯(lián)重復序列/微衛(wèi)星）的PCR分析SNP的基因芯片檢測2021/7/955法醫(yī)案檢中的基因診斷技術VNTR（可變數(shù)目串聯(lián)重復序列/小衛(wèi)親權鑒定與DNA指紋圖由此圖可推斷出：A和C是親生女兒；B為妻子和其前夫所生；D為養(yǎng)女。2021/7/956親權鑒定與DNA指紋圖2021/7/956血跡中的DNA2021/7/957血跡中的DNA2021/7/957問題？問題？第八章基因診斷與基因治療基因診斷（genediagnosis）：——從基因水平探測和分析疾病的起因?；蛑委煟╣enetherapy）：——從基因水平干涉和矯正疾病造成的紊亂。59多數(shù)非感染性疾病發(fā)生的根本原因是基因結構的變異或表達水平的異常；感染性疾病則是病原體入侵在體內表達外源性基因所致。授課老師：江黎明2021/7/959第八章基因診斷與基因治療基因診斷（genediagnos一、基因診斷的概念和特點二、基因診斷的主要技術方法三、常見的基因異常及其檢測四、疾病的基因診斷(自習)五、基因診斷在法醫(yī)學上的應用第一節(jié)基因診斷(gene

diagnosis)2021/7/960一、基因診斷的概念和特點二、基因診斷的主要技術方法三、常見的

基因診斷通常是指利用分子生物學的方法技術，直接檢測體內DNA的結構變異或RNA的水平變化，從而對疾病作出診斷的方法。一、基因診斷的概念和特點（一）概念

適用于遺傳性疾病、感染性疾病、腫瘤等多種疾病的診斷，以及個體識別和親子鑒定等法病學領域。2021/7/961基因診斷通常是指利用分子生物學的方法技術，直接檢測體（二）特點--以已知基因作為檢測對象（l）特異性強：直接檢測導致疾病發(fā)生的基因變化；（2）靈敏度高：所采用的分子雜交和聚合酶鏈反應等技術都具有信號放大作用；（3）取樣便利：一般不受組織或時相的限制；（4）早期診斷：易在疾病尚無臨床表現(xiàn)時作出診斷；（5）應用廣泛：可檢測自體基因和外源基因。一、基因診斷的概念和特點2021/7/962（二）特點--以已知基因作為檢測對象（l）特異性強：直接檢測(一)核酸分子雜交（NAhybridization）(二)聚合酶鏈式反應（PCR）技術(三)單鏈構象多態(tài)性分析（SSCP）(四)DNA分子多態(tài)性（DNApolymorphism）分析(五)限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）分析(六)顯微切割（microdissection）技術63(七)DNA序列測定（DNAsequencing）二、基因診斷的主要技術方法2021/7/963(一)核酸分子雜交（NAhybridization）(二(一)核酸分子雜交4.DNA芯片(DNAchip)技術

Southern/DNA印跡、Northern/RNA印跡(第七/六章)和Western/蛋白質印跡(第九/二章)其他雜交方法:1.斑點印跡(dotblotting)與狹縫雜交2.組織原位雜交(tissureinsituhybridization)3.等位基因特異性寡核苷酸雜交(allele-specificoligonucleotidehybridization,ASOH)二、基因診斷的主要技術方法2021/7/964(一)核酸分子雜交4.DNA芯片(DNAchip)技術651.斑點印跡(dotblotting)雜交將核酸(DNA或RNA)樣品點在NC膜上，變性后與標記探針結合，顯影或顯色，密度測量，與對照品比較確定所測核酸量的高低。方法：應用：主要用于檢測細胞基因拷貝數(shù)的變化或者mRNA含量的變化。便于大規(guī)模檢測和篩選；容易出現(xiàn)假陽性。特點：2021/7/96571.斑點印跡(dotblotting)雜交將核酸(DNASlot-blot結果GS-670型光密度掃描儀(Bio-Rad)

2021/7/966Slot-blot結果GS-670型光密度2021/7/98672.組織原位雜交(tissureinsituhybridization)組織或細胞(新鮮組織切片、細胞涂片或石蠟切片)樣品做適當處理(如固定劑固定、蛋白酶消化)，使其通透性增大，標記探針進入細胞內與核酸雜交。方法：應用：被檢測基因或mRNA在細胞內的檢測及定位。特點：不需提取被檢核酸，可確定被檢核酸細胞內定位。1986創(chuàng)建的熒光原位雜交(FISH)用于特定基因的定位及其缺失、擴增或重排的檢測。2021/7/96792.組織原位雜交(tissureinsituhybr2021/7/9682021/7/910原癌基因ERBB-2(Her-2)，基因擴增熒光原位雜交檢測2021/7/969原癌基因ERBB-2(Her-2)，基因擴增熒光原位雜交檢測熒光原位雜交2021/7/970熒光原位雜交2021/7/9123.等位基因特異性寡核苷酸雜交(ASOH)根據(jù)已知基因突變位點的堿基序列，設計和制備與野生型或突變型基因序列片段互補的兩種探針，分別與被檢DNA進行雜交，確定基因突變存在與否，分辨純/雜合子。方法：應用：基因結構變異所致疾病的診斷。特點：雜交條件要求嚴格，以避免出現(xiàn)假陽性或假陰性。2021/7/9713.等位基因特異性寡核苷酸雜交(ASOH)根據(jù)已知基因突變位N：正?；?；H：雜合子基因；M：突變基因ASO1ASO2NHMASOH示意圖2021/7/972N：正?；?；H：雜合子基因；M：突變基因ASO1ASO2N4.DNA芯片(DNAchip)技術DNA點陣(DNAarray)——把多種已知序列的DNA片段排列在固體支持物上，同時對樣品中的多種核酸進行檢測和分析。方法：應用：單核苷酸多態(tài)性(SNP)、基因表達譜和遺傳性疾病的分析；病原微生物的大規(guī)模檢測。DNA微陣列(DNAmicroarray)——通過計算機控制點樣和圖像掃描的高密度集成探針的雜交技術。2021/7/9734.DNA芯片(DNAchip)技術DNA點陣(DN(二)PCR技術(第七/七章)1.PCR技術的原理以DNA分子為模板，加入與擬擴增DNA片段兩端分別互補的一對寡核苷酸鏈作為引物，在DNA聚合酶的催化下，按照半保留復制的形式分別合成兩股新的DNA互補鏈，可使兩引物間的DNA片段拷貝數(shù)增加一倍。

多次重復這一過程，可使這段DNA拷貝數(shù)隨復制次數(shù)以指數(shù)形式擴增。二、基因診斷的主要技術方法2021/7/974(二)PCR技術(第七/七章)1.PCR技術的原理2.基因診斷中常用的PCR及其衍生技術(1)DNA的微量分析

總RNA(或mRNA)ss-cDNAds-cDNAPCR擴增PCR法靈敏度高，對模板DNA純度要求不高，且樣品用量極微(如一滴血、一根頭發(fā)等)。(2)RT-PCR(reversetranscriptional-PCR)2021/7/9752.基因診斷中常用的PCR及其衍生技術(1)DNA的微76(3)巢式-PCR(nestedPCR)用2對引物(外引物、內引物)擴增，大大提高了擴增的特異性(4)不對稱PCR(asymmetricPCR)2個引物濃度不等，一般采用50:1或100:1的摩爾比，主要獲取單鏈DNA作構象分析或用作探針。2021/7/97618(3)巢式-PCR(nestedPCR)用2對77(5)多重PCR(multiplexPCR)在同反應體系中加入多對引物，同時擴增同一DNA樣品中的多個不同序列區(qū)域，且每對引物所擴增的產(chǎn)物長度都不同，可根據(jù)電泳結果判斷是否存在某些基因片段的缺失或長度改變。(6)等位基因特異性PCR(AS-PCR)

針對等位基因的序列差異區(qū)域設計引物，使引物的3’端與等位基因序列的差異堿基對應，僅能與突變型或野生型互補。2021/7/97719(5)多重PCR(multiplexPCR)(7)原位PCR(insituPCR,IS-PCR)技術

1)細胞和組織經(jīng)固定劑固定、蛋白酶消化，使細胞獲得適度的通透性，既利于PCR反應試劑到達靶位，又可防止擴增產(chǎn)物從細胞內漏出；

2)把載玻片的靶DNA進行常規(guī)PCR(病毒RNA的擴增用RT-PCR);

3)最后通過間接法(原位雜交)或直接法(PRC過程中加入標記)檢測擴增產(chǎn)物。2021/7/978(7)原位PCR(insituPCR,IS-PCR)（8）實時熒光定量PCR

PCR擴增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而使熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號；每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。2021/7/979（8）實時熒光定量PCRPCR擴增時，Taq酶的5’80(三)單鏈構象多態(tài)性分析利用單個或多個堿基不同、但序列長度相等的雙鏈核酸分子，經(jīng)變性成單鏈后可具有不同的構象而在中性PAGE電泳中的遷移率不同；(singlestrandcomformationpolymorphism,SSCP)與正常的電泳圖型對照，出現(xiàn)新條帶即可判定存在堿基變異。二、基因診斷的主要技術方法2021/7/98022(三)單鏈構象多態(tài)性分析利用單個或多個堿基不同與PCR聯(lián)用稱為PCR-SSCP；廣泛用于大批樣品基因突變的檢測(初篩)。2021/7/981與PCR聯(lián)用稱為PCR-SSCP；廣泛用于大批樣品基因突變的821.限制性片段長度多態(tài)性的檢測3.單核苷酸多態(tài)性2.數(shù)目可變的串聯(lián)重復序列多態(tài)性的檢測(四)DNA分子多態(tài)性(DNApolymorphism)分析(singlenucleotidepolymorphism,SNP)(variablenumberoftandemrepeats,VNTR)(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)二、基因診斷的主要技術方法2021/7/982241.限制性片段長度多態(tài)性的檢測3.單核苷酸多態(tài)性2.數(shù)目83VNTR的重復序列出現(xiàn)次數(shù)在6次100次之間；小衛(wèi)星DNA(minisatelliteDNA):重復單元長度為6~70bp；微衛(wèi)星DNA(microsatelliteDNA):重復單元長度為1~6bp。短串聯(lián)重復DNA(shorttandemrepeatDNA,STRDNA):重復單元長度為2~6bp。根據(jù)重復單元長度可分為：2021/7/98325VNTR的重復序列出現(xiàn)次數(shù)在6次100次之間；小衛(wèi)星DN84不同個體間重復單元[如(CA)n/(TG)n]的拷貝數(shù)(即出現(xiàn)的頻率)不同，因而產(chǎn)生多態(tài)性，稱為VNTR多態(tài)性。VNTR多態(tài)性：限制酶識別位點限制酶識別位點2021/7/98426不同個體間重復單元[如(CA)n/(TG)n]85(五)限制酶譜分析當某種限制酶的切點改變時(由點突變、單個堿基的插入或缺失引起)，用該種限制酶切割后得到的DNA片段的大小和數(shù)目都隨之發(fā)生變化，通過電泳分析即可作出判斷。PCR-RFLP設計適當?shù)臄U增引物，使擴增片段包括某一個或數(shù)個限制性內切酶識別序列，在PCR擴增后用該限制酶切割PCR產(chǎn)物，根據(jù)電泳后酶切片段長度變化，即可作出診斷。二、基因診斷的主要技術方法2021/7/98527(五)限制酶譜分析當某種限制酶的切點改變時(由ABCDEFG－＋DEFBGCA-GAATTC--CTTAAG-EFBG－＋C+DAEcoRⅠ限制性內切酶位點的變化2021/7/986ABCDEFG－＋DEFBGCA-GAATTC-EFBG－87(六)顯微切割(microdissection)技術是應用激光捕獲顯微鏡，在高倍鏡下選擇幾個甚至一個細胞進行分析；可用于石蠟包埋組織進行回顧性診斷。2.染色體的顯微切割。1.組織細胞的顯微切割是切割分裂中期的染色體的目的區(qū)域，如某些斷裂或易位、倒位位點的染色體片段，再進行后續(xù)分析。二、基因診斷的主要技術方法2021/7/98729(六)顯微切割(microdissection)技術

瑞士MIICellCut全自動激光顯微切割（熒光）系統(tǒng)

可通過紫外激光切割需要分離的組織，然后通過有黏性的Eppendorff管蓋進行收集，這樣就可以將特定類型的細胞從組織切片上分離下來。2021/7/988瑞士MIICellCut全自動激光顯微切割（熒可以準確、快速、無損傷地分離出純凈的特定細胞或組織，保持細胞內生物分子的完整性，以便用于后續(xù)的DNA、RNA和蛋白質分析。配有近紅外激光(波長810nm)；紫外激光(波長349nm)；紅色、綠色、藍色三種熒光濾光片。美國Arcturus公司的Veritas激光捕獲顯微分離儀2021/7/989可以準確、快速、無損傷地分離出純凈的特定細胞或組織，PICS

Altra

II流式細胞儀(分析分選)2021/7/990PICS

Altra

II流式細胞儀(分析分選)2021/791(七)DNA序列測定該法是基因診斷所有的技術方法中最準確最可靠的—種。缺點：費時、費力、費用高。二、基因診斷的主要技術方法2021/7/99133(七)DNA序列測定該法是基因診斷所有的技術方法92(一)點突變的檢測三、常見的基因異常及其檢測(二)大片段核苷酸丟失或插入的檢測(三)基因重排的檢測(四)基因擴增的檢測(五)DNA多態(tài)性的檢測(六)基因表達異常的檢測(七)病原體基因的檢測2021/7/99234(一)點突變的檢測三、常見的基因異常及其檢測(二)大片段93(一)點突變的檢測

狹義的點突變指堿基替代，分為單點突變和多點突變；廣義的點突變還包括少數(shù)核苷酸的缺失或插入。1.已知點突變的檢測突變位點已被闡明的遺傳病，可采用PCR等位基因特異性寡核苷酸雜交(PCR/AS0H)檢測。三、常見的基因異常及其檢測2021/7/99335(一)點突變的檢測狹義的點突變指堿基替代，分為單PCR/AS0H

檢測:(1)根據(jù)突變點上下游的序列設計合成引物，PCR擴增出突變區(qū)的DNA片段。(2)將PCR產(chǎn)物用斑點或狹縫點樣器點在尼龍膜上，以紫外線照射固定。(3)針對上述每種突變位點，分別合成2個寡核苷酸探針；其中一個具有正常的堿基序列，另一個則具有突變的堿基序列。(4)分別預雜交、雜交、洗膜、放射自顯影或顯色。(5)分析正常探針及突變探針分別雜交得到的顯影或顯色圖譜，即可作出基因診斷2021/7/994PCR/AS0H檢測:(1)根據(jù)突變點上下游的序列設計N：正?；?；H：雜合子基因；M：突變基因ASO1ASO2NHM(PCR/AS0H檢測示意圖)2021/7/995N：正常基因；H：雜合子基因；M：突變基因ASO1ASO2N2.未知點突變的檢測初篩：PCR-SSCP分析法確認：DNAsequencing。2021/7/9962.未知點突變的檢測初篩：PCR-SSCP分析法確認：DNAPCR-SSCP:廣泛用于大批樣品基因突變的檢測(初篩)。2021/7/997PCR-SSCP:廣泛用于大批樣品基因突變的檢測(初篩)。3.少數(shù)核苷酸缺失或插入的檢測可供選擇的方法：PCR-RFLP分析、AS-PCR、PCR-SSCP及DNA測序等2021/7/9983.少數(shù)核苷酸缺失或插入的檢測可供選擇的鐮形細胞貧血原因：β-珠蛋白鏈第6位密碼子GAG→GTG，造成Glu→Val所致。方法：設計一對引物PCR擴增可得294bp，OxaNI

消化，電泳。294191103bpAA：正常人BB：純合子病人CC：雜合子病人結果：2021/7/999鐮形細胞貧血原因：β-珠蛋白鏈第6位密碼子GAG→GTG，(二)大片段核苷酸丟失或插入的檢測1.中等長度(0.5-1.5kb)的DNA片段缺失或插入，可用一對引物的普通PCR檢測。2.若基因較大度(大于1.5kb)，且多個位點存在插入或缺失、位點間距離較遠，宜采用多重PCR法檢測。5’3’3’5’（多重PCR的引物設計示意圖）三、常見的基因異常及其檢測2021/7/9100(二)大片段核苷酸丟失或插入的檢測1.中等長度DMD基因定位于人類X染色體短臂Xp21.2上。位于該區(qū)的dystrophin(肌營養(yǎng)不良蛋白)基因的突變或部分缺失，是導致DMD的原發(fā)病因。

dystrophin基因中有9個易發(fā)生缺失的熱點區(qū)片段,它們分別位于外顯子4、8、12、17、19、44、45、48和51。杜氏肌營養(yǎng)不良癥(Duchennemusculardystrophy,

DMD)2021/7/9101DMD基因定位于人類X染色體短臂Xp21.2上。多重PCR法檢測中的基因突變同時用2對引物雙重擴增dystrophin基因外顯子17和48區(qū)域內的2個片段，可檢測出75％左右的基因缺失型患者；

若同時用9對引物多重擴增，則可以檢測到90％左右的基因缺失型患者。2021/7/9102多重PCR法檢測中的基因突變同時用2對引物雙重擴增d(三)基因重排的檢測基因從一條染色體的正常位置轉移到其他染色體的某個位置稱基因易位或重排。1.熒光原位雜交技術(FISH)。2.PCR擴增可用不同顏色的熒光標記DNA探針，可在染色體上定位基因或DNA片段及它們彼此間的排序。

前提條件是已知重排基因和位點的序列。三、常見的基因異常及其檢測2021/7/9103(三)基因重排的檢測基因從一條染色體的正常位熒光原位雜交（雙色FISH）2021/7/9104熒光原位雜交（雙色FISH）2021/7/946(四)基因擴增的檢測基因擴增指基因拷貝數(shù)增加的現(xiàn)象,可增加幾十到上千倍?？捎么郎y基因的DNA片段或cDNA片段為探針，基因組DNA采用適當?shù)南拗泼该盖泻笞鱏outhern印跡雜交分析。三、常見的基因異常及其檢測2021/7/9105