單克隆抗體制備

本章內(nèi)容單克隆抗體概念、特性、與多克隆抗體的異同點(diǎn)？雜交瘤技術(shù)的基本原理雜交瘤細(xì)胞的克隆方法單克隆抗體的制備流程和應(yīng)用第一頁，共四十四頁。概念多克隆抗體（PcAb）：針對(duì)抗原不同表位的多個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆產(chǎn)生的混合抗體單克隆抗體（McAb）：只針對(duì)抗原單一表位的B淋巴細(xì)胞克隆產(chǎn)生的同源抗體第二頁，共四十四頁。為何要使用單克隆抗體？一個(gè)抗原分子可能含有許多抗原表位一個(gè)B細(xì)胞只會(huì)生產(chǎn)一種抗體傳統(tǒng)抗血清對(duì)相似抗原會(huì)有交叉反應(yīng)性第三頁，共四十四頁。一個(gè)抗原分子上常有許多表位抗原分子上可以誘導(dǎo)出抗體的部位或片段，稱為eptope、antigenicdeterminant；一個(gè)抗原分子上通常都有許多eptope，每個(gè)eptope至少都可誘生出一種抗體；因此在傳統(tǒng)抗血清中，都含有許多種不同的抗體，分別針對(duì)這些不同的eptope。第四頁，共四十四頁。一個(gè)B細(xì)胞只會(huì)生產(chǎn)一種抗體

血清中的每一種抗體是由單一種B細(xì)胞所分泌產(chǎn)生，若能把此B細(xì)胞由脾臟中挑出來，單獨(dú)培養(yǎng)成細(xì)胞株，則可獲得單一種類的抗體，只會(huì)對(duì)一種eptope反應(yīng)。大量培養(yǎng)此細(xì)胞株，即可有品質(zhì)一定、純度均一的抗體，即單克隆抗體。第五頁，共四十四頁。抗血清對(duì)相似抗原會(huì)有交叉反應(yīng)性對(duì)于分子構(gòu)造相似的抗原，由于它們含有共同或相似的eptope，所產(chǎn)生的抗血清對(duì)這兩種相似的抗原都會(huì)產(chǎn)生反應(yīng)，稱為交叉反應(yīng)性。同時(shí)又由于免疫動(dòng)物的個(gè)體差異，對(duì)抗原的反應(yīng)也有相當(dāng)?shù)牟町悾灾聼o法準(zhǔn)確控制所得到每批抗血清效價(jià)的高低第六頁，共四十四頁?？寡搴蛦慰寺】贵w制備

第七頁，共四十四頁。B細(xì)胞無法在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)

B細(xì)胞不易在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，雖然有人一直努力，想找出在體外培養(yǎng)脾臟細(xì)胞的條件，但結(jié)果均不甚理想。(見圖中央的4號(hào)B細(xì)胞，X表示無法培養(yǎng))第八頁，共四十四頁。腫瘤細(xì)胞可在培養(yǎng)基中永久生長(zhǎng)

腫瘤細(xì)胞可在培養(yǎng)基中永久生長(zhǎng)：若把瘤細(xì)胞永久生長(zhǎng)的特性，利用細(xì)胞融合技術(shù)導(dǎo)入可生產(chǎn)抗體的B細(xì)胞中，則得到可在培養(yǎng)基中永久生長(zhǎng)的B細(xì)胞株，即雜交瘤細(xì)胞株。

第九頁，共四十四頁。

1975年Koehler和Milstein在Nature雜志聯(lián)名發(fā)表題為“分泌預(yù)定特異性抗體的融合細(xì)胞持續(xù)培養(yǎng)“的論文，宣告單克隆抗體的誕生，該成果獲1984年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)和生理獎(jiǎng).

第十頁，共四十四頁。雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體第十一頁，共四十四頁。雜交瘤技術(shù)的基本原理

雜交瘤技術(shù)是將能夠產(chǎn)生抗體，但在體外不能進(jìn)行無限繁殖的B淋巴細(xì)胞與能在體外進(jìn)行無限繁殖，但不能產(chǎn)生抗體的骨髓瘤細(xì)胞融合成雜交瘤細(xì)胞。這種雜交瘤細(xì)胞具有兩種親本細(xì)胞的特性：既能夠分泌特異性的抗體，又能夠在體外長(zhǎng)期繁殖。雜交瘤細(xì)胞經(jīng)過篩選、克隆化培養(yǎng)后成為單個(gè)細(xì)胞克隆，分泌的抗體即為單克隆抗體。

第十二頁，共四十四頁。單克隆抗體制備流程圖第十三頁，共四十四頁。親本細(xì)胞的選擇與制備細(xì)胞株穩(wěn)定，易傳代培養(yǎng)；細(xì)胞株本身不產(chǎn)生Ig是次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)換酶缺陷株(hypoxanthine-guaninephosphoribosyltransferase,HGPRT)最常用的骨髓瘤細(xì)胞是NS-1和SP2/0細(xì)胞株骨髓瘤細(xì)胞(NS-1)骨髓瘤細(xì)胞需定期用8-氮鳥嘌呤(8-AG)處理第十四頁，共四十四頁。親本細(xì)胞的選擇與制備免疫脾細(xì)胞：是經(jīng)過抗原誘導(dǎo)活化的免疫細(xì)胞，具有分泌抗體的能力

8-12周齡BALB/c小鼠先以目標(biāo)抗原(如菌體)免疫，抗原需加佐劑(adjuvant）注入小鼠體內(nèi)慢慢釋出，誘使B細(xì)胞成熟增殖并生產(chǎn)抗體。試采血確定有抗體產(chǎn)生后，即可取出

脾臟以收集脾臟細(xì)胞(大多為B細(xì)胞)與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。

注意乳劑的生產(chǎn)要完全，可取小量滴入水中，震動(dòng)后應(yīng)該不會(huì)散去。

有人打開腹腔直接在脾臟注射抗原免疫。但除非抗原來源困難或有其它目的，我們?nèi)圆捎脗鹘y(tǒng)方法，因免疫反應(yīng)的啟動(dòng)機(jī)制非常復(fù)雜，生物整體的免疫反應(yīng)是最可靠的。

第十五頁，共四十四頁。第十六頁，共四十四頁。第十七頁，共四十四頁。第十八頁，共四十四頁。第十九頁，共四十四頁。細(xì)胞融合小鼠脾細(xì)胞B

與NS-1細(xì)胞N

以PEG

進(jìn)行融合，操作在2min內(nèi)完成。PEG可導(dǎo)致細(xì)胞膜上脂類物質(zhì)的物理結(jié)構(gòu)重排，使細(xì)胞膜容易打開而有助于細(xì)胞融合。第二十頁，共四十四頁。

第二十一頁，共四十四頁。第二十二頁，共四十四頁。常見的幾種融合形式第二十三頁，共四十四頁。細(xì)胞DNA合成途經(jīng)第二十四頁，共四十四頁。HAT選擇培養(yǎng)基三種關(guān)鍵成分：

次黃嘌呤（hypoxanthine,H）

氨基蝶呤（aminopterin,A）

胸腺嘧啶（thymidine，T）◆是根據(jù)細(xì)胞內(nèi)嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的生物合成途徑設(shè)計(jì)的用于篩選雜交瘤細(xì)胞的特殊培養(yǎng)基。

第二十五頁，共四十四頁。

葉酸參與DNA合成過程，而氨基蝶呤是葉酸的拮抗劑，能阻斷該合成途徑?！鬑AT培養(yǎng)基中含有葉酸拮抗劑-氨基蝶呤，故所有細(xì)胞DNA合成的主要途徑均被阻斷，只能通過替代途徑合成?！綦s交瘤細(xì)胞從脾細(xì)胞中獲得HGPRT，同時(shí)又繼承了骨髓瘤細(xì)胞長(zhǎng)期生長(zhǎng)繁殖的特性，能夠在HAT培養(yǎng)基中得以生存而被篩選出來。第二十六頁，共四十四頁。核苷酸從頭合成途徑（denovosynthesis）核苷酸氨基碟呤（A）HAT核苷酸補(bǔ)救合成途徑（salvagesynthesis）次黃嘌呤（H）胸腺嘧啶核苷（T）DNA第二十七頁，共四十四頁。篩選方法初步篩選：融合后馬上以HAT培養(yǎng)，能活下來的都是B細(xì)胞與NS-1的正確融合細(xì)胞，但此時(shí)細(xì)胞的遺傳背景尚未十分穩(wěn)定。

篩選特異性抗體：

并非所有B細(xì)胞都會(huì)產(chǎn)生我們所要的抗體，小鼠原先就存在許多B細(xì)胞株對(duì)抗一般疾??；因此要用酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）挑出特異性抗體第二十八頁，共四十四頁。第二十九頁，共四十四頁。陽性雜交瘤細(xì)胞的克隆化克隆化

從抗體陽性孔中分離出單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，使之繁殖成單一細(xì)胞集落的過程。有限稀釋法：最常用的方法顯微操作法熒光激活細(xì)胞分選法軟瓊脂平板法第三十頁，共四十四頁。

有限稀釋法計(jì)數(shù)103/ml102/ml10/ml0.5-2/孔第三十一頁，共四十四頁。將陽性孔細(xì)胞株稀釋，重新平分到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，以計(jì)算使得每孔中只含有一個(gè)細(xì)胞（例如每mL含有100個(gè)細(xì)胞，若只要取一個(gè)細(xì)胞放到一個(gè)培養(yǎng)孔中，那你應(yīng)該吸取多少mL？0.01mL），待其生長(zhǎng)成群落后，再次以ELISA篩選特異性抗體。第三十二頁，共四十四頁。克隆化需至少進(jìn)行3-5次第三十三頁，共四十四頁。陽性雜交瘤細(xì)胞的凍存目的：保證雜交瘤細(xì)胞不會(huì)因污染或過多傳代變異丟失染色體而喪失功能。凍存液：10%-90%小牛血清+10%二甲亞砜（DMSO），1X106-5X106/0.5mL逐步降溫:-800C過夜,再放入液氮第三十四頁，共四十四頁。單克隆抗體生產(chǎn)小鼠體內(nèi)誘生法：先向小鼠腹腔注射降植烷，一周后把挑選出來的雜交瘤細(xì)胞打入小鼠腹部，誘生腫瘤，然后以針頭收集所產(chǎn)生的腹水，通?？扇〉?5mL左右；腹水中的抗體濃度非常高，每mL可達(dá)數(shù)mg。

2)體外增量培養(yǎng)法：把雜交瘤細(xì)胞在大型培養(yǎng)槽中培養(yǎng)，收集培養(yǎng)液上清即得抗體，但每mL只得約數(shù)mg，濃度較腹水稀約一千倍。最近有一種細(xì)胞培養(yǎng)瓶，可產(chǎn)生如腹水般濃度的上清，但價(jià)格極為昂貴(IBSIntegraBioscience:IntegraCelline)。第三十五頁，共四十四頁。第三十六頁，共四十四頁。第三十七頁，共四十四頁。第三十八頁，共四十四頁。單克隆抗體的性質(zhì)鑒定Ig類型測(cè)定特異性測(cè)定效價(jià)測(cè)定結(jié)合表位測(cè)定親和力測(cè)定染色體分析第三十九頁，共四十四頁。第四十頁，共四十四頁。單克隆抗體的特性高度特異性高度的均一性和可重復(fù)性弱凝集反應(yīng)和不呈現(xiàn)沉淀反