第六章植物的胚胎培養(yǎng)和離體授粉

第六章植物胚胎培養(yǎng)

和離體授粉2植物胚胎培養(yǎng)概念對無菌分離出的成熟胚或未成熟胚進(jìn)行離體培養(yǎng)，以獲得發(fā)育正常的植株的技術(shù)。3植物胚培養(yǎng)根據(jù)在培養(yǎng)中所取外植體的部位不同可分為胚培養(yǎng)(embryoculture)胚乳培養(yǎng)(endospermculture)

胚珠培養(yǎng)(ovuleculture)

子房培養(yǎng)(ovaryculture)4

無菌條件下將胚從胚珠（幼胚）或種子中（成熟胚）分離出來，置于培養(yǎng)基上進(jìn)行離體培養(yǎng)獲得再生植株的方法。一、胚培養(yǎng)

胚齡越小，所需的營養(yǎng)物質(zhì)就愈復(fù)雜，也愈難培養(yǎng)5（一）成熟胚培養(yǎng)

成熟胚為子葉期以后的胚，其在簡單的基本培養(yǎng)基上即可萌發(fā)生長。對培養(yǎng)條件和操作技術(shù)要求相對簡單。

主要適用于珍稀雜種的種子萌發(fā)及某些難繁殖植物的搶救等，可以克服由種皮或果皮等造成的發(fā)芽障礙，同時(shí)也可避免自然環(huán)境對種子萌發(fā)的不利影響。6

牡丹成熟胚的離體培養(yǎng)與快速繁殖Matureembryocultureandrapidpropagationoftreepeony7（二）幼胚培養(yǎng)對未發(fā)育成熟的胚進(jìn)行培養(yǎng)。要求較好的培養(yǎng)條件和較復(fù)雜的操作技術(shù)（胚剝離）。分離技術(shù)營養(yǎng)條件植物胚的發(fā)育過程8球形胚前期心型胚前期魚雷胚球形胚手杖形胚期成熟胚期91、幼胚培養(yǎng)步驟1)材料的選擇與滅菌：適宜于幼胚培養(yǎng)的胚發(fā)育時(shí)期多為球形胚至魚雷形胚期。2)幼胚的分離分離操作技術(shù)的關(guān)鍵步驟：

a，借助于解剖鏡；b，注意保濕；c，動(dòng)作迅速；d，帶胚柄取出；e，立即接種。3）幼胚的接種培養(yǎng)2、幼胚離體培養(yǎng)中常見的生長發(fā)育方式

胚性發(fā)育(embryonaldevelopment)——

幼胚接種到培養(yǎng)基上以后，仍然按照在活體內(nèi)的發(fā)育方式發(fā)育，最后形成成熟胚，然后再按種子萌發(fā)途徑出苗形成完整植株，這種途徑發(fā)育的幼胚一般一個(gè)幼胚將來就是一個(gè)植株。1011早熟萌發(fā)(earlymaturesprouting)——幼胚接種后，離體胚不繼續(xù)胚性生長，而是在培養(yǎng)基上迅速萌發(fā)成幼苗，通常稱為早熟萌發(fā)。愈傷組織——在許多情況下，幼胚在離體培養(yǎng)中首先發(fā)生細(xì)胞增殖，形成愈傷組織。一般來講由胚形成的愈傷組織大多為胚性愈傷組織，這種胚性愈傷組織很容易分化形成植株。在大多數(shù)情況下，一個(gè)幼胚萌發(fā)成一個(gè)植株，但有時(shí)會由于細(xì)胞分裂產(chǎn)生大量的胚性細(xì)胞，以后形成許多胚狀體，從而可以形成許多植株，這種現(xiàn)象就是所謂的叢生胚現(xiàn)象。2、影響幼胚培養(yǎng)的因素

1）培養(yǎng)基

A、基本培養(yǎng)基幼胚要求更復(fù)雜的培養(yǎng)基。除了一般的無機(jī)鹽成分外，還要加入微量元素和生長輔助物質(zhì)，不同發(fā)育時(shí)期的幼胚對培養(yǎng)基成份要求不同，胚齡越小培養(yǎng)及成份越復(fù)雜。K+、Ca2+水平稍高有利于幼胚培養(yǎng)1213B、蔗糖： 糖的作用： 調(diào)節(jié)滲透壓；碳源；防止幼胚早萌。 滲透壓的保持對于幼胚培養(yǎng)相當(dāng)重要，幼胚需要蔗糖濃度較高。最適蔗糖濃度隨著胚的發(fā)育時(shí)期而降低。14胚發(fā)育早期要求較高的的滲透壓，而隨著胚的發(fā)育逐漸降低。15C、植物激素的作用： 低濃度的GA能促進(jìn)幼胚的早熟萌發(fā)。有時(shí)GA還具有胚柄的作用.低濃度生長素對幼胚生長有促進(jìn)作用，高濃度則有抑制作用。16D、天然提取物及某些蛋白制品的作用銀杏幼胚培養(yǎng)中添加銀杏胚乳有促進(jìn)作用（李繼侗，1934）；曼佗羅幼胚培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)添加椰子乳能很好的促進(jìn)幼胚的發(fā)育(200-500um的幼胚)（1941）。此外，大麥胚乳、麥芽提取物、酵母提取物、水解酪蛋白等都能促進(jìn)幼胚的發(fā)育。2）胚胎發(fā)育時(shí)期一般胚齡越小，越難培養(yǎng)；雙子葉植物：心形胚期以后的胚較易培養(yǎng)禾谷類植物：梨形胚期（受精后8d左右，0.5mm以上）后較易培養(yǎng)17183)培養(yǎng)條件A、溫度： 多數(shù)為25-30℃，以該植物種子萌發(fā)的適宜溫度為好。B、光照：大多數(shù)處于球形期至心形期的幼胚,需要在黑暗條件下培養(yǎng)兩周后再給予光照,早期光照不利于胚根發(fā)育,但胚芽發(fā)育需要光照.C、pH：不同種類植物和不同發(fā)育時(shí)期的幼胚對pH的要求不同。例：薺菜胚的培養(yǎng)過程雙子葉植物（球形胚晚期以及更大的薺菜胚）的培養(yǎng)：消過毒的薺菜蒴果放在幾滴無菌培養(yǎng)基中用鑷子將蒴果外壁的兩半撐開，露出胚珠解剖鏡下可見胚珠中綠色的魚雷形或更幼齡胚由胎座上取下一個(gè)胚珠，放在凹玻片中（內(nèi)有一滴培養(yǎng)基）用鋒利的有柄刀片將胚珠縱切成兩半留下有胚的一半，仔細(xì)剔除胚珠組織19取出聯(lián)著胚柄的完整胚

(較老胚在胚珠上無胚的一側(cè)切一小口，用鈍頭解剖針輕壓珠被把完整的胚擠出到周圍的液體中)接種到培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)幼胚發(fā)育到魚雷形階段轉(zhuǎn)移到降低了蔗糖濃度（2~3%）的同樣培養(yǎng)基上光培養(yǎng)至發(fā)育成熟新的植株203、植物胚胎培養(yǎng)的應(yīng)用P59遠(yuǎn)源雜交中克服雜種不育（胚胎拯救）促進(jìn)無生活力或生活力低下的種子萌發(fā)縮短育種周期理論研究單倍體產(chǎn)生2122二、胚珠和子房培養(yǎng)23（一）胚珠培養(yǎng)24

1、材料的選擇和滅菌： 未授粉胚珠：開花前1-6天， 授粉胚珠：授粉后1-120天不等，較晚時(shí)期有利于胚的發(fā)育。 滅菌：先對子房或外表組織消毒滅菌后，后取出胚珠培養(yǎng)（可帶胎座組織一起取出）。2、接種培養(yǎng)

（二）子房培養(yǎng)1、子房培養(yǎng)包括授粉前和授粉后的子房培養(yǎng)。2、未授粉子房培養(yǎng)應(yīng)注意的問題：

1、材料的選擇：開花前1~5天的花蕾，發(fā)育時(shí)期（接近成熟胚囊易于成功）；可部分保留花被。

2、培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基（MS、N6、B5等）、植物激素（配合使用）、蔗糖濃度（3-10%）

3、培養(yǎng)方式：直插優(yōu)于平放。25（二）子房培養(yǎng)3、子房培養(yǎng)物的倍性：二倍體：來源于合子（受精后）或體細(xì)胞三倍體：來源于胚乳（受精后）單倍體：來源于未受精的胚囊內(nèi)的細(xì)胞（卵細(xì)胞、助細(xì)胞、反足細(xì)胞、極核細(xì)胞）2627Muchofourcurrentunderstandingabouttheroleofphytohormonesinfibergrowthanddevelopmentcomesfromstudiesofisolatedovulesinculture.Fiberinitiationinunfertilizedovulesispromotedbytheadditionofauxinandgibberellicacid.（三）未傳粉子房和胚珠培養(yǎng)產(chǎn)生單倍體誘導(dǎo)孤雌生殖，是產(chǎn)生單倍體的途徑之一影響因素（P63）：供體植物的基因型子房的發(fā)育階段：接近成熟期的胚囊較易誘導(dǎo)成功（單核至四核胚囊期）培養(yǎng)基成分：防止誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織培養(yǎng)條件：冷凍預(yù)處理或較高溫度（35℃）預(yù)培養(yǎng)對產(chǎn)生單倍體往往有促進(jìn)作用28合點(diǎn)端1發(fā)育珠孔3退化1.蓼型胚囊的發(fā)育70%以上被子植物，如水稻、小麥、油菜等大孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂四分體（線形）單孢子胚囊成熟胚囊

核三次有絲分裂珠孔端合點(diǎn)端回三、離體授粉3031在無菌條件下，培養(yǎng)離體的未受精雌蕊或胚珠和花粉，使花粉萌發(fā)產(chǎn)生的花粉管進(jìn)入胚珠，完成受精過程而獲得有生活力種子的技術(shù)。32（一）離體授粉的基本技術(shù)過程1、親本的選擇：父本（收集花粉）：套袋（時(shí)期）表面消毒（時(shí)期）花粉收集（時(shí)期）母本（選取雌蕊或胚珠）：套袋表面消毒去雄剝?nèi)〈迫锘蚺咧椴煌参镒钸m時(shí)期不同，但必須是未受精狀態(tài)2、離體授粉受精：父本（收集花粉）：33（二）影響離體授粉成功的因素1、發(fā)育時(shí)期2、培養(yǎng)基成分3、培養(yǎng)溫度4、材料消毒5、母體組織的保留6、授粉方式34（三）

離體授粉技術(shù)在雜交育種上的應(yīng)用克服植物遠(yuǎn)源雜交不親和性克服自交不親和性誘導(dǎo)孤雌生殖353637四、植物胚乳培養(yǎng)胚乳培養(yǎng)（Endospermculture）： 是指將胚乳組織從母體上分離出來，通過離體培養(yǎng)，使其發(fā)育成完整植株的技術(shù)。38（二）概述胚乳培養(yǎng)的最早研究始于1933年，Lampe和Mills首例進(jìn)行了玉米胚乳培養(yǎng)。胚乳培養(yǎng)的研究主要集中在以下一些問題的探討：

胚乳細(xì)胞的全能性。在離體培養(yǎng)條件下，胚乳細(xì)胞是否與其它體細(xì)胞和花粉一樣，具有全能性而再生植株。大多數(shù)被子植物的胚乳是三倍體，能否通過胚乳培養(yǎng)獲得三倍體植株而得到無籽結(jié)實(shí)；通過胚乳培養(yǎng)技術(shù)，探索改良農(nóng)、林及園藝植物三倍體育種技術(shù)的可能性。3940研究離體培養(yǎng)條件下胚和胚乳的關(guān)系。

到目前為止，已有40多種植物的胚乳進(jìn)行了培養(yǎng)。其中蘋果、柚、橙、檀香、枸杞、獼猴桃、玉米、大麥、小黑麥、水稻、馬鈴薯、梨、核桃等的胚乳培養(yǎng)得到了再生植株。其它有的分化除芽、根、葉等或得到愈傷組織。41影響胚乳培養(yǎng)的因素基因型；胚乳的發(fā)育時(shí)期；

培養(yǎng)條件；42A、胚乳發(fā)育時(shí)期的影響發(fā)育早期胚乳：操作不便，誘導(dǎo)率低游離核期或剛轉(zhuǎn)入細(xì)胞期的核型胚乳：難獲得愈傷旺盛生長期（細(xì)胞形成期）胚乳：易誘導(dǎo)產(chǎn)生callus成熟期胚乳：已高度分化，很獲誘導(dǎo)脫分化43水稻：授粉后4d黑麥草：授粉后8-10d黃瓜：授粉后7-16d梨：授粉后20d大麥：授粉后10-20d玉米和小麥：授粉后8-12d一些草本植物胚乳培養(yǎng)的適宜取材時(shí)期44B、培養(yǎng)基和激素的影響基本培養(yǎng)基：MS、B5、MT、White、LS等水解酪蛋白、酵母提取物也很必要

激素：要求特殊大麥胚乳只有在添加2，4-D的培養(yǎng)基上才能生長獼猴桃胚乳培養(yǎng)中，玉米素最好棗的胚乳培養(yǎng)中，激素似乎無特殊要求45C、胚因子胚在萌發(fā)時(shí)產(chǎn)生某種物質(zhì)影響胚乳的發(fā)育過程，這種胚對胚乳的影響，即稱為“胚因子”影響。胚乳培養(yǎng)中，外源GA3能部分取代胚因子。46D、其他因素的影響蔗糖濃度：3%-5%溫度：25℃pH值：如蓖5.0;玉米