樣品前處理技術(shù)基礎(chǔ)理論課件

培訓(xùn)概要

樣品前處理的重要性及原則一樣品前處理一般性步驟二樣品前處理方法及比較三

固相萃取技術(shù)四培訓(xùn)概要樣品前處理的重要性及原則一樣品前處理一般

樣品前處理的重要性及原則一樣品前處理一般性步驟二樣品前處理方法及比較三

固相萃取技術(shù)四樣品前處理的重要性及原則一樣品前處理一般性步驟二樣品前處理的重要性重要性

樣品前處理在色譜分析過(guò)程中是一個(gè)既耗時(shí)又極易引進(jìn)誤差的步驟，樣品處理的好壞直接影響色譜分析的最終結(jié)果，因此，為了提高分析測(cè)定效率，改善和優(yōu)化色譜分析樣品制備方法和技術(shù)是一個(gè)重要問(wèn)題。由于食品樣品屬于復(fù)合基質(zhì)體系,多含有蛋白、油脂,碳水化合物、色素等成分,復(fù)雜的基質(zhì)背景會(huì)對(duì)被分析目標(biāo)化合物的提取、分離、凈化和測(cè)定等帶來(lái)很大的麻煩,因此食品的樣品前處理不僅復(fù)雜困難,而且對(duì)于分析結(jié)果的準(zhǔn)確可靠和靈敏具有決定性作用。樣品前處理的重要性重要性為何需要樣品前處理?色譜分析的誤差來(lái)源

為何需要樣品前處理?色譜分析的誤差來(lái)源為何需要樣品前處理?樣品前處理所消耗時(shí)間

為何需要樣品前處理?樣品前處理所消耗時(shí)間對(duì)于LC/MS/MS高靈敏度的儀器,適當(dāng)?shù)臉悠非疤幚韺?duì)于減少基質(zhì)干擾和富集組分至關(guān)重要！為何需要樣品前處理?60%以上的工作和費(fèi)用花費(fèi)在樣品前處理上

三個(gè)目的:

除去樣品基質(zhì)中的干擾物

富集組分

增強(qiáng)儀器的性能對(duì)于LC/MS/MS高靈敏度的儀器,適當(dāng)?shù)臉悠非疤幚韺?duì)于減樣品前處理原則原則①制備過(guò)程中避免組分發(fā)生化學(xué)變化；②要防止和避免欲測(cè)定組分的沾污；③盡可能減少無(wú)關(guān)化合物引入制備過(guò)程；④盡可能簡(jiǎn)單易行。樣品前處理原則

樣品前處理的重要性及原則一樣品前處理一般性步驟二樣品前處理方法及比較三

固相萃取技術(shù)四樣品前處理的重要性及原則一樣品前處理一般性步驟二樣品前樣品處理一般性步驟離心過(guò)濾液-液萃取

SPESPME……根據(jù)樣品類(lèi)別和被分析物的結(jié)構(gòu)、極性等理化性質(zhì)選擇合適的提取溶劑GCGC-MSHPLCLC-MSCE……提取凈化測(cè)定樣品處理一般性步驟離心根據(jù)樣品類(lèi)別和被分析物的結(jié)構(gòu)

樣品前處理的重要性及原則一樣品前處理方法及比較二樣品前處理方法及比較三

固相萃取技術(shù)四樣品前處理的重要性及原則一樣品前處理方法及比較二樣品預(yù)處理技術(shù)分析被測(cè)物在樣品基質(zhì)中提取樣品預(yù)處理技術(shù)分析被測(cè)物在樣品基質(zhì)中提取樣品預(yù)處理的目的除去微粒減少干擾雜質(zhì)濃縮微量的組份提高檢測(cè)的靈敏度及選擇性改善分離的效果有利于色譜柱及儀器的保護(hù)溶劑置換樣品預(yù)處理的目的除去微粒樣品的預(yù)處理重要性占樣品分析時(shí)間的比例樣品預(yù)處理所用時(shí)間遠(yuǎn)大于色譜分離的時(shí)間占分析的消耗總成本最大消耗大量的溶劑及其他化學(xué)品實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性及準(zhǔn)確性最差的環(huán)節(jié)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果好壞的最重要因素

是決定性的步驟樣品的預(yù)處理重要性占樣品分析時(shí)間的比例常見(jiàn)樣品前處理方法常見(jiàn)樣品前處理包括:液液萃取稀釋固相萃取離心過(guò)濾樣品前處理沉淀常見(jiàn)樣品前處理方法常見(jiàn)樣品前處理包括:液液萃取稀釋固相萃取離樣品前處理的各種方法方法 選擇性基礎(chǔ)沉淀 溶解度液—液萃取 樣品在兩相中的分配固相提取 樣品在吸附劑上的吸附與分配滲析/超濾 分子量與體積電泳 電荷/淌度蒸餾/蒸發(fā) 沸點(diǎn)與蒸氣壓樣品前處理的各種方法方法 選擇性基礎(chǔ)傳統(tǒng)的樣品前處理方式

液液萃取(LLE)根據(jù)分析物在互不相溶的兩相中的溶解度差異來(lái)將分析物從一相提取至另一相中。

裝置簡(jiǎn)單

操作容易

常被認(rèn)定為成本低廉費(fèi)時(shí)費(fèi)力常因乳化效益使相間分層不徹底，使得重復(fù)樣的分析結(jié)果存在顯著偏差(常在10%~20%之間)

若需萃取的樣品體積大（如環(huán)境分析中），則可能消耗大量的有機(jī)溶劑。由此可能在購(gòu)買(mǎi)、儲(chǔ)藏、處置溶劑時(shí)花費(fèi)龐大*。注:大量?jī)?chǔ)存、使用和處置溶劑可對(duì)操作者的長(zhǎng)期健康產(chǎn)生負(fù)面影響，并可帶來(lái)火災(zāi)隱患有機(jī)層水層傳統(tǒng)的樣品前處理方式

液液萃取(LLE)根據(jù)分析物在互不相傳統(tǒng)的樣品前處理方式

蛋白質(zhì)沉淀法(PPT)1-吸取200L血漿2-加入400-600l乙腈3-高速混合4-離心取上清液5-以水稀釋后進(jìn)樣在血清、血漿或尿樣中加入有機(jī)溶劑，使樣品中的蛋白質(zhì)沉淀，然后經(jīng)離心去除

簡(jiǎn)單快速可被自動(dòng)化，適用于高通量分析若檢測(cè)限要求不高時(shí)較適用屬快速但粗糙的凈化技術(shù)，僅可去除約90-95%的蛋白質(zhì)，而基質(zhì)中的高鹽份和其他內(nèi)源性干擾物如磷脂等完全未被去除（此為L(zhǎng)C/MS分析時(shí)遭遇離子抑制的根源!）分析柱壽命較短，LC/MS系統(tǒng)常需停機(jī)進(jìn)行離子源清洗導(dǎo)致樣品稀釋,不適合用于超痕量分析場(chǎng)合進(jìn)樣前可能需要進(jìn)行溶劑蒸發(fā)以獲得足夠的靈敏度(若無(wú)內(nèi)標(biāo)，分析重現(xiàn)性不佳)傳統(tǒng)的樣品前處理方式

蛋白質(zhì)沉淀法(PPT)1-吸取20固相萃取技術(shù)(SPE)

先進(jìn)的樣品前處理方法可同時(shí)取得對(duì)樣品的凈化與富集效果，徹底去除干擾物并濃縮樣品分析結(jié)果呈高度可靠性使得檢測(cè)靈敏度和選擇性大大提高明顯延長(zhǎng)色譜柱壽命，減小系統(tǒng)維修的頻度樣品制備快速、涉及人工少、溶劑用量少分析結(jié)果的精密度提高(偏差常<5%)

多樣化的產(chǎn)品設(shè)計(jì)迎合不同樣品通量要求

依據(jù)目標(biāo)化合物在固定相和流動(dòng)相間分配系數(shù)的不同將其從液相提取至固定相中（本質(zhì)上為色譜分離方法）固相萃取技術(shù)(SPE)

先進(jìn)的樣品前處理方法可同時(shí)取得對(duì)

樣品前處理的重要性及原則一樣品前處理方法及比較二

樣品前處理一般性步驟三

固相萃取技術(shù)四樣品前處理的重要性及原則一樣品前處理方法及比較二概念

固相提?。⊿olidPhaseExtraction，SPE)是一種重要的樣品前處理技術(shù)，由液固萃取和柱液相色譜技術(shù)相結(jié)合發(fā)展起來(lái)的。利用固相吸附劑將液體樣品中的目標(biāo)化合物吸附，與樣品的基體和干擾化合物分離，然后再用洗脫液洗脫，達(dá)到分離和和富集的目的。概念原理及特點(diǎn)利用雜質(zhì)或目標(biāo)化合物與樣品基體溶劑和吸附劑之間親和力的相對(duì)大小差異實(shí)現(xiàn)凈化分離。與傳統(tǒng)的液液萃取相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)。特點(diǎn)回收率、富集倍數(shù)高有毒溶劑用量少兩相分離操作簡(jiǎn)單、易自動(dòng)化更有效的是分析物與雜質(zhì)分離原理及特點(diǎn)利用雜質(zhì)或目標(biāo)化合物與樣品基體溶劑和吸附應(yīng)用領(lǐng)域已被廣泛的應(yīng)用于：化學(xué)、化工行業(yè)制藥行業(yè)臨床醫(yī)學(xué)研究食品安全領(lǐng)域煙草行業(yè)環(huán)境保護(hù)中草藥研究……應(yīng)用領(lǐng)域已被廣泛的應(yīng)用于：固相提取技術(shù)

SolidPhaseExtraction(SPE)色譜填料顆粒填裝小柱1978年由Waters首次推出商品化產(chǎn)品：“Sep-PakCartridges”SampleEnrichment&Purification非常成熟的技術(shù)數(shù)千化合物的參考文獻(xiàn)洗脫劑廢液0.01to1000克多種規(guī)格固相提取技術(shù)

SolidPhaseExtraction梨的色譜分析：SPE的作用

不同提取過(guò)程的結(jié)果比較乙腈提取未凈化乙腈提取用水稀釋Oasis?HLB提取乙腈提取用水稀釋Oasis?HLB提取用Sep-Pak?氨基小柱凈化?1999WatersCorp.梨的色譜分析：SPE的作用

不同提取過(guò)程的結(jié)果比較乙腈提取乙固相提取技術(shù)

SolidPhaseExtraction(SPE)兩相——液相與固相容易分離多種吸附劑可供選擇反相－最常用！正相離子交換具有高選擇性的新型吸附劑溶劑消耗少—與液液提取相比減少人力與時(shí)間—容易自動(dòng)化液相色譜基礎(chǔ)固相提取技術(shù)

SolidPhaseExtractionHPLC與SPE之區(qū)別HPLCSPE顆粒直徑~5μm40-80μm柱床效率

high

low柱外體積

low

high柱長(zhǎng)5-30cm~1cm塔板數(shù)(N)~10,000<50Bottomline:HPLCcanseparatesimilarcompounds.SPErequiresasignificantselectivitydifferencebetweencompoundsforseparation.CompoundsnotwellresolvedbyHPLCcannotbeseparatedbySPEwithasimilarretentionmechanism.HPLC與SPE之區(qū)別HPLCSPE顆粒直徑~5μm40分離效率比較-HPLC與SPE00.810510152000.8105101520Elutionvolume(mL)Normalizedconcentration分離效率比較-HPLC與SPE00.8常見(jiàn)固相提取小柱的構(gòu)造色譜柱床(吸附劑)柱體過(guò)濾膜/篩板插口/出液口常見(jiàn)固相提取小柱的構(gòu)造色譜柱床(吸附劑)柱體過(guò)濾膜/SPE產(chǎn)品常見(jiàn)形式

萃取小柱:小柱體積1~35ml,吸附劑重量10mg~6g

為中等數(shù)量樣品設(shè)計(jì)食品安全、環(huán)境分析和研究實(shí)驗(yàn)室

96-孔板:吸附劑重量2~60mg

為高通量分析設(shè)計(jì)（DMPK/BA/BE實(shí)驗(yàn)室）

μElution板用于微量樣品和高靈敏度分析在線SPE凈化柱:

柱芯式(需SentryGuard套件)和標(biāo)準(zhǔn)柱由切換閥和軟件控制，無(wú)需人工操作SPE產(chǎn)品常見(jiàn)形式萃取小柱:96-孔板:在線SPE凈化柱固相提取技術(shù)的基本要求樣品必須呈液態(tài)驅(qū)動(dòng)力(DrivingForces)－操作方式重力壓力真空固相提取技術(shù)的基本要求樣品必須呈液態(tài)SPE技術(shù)的驅(qū)動(dòng)力：重力重力SPE技術(shù)的驅(qū)動(dòng)力：重力重力SPE技術(shù)的驅(qū)動(dòng)力：壓力壓力SPE技術(shù)的驅(qū)動(dòng)力：壓力壓力SPE技術(shù)的驅(qū)動(dòng)力：壓力注射器接頭—adaptor提取小柱壓力SPE技術(shù)的驅(qū)動(dòng)力：壓力注射器接頭—adaptor提取小柱ResevoirwithAdapterSPE技術(shù)的驅(qū)動(dòng)力：真空ResevoirSPE技術(shù)的驅(qū)動(dòng)力：真空SPE技術(shù)—填料顆?；|(zhì)硅膠基質(zhì)—鍵合各種官能團(tuán)如，{C18,C8,NH2,QMA...}不規(guī)則填料小柱(Cartridges)：40-80mDisks：8-10m活性碳(AC2)表面衍生劑涂層(DNPH)聚合物基質(zhì)(最新技術(shù))—Oasis球形填料30/60mSPE技術(shù)—填料顆粒基質(zhì)硅膠基質(zhì)—鍵合各種官能團(tuán)SPE填料的類(lèi)型正相填料溶劑：正己烷填料：硅膠（Silica）氧化鋁,Florisil?,氨基,二醇基,……反相填料溶劑：MeOH/水填料：C18/C8/OasisHLB離子交換填料溶劑：緩沖液/鹽流動(dòng)相填料：AccellCM/AccellQMA/OasisMCX/MAX/WAX/WCXSPE填料的類(lèi)型正相填料SPE各種填料固定相官能團(tuán)C18–Si(CH3)2C18H37

tC18–SiC18H37

C8–Si(CH3)2C8H17

tC2–SiC2H5PorapakRDX-divinylbenzene/vinylpyrrolidoneAminopropyl–Si(CH2)3NH2Cyanopropyl–Si(CH3)2(CH2)3CNDiol–Si(CH2)3OCH2CH(OH)CH2OHAccellPlusCM–COO2–Na+AccellPlusQMA-–C(O)NH(CH2)3N(CH3)+Cl–DNPH-dinitrophenylhydrazineOasisHLBOasisMCXOasisMAXOasisWCX,WAX-divinylbenzene/vinylpyrrolidone-divinylbenzene/vinylpyrrolidone+SO3H-divinylbenzene/vinylpyrrolidone+CH2N+R3Cl-SilicaFlorisilAlumina正相反相Sep-Pak系列Oasis系列SPE各種填料固定相官能團(tuán)C18–Si(CH3)2C18H3分離模式反相正相離子交換復(fù)合模式分離模式反相分離模式反相萃?。O性液體相，非極性改良固體相）疏水性相互作用非極性—非極性相互作用范德華力或色散力

硅膠鍵合C18,C8,C4，C2,-苯基等，可以從強(qiáng)極性的溶劑中吸附是非極性到中等極性的化合物。分離模式反相萃取分離模式正相萃?。ǚ菢O性液體相，極性改良固體相）親水性相互作用極性—極性相互作用氫鍵π-π相互作用偶極－偶極相互作用偶極－誘導(dǎo)偶極相互作用

極性鍵合相，如硅膠鍵合－NH2、－CN，-Diol（二醇基）；極性吸附劑，如Silica、Florisil、(A-,N-,B-)alumina、硅藻土等，可以從強(qiáng)極性的溶劑中吸附是非極性到中等極性的化合物。分離模式正相萃取正相溶劑洗脫強(qiáng)度己烷異辛烷四氯化碳氯仿二氯甲烷四氫呋喃乙醚乙酸乙酯丙酮乙腈異丙醇甲醇水溶劑極性圖反相溶劑洗脫強(qiáng)度正相溶劑洗脫強(qiáng)度己烷溶劑極性圖反相溶劑洗脫強(qiáng)度分離模式離子交換

帶有電荷的化合物靠靜電吸引到帶有電荷的吸附劑表面按鍵合的離子基團(tuán)的性質(zhì)分類(lèi)： 陽(yáng)離子交換柱 陰離子交換柱按在水溶液中解離的程度：

強(qiáng)酸性(SCX,Strongcationexchange) 弱酸性(WCX,Weakcationexchange) 強(qiáng)堿性(SAX,Stronganionexchange) 弱堿性(WAX,Weakanionexchange)分離模式離子交換分離模式反相吸附原理離子交換原理復(fù)合模式分離模式反相吸附原理復(fù)合模式Oasis?

系列固相萃取吸附劑的演變:

從純反相保留模式到復(fù)合保留模式(IE+RP)

NOOasis?HLBWaterwettableStableacrosspH1-14NosilanolinteractionsHydrophilicRetentionofPolarsLipophilicRPRetentionNOSO3-Oasis?MCXpKa<<11meq/gOasis?WAXNONNNNHHH++HpKa~60.6meq/gNOCH2N-C4H9CH3CH3+Oasis?MAXpKa>180.25meq/gNOCOOHOasis?WCXpKa~50.75meq/gCOO-+H+Oasis?系列固相萃取吸附劑的演變:

從純反相保留模式到OHNCH3CH3普萘洛爾HH+反相作用強(qiáng)陽(yáng)離子交換作用（堿性藥物）MCX吸附劑NOSO-3SO-3MixedModeCationeXchangerOasis?MCX吸附劑上堿性化合物的作用模式:Mixed-ModeCationic-eXchanger

pKa<<1OHNCH3CH3普萘洛爾HH+反相作用強(qiáng)陽(yáng)離子交換作OasisMCXSPE吸附劑凈化和富集堿性化合物的強(qiáng)有力工具pH02468101214k’Acids(HA)NeutralBases(BH+)A-B清洗2:100%MeOH(強(qiáng)烈清洗)樣品預(yù)處理活化/平衡:MeOH/Water上樣清洗1:2%甲酸水溶液(目標(biāo)鎖定)洗脫:2%NH4OH-MeOH(目標(biāo)釋放)溶劑蒸發(fā)/重新定容(選項(xiàng))(OasisMCX在所有pH下均帶負(fù)電)OasisMCXSPE吸附劑pH02468101214O對(duì)乙酰氨基酚反相作用強(qiáng)陰離子交換作用（酸性藥物）MAX吸附劑NO-OHNOCH3CH2N(R3)Cl-CH2N(R3)Cl-++QuatenaryamineOasis?MAX吸附劑上酸性化合物的作用模式:Mixed-ModeAnionic-eXchangerpKa>18O對(duì)乙酰氨基酚反相作用強(qiáng)陰離子交換作用（酸性藥物）MAXOasisMAXSPE吸附劑凈化和富集酸性性化合物的強(qiáng)有力工具pH02468101214k’Acids(HA)NeutralBases(BH+)A-B清洗2:100%MeOH(強(qiáng)烈清洗)樣品預(yù)處理活化/平衡:MeOH/Water上樣清洗1:2%氨水(目標(biāo)鎖定)洗脫:2%甲酸-MeOH(目標(biāo)釋放)溶劑蒸發(fā)/重新定容(選項(xiàng))(OasisMAX在所有pH下均帶正電)OasisMAXSPE吸附劑pH02468101214若想在OasisMCX/MAX吸附劑上凈化和富集永久性帶電的物質(zhì)

(如季銨堿及其鹽，有機(jī)磺酸及其鹽，有機(jī)膦酸及其鹽)，能否成功?！若想在OasisMCX/MAX吸附劑上凈化和富集永久性帶電永久性帶電分析物帶來(lái)的挑戰(zhàn)…k’Acids(HA)NeutralQ.Base(Q+)A-Q.Base(Q+)帶永久性正電的季銨鹽在OasisMCX上時(shí)…pHk’NeutralBases(BH+)BRSO3-

帶永久性負(fù)電的有機(jī)磺酸鹽在OasisMAX上時(shí)…Bases(BH+)BA-Acids(HA)RSO3-永久性帶電分析物帶來(lái)的挑戰(zhàn)…k’Acids(HA)NeutOasis?WCX&Oasis?WAX(2004)專(zhuān)為永久性帶電分析物所設(shè)計(jì)的吸附劑

Oasis?WCX:MixedModeWeakCationicExchanger

Oasis?WAX:MixedModeWeakAnionicExchanger

Oasis?WCX&Oasis?WAX(2004)陽(yáng)離子交換作用反相作用

戊沙溴銨

（季銨鹽）NOCOO-COO-季銨鹽在Oasis?WCX吸附劑上的作用模式羧酸的pKa5pH3吸附劑為電中性狀態(tài)pH7吸附劑呈完全負(fù)電狀態(tài)

OasisWCXMixed-Mode

WeakCationeXchanger陽(yáng)離子交換作用反相作用戊沙溴銨NOCOO-COOOasisWCXSPE吸附劑凈化和富集季銨鹽和堿的最佳工具pH02468101214k’NeutralBases(BH+)Q+BQ+WCX帶負(fù)電WCX不帶電Acids(HA)A-清洗2:100%MeOH(強(qiáng)烈清洗)樣品預(yù)處理活化/平衡:MeOH/Water上樣清洗1:2%氨水(目標(biāo)鎖定)洗脫:2%甲酸-MeOH(目標(biāo)釋放)溶劑蒸發(fā)/重新定容(選項(xiàng))OasisWCXSPE吸附劑pH02468101214WAXsorbentMixed-Mode

WeakAnioneXchanger陰離子交換作用反相作用哌嗪基團(tuán)的pKa6pH>8

吸附劑為電中性狀態(tài)pH<4吸附劑呈完全正電狀態(tài)磺酸鹽

(StronglyAcids)有機(jī)磺酸鹽在Oasis?WAX吸附劑上的作用模式WAXsorbentMixed-ModeWeakAniOasisWAXSPE吸附劑凈化和富集磺酸鹽、磷酸鹽的最佳工具pH02468101214k’NeutralBases(BH+)RSO3-BWAX不帶電WAX帶正電Acids(HA)A-RSO3-清洗2:100%MeOH(強(qiáng)烈清洗)樣品預(yù)處理活化/平衡:MeOH/Water上樣清洗1:2%甲酸(目標(biāo)鎖定)洗脫:2%NH4OH-MeOH(目標(biāo)釋放)溶劑蒸發(fā)/重新定容(選項(xiàng))OasisWAXSPE吸附劑pH02468101214固相提取技術(shù)的色譜基礎(chǔ)液相色譜如何實(shí)現(xiàn)分離？固定相被測(cè)物A被測(cè)物B流動(dòng)相BA固相提取技術(shù)的色譜基礎(chǔ)液相色譜如何實(shí)現(xiàn)分離？固定相被測(cè)物A如何在反相色譜條件下獲得保留？弱極性—非極性固定相（吸附劑）弱極性—非極性被測(cè)物A極性被測(cè)物B水溶性--極性流動(dòng)相C18-SilicaOasisHLB如何在反相色譜條件下獲得保留？弱極性—非極性弱極性—固相提取過(guò)程的一般步驟活化及平衡上樣清洗(可選步驟)洗脫被測(cè)組分以O(shè)asisHLB反相提取為例甲醇和水 樣品水溶液 5%甲醇水溶液 甲醇固相提取過(guò)程的一般步驟活化及平衡上樣清洗(可選步驟)洗脫被測(cè)一般性分析操作步驟活化:依次用強(qiáng)溶劑、弱溶劑（緩沖溶液）進(jìn)行活化；上樣：用能夠溶解樣品的弱溶劑攜帶樣品上柱，既要保證樣品分析物的有效溶解，又要確保溶劑強(qiáng)度不至于把被分析化合物從柱上洗脫下來(lái)；淋洗：用具有一定強(qiáng)度的混合溶劑淋洗去除干擾雜質(zhì)，確保雜質(zhì)被洗脫，而被分析化合物有效的保留在柱上；洗脫：用較強(qiáng)的溶劑把被分析化合物從柱上替換洗脫下來(lái)。一般性分析操作步驟活化:依次用強(qiáng)溶劑、弱溶劑（緩沖溶液）進(jìn)行SPE技術(shù)對(duì)流速的一般要求活化及平衡 5-10mL/min上樣 0.5-5mL/min-液流不能成線清洗 1-5mL/min洗脫 0.5-5mL/min-液流不能成線與SPE產(chǎn)品的規(guī)格及色譜類(lèi)型有關(guān)SPE技術(shù)對(duì)流速的一般要求活化及平衡 5-10mL/凈化條件的確定：根據(jù)化合物理化性質(zhì)選擇使用的SPE類(lèi)型制作化合物凈化洗脫曲線，強(qiáng)溶劑-弱溶劑以不同比例，由弱強(qiáng)逐漸增加洗脫強(qiáng)度，通過(guò)儀器測(cè)定的回收率來(lái)確定最佳的淋洗和洗脫溶劑組成和比例在確定的洗脫溶劑比例條件下，進(jìn)一步優(yōu)化洗脫體積。凈化條件的確定：SPE使用注意事項(xiàng)及關(guān)鍵控制點(diǎn)

根據(jù)分析目標(biāo)物的理化性質(zhì)選擇合適的SPE柱；一般SPE柱要防止干涸；注意控制柱載量，防止穿透過(guò)載；嚴(yán)格控制上樣液和洗脫液滴速；防止混濁樣品堵塞柱子；．．．．．．SPE使用注意事項(xiàng)及關(guān)鍵控制點(diǎn)培訓(xùn)概要

樣品前處理的重要性及原則一樣品前處理一般性步驟二樣品前處理方法及比較三

固相萃取技術(shù)四培訓(xùn)概要樣品前處理的重要性及原則一樣品前處理一般

樣品前處理的重要性及原則一樣品前處理一般性步驟二樣品前處理方法及比較三

固相萃取技術(shù)四樣品前處理的重要性及原則一樣品前處理一般性步驟二樣品前處理的重要性重要性

樣品前處理在色譜分析過(guò)程中是一個(gè)既耗時(shí)又極易引進(jìn)誤差的步驟，樣品處理的好壞直接影響色譜分析的最終結(jié)果，因此，為了提高分析測(cè)定效率，改善和優(yōu)化色譜分析樣品制備方法和技術(shù)是一個(gè)重要問(wèn)題。由于食品樣品屬于復(fù)合基質(zhì)體系,多含有蛋白、油脂,碳水化合物、色素等成分,復(fù)雜的基質(zhì)背景會(huì)對(duì)被分析目標(biāo)化合物的提取、分離、凈化和測(cè)定等帶來(lái)很大的麻煩,因此食品的樣品前處理不僅復(fù)雜困難,而且對(duì)于分析結(jié)果的準(zhǔn)確可靠和靈敏具有決定性作用。樣品前處理的重要性重要性為何需要樣品前處理?色譜分析的誤差來(lái)源

為何需要樣品前處理?色譜分析的誤差來(lái)源為何需要樣品前處理?樣品前處理所消耗時(shí)間

為何需要樣品前處理?樣品前處理所消耗時(shí)間對(duì)于LC/MS/MS高靈敏度的儀器,適當(dāng)?shù)臉悠非疤幚韺?duì)于減少基質(zhì)干擾和富集組分至關(guān)重要！為何需要樣品前處理?60%以上的工作和費(fèi)用花費(fèi)在樣品前處理上

三個(gè)目的:

除去樣品基質(zhì)中的干擾物

富集組分

增強(qiáng)儀器的性能對(duì)于LC/MS/MS高靈敏度的儀器,適當(dāng)?shù)臉悠非疤幚韺?duì)于減樣品前處理原則原則①制備過(guò)程中避免組分發(fā)生化學(xué)變化；②要防止和避免欲測(cè)定組分的沾污；③盡可能減少無(wú)關(guān)化合物引入制備過(guò)程；④盡可能簡(jiǎn)單易行。樣品前處理原則

樣品前處理的重要性及原則一樣品前處理一般性步驟二樣品前處理方法及比較三

固相萃取技術(shù)四樣品前處理的重要性及原則一樣品前處理一般性步驟二樣品前樣品處理一般性步驟離心過(guò)濾液-液萃取

SPESPME……根據(jù)樣品類(lèi)別和被分析物的結(jié)構(gòu)、極性等理化性質(zhì)選擇合適的提取溶劑GCGC-MSHPLCLC-MSCE……提取凈化測(cè)定樣品處理一般性步驟離心根據(jù)樣品類(lèi)別和被分析物的結(jié)構(gòu)

樣品前處理的重要性及原則一樣品前處理方法及比較二樣品前處理方法及比較三

固相萃取技術(shù)四樣品前處理的重要性及原則一樣品前處理方法及比較二樣品預(yù)處理技術(shù)分析被測(cè)物在樣品基質(zhì)中提取樣品預(yù)處理技術(shù)分析被測(cè)物在樣品基質(zhì)中提取樣品預(yù)處理的目的除去微粒減少干擾雜質(zhì)濃縮微量的組份提高檢測(cè)的靈敏度及選擇性改善分離的效果有利于色譜柱及儀器的保護(hù)溶劑置換樣品預(yù)處理的目的除去微粒樣品的預(yù)處理重要性占樣品分析時(shí)間的比例樣品預(yù)處理所用時(shí)間遠(yuǎn)大于色譜分離的時(shí)間占分析的消耗總成本最大消耗大量的溶劑及其他化學(xué)品實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性及準(zhǔn)確性最差的環(huán)節(jié)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果好壞的最重要因素

是決定性的步驟樣品的預(yù)處理重要性占樣品分析時(shí)間的比例常見(jiàn)樣品前處理方法常見(jiàn)樣品前處理包括:液液萃取稀釋固相萃取離心過(guò)濾樣品前處理沉淀常見(jiàn)樣品前處理方法常見(jiàn)樣品前處理包括:液液萃取稀釋固相萃取離樣品前處理的各種方法方法 選擇性基礎(chǔ)沉淀 溶解度液—液萃取 樣品在兩相中的分配固相提取 樣品在吸附劑上的吸附與分配滲析/超濾 分子量與體積電泳 電荷/淌度蒸餾/蒸發(fā) 沸點(diǎn)與蒸氣壓樣品前處理的各種方法方法 選擇性基礎(chǔ)傳統(tǒng)的樣品前處理方式

液液萃取(LLE)根據(jù)分析物在互不相溶的兩相中的溶解度差異來(lái)將分析物從一相提取至另一相中。

裝置簡(jiǎn)單

操作容易

常被認(rèn)定為成本低廉費(fèi)時(shí)費(fèi)力常因乳化效益使相間分層不徹底，使得重復(fù)樣的分析結(jié)果存在顯著偏差(常在10%~20%之間)

若需萃取的樣品體積大（如環(huán)境分析中），則可能消耗大量的有機(jī)溶劑。由此可能在購(gòu)買(mǎi)、儲(chǔ)藏、處置溶劑時(shí)花費(fèi)龐大*。注:大量?jī)?chǔ)存、使用和處置溶劑可對(duì)操作者的長(zhǎng)期健康產(chǎn)生負(fù)面影響，并可帶來(lái)火災(zāi)隱患有機(jī)層水層傳統(tǒng)的樣品前處理方式

液液萃取(LLE)根據(jù)分析物在互不相傳統(tǒng)的樣品前處理方式

蛋白質(zhì)沉淀法(PPT)1-吸取200L血漿2-加入400-600l乙腈3-高速混合4-離心取上清液5-以水稀釋后進(jìn)樣在血清、血漿或尿樣中加入有機(jī)溶劑，使樣品中的蛋白質(zhì)沉淀，然后經(jīng)離心去除

簡(jiǎn)單快速可被自動(dòng)化，適用于高通量分析若檢測(cè)限要求不高時(shí)較適用屬快速但粗糙的凈化技術(shù)，僅可去除約90-95%的蛋白質(zhì)，而基質(zhì)中的高鹽份和其他內(nèi)源性干擾物如磷脂等完全未被去除（此為L(zhǎng)C/MS分析時(shí)遭遇離子抑制的根源!）分析柱壽命較短，LC/MS系統(tǒng)常需停機(jī)進(jìn)行離子源清洗導(dǎo)致樣品稀釋,不適合用于超痕量分析場(chǎng)合進(jìn)樣前可能需要進(jìn)行溶劑蒸發(fā)以獲得足夠的靈敏度(若無(wú)內(nèi)標(biāo)，分析重現(xiàn)性不佳)傳統(tǒng)的樣品前處理方式

蛋白質(zhì)沉淀法(PPT)1-吸取20固相萃取技術(shù)(SPE)

先進(jìn)的樣品前處理方法可同時(shí)取得對(duì)樣品的凈化與富集效果，徹底去除干擾物并濃縮樣品分析結(jié)果呈高度可靠性使得檢測(cè)靈敏度和選擇性大大提高明顯延長(zhǎng)色譜柱壽命，減小系統(tǒng)維修的頻度樣品制備快速、涉及人工少、溶劑用量少分析結(jié)果的精密度提高(偏差常<5%)

多樣化的產(chǎn)品設(shè)計(jì)迎合不同樣品通量要求

依據(jù)目標(biāo)化合物在固定相和流動(dòng)相間分配系數(shù)的不同將其從液相提取至固定相中（本質(zhì)上為色譜分離方法）固相萃取技術(shù)(SPE)

先進(jìn)的樣品前處理方法可同時(shí)取得對(duì)

樣品前處理的重要性及原則一樣品前處理方法及比較二

樣品前處理一般性步驟三

固相萃取技術(shù)四樣品前處理的重要性及原則一樣品前處理方法及比較二概念

固相提?。⊿olidPhaseExtraction，SPE)是一種重要的樣品前處理技術(shù)，由液固萃取和柱液相色譜技術(shù)相結(jié)合發(fā)展起來(lái)的。利用固相吸附劑將液體樣品中的目標(biāo)化合物吸附，與樣品的基體和干擾化合物分離，然后再用洗脫液洗脫，達(dá)到分離和和富集的目的。概念原理及特點(diǎn)利用雜質(zhì)或目標(biāo)化合物與樣品基體溶劑和吸附劑之間親和力的相對(duì)大小差異實(shí)現(xiàn)凈化分離。與傳統(tǒng)的液液萃取相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)。特點(diǎn)回收率、富集倍數(shù)高有毒溶劑用量少兩相分離操作簡(jiǎn)單、易自動(dòng)化更有效的是分析物與雜質(zhì)分離原理及特點(diǎn)利用雜質(zhì)或目標(biāo)化合物與樣品基體溶劑和吸附應(yīng)用領(lǐng)域已被廣泛的應(yīng)用于：化學(xué)、化工行業(yè)制藥行業(yè)臨床醫(yī)學(xué)研究食品安全領(lǐng)域煙草行業(yè)環(huán)境保護(hù)中草藥研究……應(yīng)用領(lǐng)域已被廣泛的應(yīng)用于：固相提取技術(shù)

SolidPhaseExtraction(SPE)色譜填料顆粒填裝小柱1978年由Waters首次推出商品化產(chǎn)品：“Sep-PakCartridges”SampleEnrichment&Purification非常成熟的技術(shù)數(shù)千化合物的參考文獻(xiàn)洗脫劑廢液0.01to1000克多種規(guī)格固相提取技術(shù)

SolidPhaseExtraction梨的色譜分析：SPE的作用

不同提取過(guò)程的結(jié)果比較乙腈提取未凈化乙腈提取用水稀釋Oasis?HLB提取乙腈提取用水稀釋Oasis?HLB提取用Sep-Pak?氨基小柱凈化?1999WatersCorp.梨的色譜分析：SPE的作用

不同提取過(guò)程的結(jié)果比較乙腈提取乙固相提取技術(shù)

SolidPhaseExtraction(SPE)兩相——液相與固相容易分離多種吸附劑可供選擇反相－最常用！正相離子交換具有高選擇性的新型吸附劑溶劑消耗少—與液液提取相比減少人力與時(shí)間—容易自動(dòng)化液相色譜基礎(chǔ)固相提取技術(shù)

SolidPhaseExtractionHPLC與SPE之區(qū)別HPLCSPE顆粒直徑~5μm40-80μm柱床效率

high

low柱外體積

low

high柱長(zhǎng)5-30cm~1cm塔板數(shù)(N)~10,000<50Bottomline:HPLCcanseparatesimilarcompounds.SPErequiresasignificantselectivitydifferencebetweencompoundsforseparation.CompoundsnotwellresolvedbyHPLCcannotbeseparatedbySPEwithasimilarretentionmechanism.HPLC與SPE之區(qū)別HPLCSPE顆粒直徑~5μm40分離效率比較-HPLC與SPE00.810510152000.8105101520Elutionvolume(mL)Normalizedconcentration分離效率比較-HPLC與SPE00.8常見(jiàn)固相提取小柱的構(gòu)造色譜柱床(吸附劑)柱體過(guò)濾膜/篩板插口/出液口常見(jiàn)固相提取小柱的構(gòu)造色譜柱床(吸附劑)柱體過(guò)濾膜/SPE產(chǎn)品常見(jiàn)形式

萃取小柱:小柱體積1~35ml,吸附劑重量10mg~6g

為中等數(shù)量樣品設(shè)計(jì)食品安全、環(huán)境分析和研究實(shí)驗(yàn)室

96-孔板:吸附劑重量2~60mg

為高通量分析設(shè)計(jì)（DMPK/BA/BE實(shí)驗(yàn)室）

μElution板用于微量樣品和高靈敏度分析在線SPE凈化柱:

柱芯式(需SentryGuard套件)和標(biāo)準(zhǔn)柱由切換閥和軟件控制，無(wú)需人工操作SPE產(chǎn)品常見(jiàn)形式萃取小柱:96-孔板:在線SPE凈化柱固相提取技術(shù)的基本要求樣品必須呈液態(tài)驅(qū)動(dòng)力(DrivingForces)－操作方式重力壓力真空固相提取技術(shù)的基本要求樣品必須呈液態(tài)SPE技術(shù)的驅(qū)動(dòng)力：重力重力SPE技術(shù)的驅(qū)動(dòng)力：重力重力SPE技術(shù)的驅(qū)動(dòng)力：壓力壓力SPE技術(shù)的驅(qū)動(dòng)力：壓力壓力SPE技術(shù)的驅(qū)動(dòng)力：壓力注射器接頭—adaptor提取小柱壓力SPE技術(shù)的驅(qū)動(dòng)力：壓力注射器接頭—adaptor提取小柱ResevoirwithAdapterSPE技術(shù)的驅(qū)動(dòng)力：真空ResevoirSPE技術(shù)的驅(qū)動(dòng)力：真空SPE技術(shù)—填料顆?；|(zhì)硅膠基質(zhì)—鍵合各種官能團(tuán)如，{C18,C8,NH2,QMA...}不規(guī)則填料小柱(Cartridges)：40-80mDisks：8-10m活性碳(AC2)表面衍生劑涂層(DNPH)聚合物基質(zhì)(最新技術(shù))—Oasis球形填料30/60mSPE技術(shù)—填料顆粒基質(zhì)硅膠基質(zhì)—鍵合各種官能團(tuán)SPE填料的類(lèi)型正相填料溶劑：正己烷填料：硅膠（Silica）氧化鋁,Florisil?,氨基,二醇基,……反相填料溶劑：MeOH/水填料：C18/C8/OasisHLB離子交換填料溶劑：緩沖液/鹽流動(dòng)相填料：AccellCM/AccellQMA/OasisMCX/MAX/WAX/WCXSPE填料的類(lèi)型正相填料SPE各種填料固定相官能團(tuán)C18–Si(CH3)2C18H37

tC18–SiC18H37

C8–Si(CH3)2C8H17

tC2–SiC2H5PorapakRDX-divinylbenzene/vinylpyrrolidoneAminopropyl–Si(CH2)3NH2Cyanopropyl–Si(CH3)2(CH2)3CNDiol–Si(CH2)3OCH2CH(OH)CH2OHAccellPlusCM–COO2–Na+AccellPlusQMA-–C(O)NH(CH2)3N(CH3)+Cl–DNPH-dinitrophenylhydrazineOasisHLBOasisMCXOasisMAXOasisWCX,WAX-divinylbenzene/vinylpyrrolidone-divinylbenzene/vinylpyrrolidone+SO3H-divinylbenzene/vinylpyrrolidone+CH2N+R3Cl-SilicaFlorisilAlumina正相反相Sep-Pak系列Oasis系列SPE各種填料固定相官能團(tuán)C18–Si(CH3)2C18H3分離模式反相正相離子交換復(fù)合模式分離模式反相分離模式反相萃?。O性液體相，非極性改良固體相）疏水性相互作用非極性—非極性相互作用范德華力或色散力

硅膠鍵合C18,C8,C4，C2,-苯基等，可以從強(qiáng)極性的溶劑中吸附是非極性到中等極性的化合物。分離模式反相萃取分離模式正相萃?。ǚ菢O性液體相，極性改良固體相）親水性相互作用極性—極性相互作用氫鍵π-π相互作用偶極－偶極相互作用偶極－誘導(dǎo)偶極相互作用

極性鍵合相，如硅膠鍵合－NH2、－CN，-Diol（二醇基）；極性吸附劑，如Silica、Florisil、(A-,N-,B-)alumina、硅藻土等，可以從強(qiáng)極性的溶劑中吸附是非極性到中等極性的化合物。分離模式正相萃取正相溶劑洗脫強(qiáng)度己烷異辛烷四氯化碳氯仿二氯甲烷四氫呋喃乙醚乙酸乙酯丙酮乙腈異丙醇甲醇水溶劑極性圖反相溶劑洗脫強(qiáng)度正相溶劑洗脫強(qiáng)度己烷溶劑極性圖反相溶劑洗脫強(qiáng)度分離模式離子交換

帶有電荷的化合物靠靜電吸引到帶有電荷的吸附劑表面按鍵合的離子基團(tuán)的性質(zhì)分類(lèi)： 陽(yáng)離子交換柱 陰離子交換柱按在水溶液中解離的程度：

強(qiáng)酸性(SCX,Strongcationexchange) 弱酸性(WCX,Weakcationexchange) 強(qiáng)堿性(SAX,Stronganionexchange) 弱堿性(WAX,Weakanionexchange)分離模式離子交換分離模式反相吸附原理離子交換原理復(fù)合模式分離模式反相吸附原理復(fù)合模式Oasis?

系列固相萃取吸附劑的演變:

從純反相保留模式到復(fù)合保留模式(IE+RP)

NOOasis?HLBWaterwettableStableacrosspH1-14NosilanolinteractionsHydrophilicRetentionofPolarsLipophilicRPRetentionNOSO3-Oasis?MCXpKa<<11meq/gOasis?WAXNONNNNHHH++HpKa~60.6meq/gNOCH2N-C4H9CH3CH3+Oasis?MAXpKa>180.25meq/gNOCOOHOasis?WCXpKa~50.75meq/gCOO-+H+Oasis?系列固相萃取吸附劑的演變:

從純反相保留模式到OHNCH3CH3普萘洛爾HH+反相作用強(qiáng)陽(yáng)離子交換作用（堿性藥物）MCX吸附劑NOSO-3SO-3MixedModeCationeXchangerOasis?MCX吸附劑上堿性化合物的作用模式:Mixed-ModeCationic-eXchanger

pKa<<1OHNCH3CH3普萘洛爾HH+反相作用強(qiáng)陽(yáng)離子交換作OasisMCXSPE吸附劑凈化和富集堿性化合物的強(qiáng)有力工具pH02468101214k’Acids(HA)NeutralBases(BH+)A-B清洗2:100%MeOH(強(qiáng)烈清洗)樣品預(yù)處理活化/平衡:MeOH/Water上樣清洗1:2%甲酸水溶液(目標(biāo)鎖定)洗脫:2%NH4OH-MeOH(目標(biāo)釋放)溶劑蒸發(fā)/重新定容(選項(xiàng))(OasisMCX在所有pH下均帶負(fù)電)OasisMCXSPE吸附劑pH02468101214O對(duì)乙酰氨基酚反相作用強(qiáng)陰離子交換作用（酸性藥物）MAX吸附劑NO-OHNOCH3CH2N(R3)Cl-CH2N(R3)Cl-++QuatenaryamineOasis?MAX吸附劑上酸性化合物的作用模式:Mixed-ModeAnionic-eXchangerpKa>18O對(duì)乙酰氨基酚反相作用強(qiáng)陰離子交換作用（酸性藥物）MAXOasisMAXSPE吸附劑凈化和富集酸性性化合物的強(qiáng)有力工具pH02468101214k’Acids(HA)NeutralBases(BH+)A-B清洗2:100%MeOH(強(qiáng)烈清洗)樣品預(yù)處理活化/平衡:MeOH/Water上樣清洗1:2%氨水(目標(biāo)鎖定)洗脫:2%甲酸-MeOH(目標(biāo)釋放)溶劑蒸發(fā)/重新定容(選項(xiàng))(OasisMAX在所有pH下均帶正電)OasisMAXSPE吸附劑pH02468101214若想在OasisMCX/MAX吸附劑上凈化和富集永久性帶電的物質(zhì)

(如季銨堿及其鹽，有機(jī)磺酸及其鹽，有機(jī)膦酸及其鹽)，能否成功?！若想在OasisMCX/MAX吸附劑上凈化和富集永久性帶電永久性帶電分析物帶來(lái)的挑戰(zhàn)…k’Acids(HA)NeutralQ.Base(Q+)A-Q.Base(Q+)帶永久性正電的季銨鹽在OasisMCX上時(shí)…pHk’NeutralBases(BH+)BRSO3-

帶永久性負(fù)電的有機(jī)磺酸鹽在OasisMAX上時(shí)…Bases(BH+)BA-Acids(HA)RSO3-永久性帶電分析物帶來(lái)的挑戰(zhàn)…k’Acids(HA)NeutOasis?