細(xì)胞化學(xué)染色

細(xì)胞化學(xué)染色

(cytochemicalstain)

檢驗(yàn)科鄒偉麗概述

細(xì)胞化學(xué)(組織化學(xué)，組化)染色以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)并結(jié)合化學(xué)或生物化學(xué)技術(shù)，對細(xì)胞內(nèi)各種化學(xué)成分、代謝產(chǎn)物作定位、定性和半定量檢查的一門科學(xué)?？蓮浹a(bǔ)單純細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查識(shí)別的不足。細(xì)胞化學(xué)染色臨床意義:1.明確或輔助判斷急性白血病的細(xì)胞類型。因?yàn)椴煌?xì)胞系列，其所含的化學(xué)物質(zhì)成分、分布及含量各有不同。因此根據(jù)細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果不同，可推斷所屬的細(xì)胞系列。2.某些疾病的診斷和鑒別診斷。因?yàn)檠?xì)胞在病理情況下，其化學(xué)物質(zhì)成分及含量會(huì)發(fā)生改變，所以僅從細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察白血病的診斷正確率約50～70%，如果結(jié)合細(xì)胞化學(xué)染色則可提到90%以上。一、過氧化物酶染色（POX）

【原理】粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的胞漿中含有髓過氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）,能將底物H2O2分解，產(chǎn)生新生態(tài)氧，它能夠?qū)⑺募谆?lián)苯胺氧化為聯(lián)苯胺藍(lán)。聯(lián)苯胺藍(lán)自我脫氫氧化，則顯棕色四甲基苯醌二胺。若加入亞硝基鐵氰化鈉與聯(lián)苯胺藍(lán)結(jié)合，可形成穩(wěn)定的藍(lán)黑色顆粒，定位于細(xì)胞漿酶所在部位?！緲?biāo)本要求】一般用新鮮的骨髓涂片做POX染色；如果外周血中白血病細(xì)胞多而骨髓涂片不夠的情況下，可選擇新鮮的血涂片來做。為了保證酶的活性，片子一般應(yīng)在固定后一周內(nèi)完成染色?！救旧椒ā恳?、試劑：甲液：聯(lián)苯胺（0.3g）；95%乙醇（99ml）；亞硝基氰化鈉飽和溶液（1ml）乙液：3%過氧化氫（0.3ml）；蒸餾水（2ml）注：乙液必須現(xiàn)配現(xiàn)用（5mlH2O+1滴H2O2）二、染色：1.滴加甲液在干的涂片上。2.待30秒后滴加乙液。（比例為2:1）3.過3-4分鐘后用自來水沖洗3-4分鐘。4.復(fù)染15分鐘?！菊Ｑ?xì)胞的染色結(jié)果】細(xì)胞中如有藍(lán)黑色即為陽性細(xì)胞。根據(jù)陽性顆粒的有無及多少，將染色結(jié)果分為（-）、（+）、（++）、（+++）、（++++）。陽性反應(yīng)細(xì)胞陽性強(qiáng)度陽性特征陰性反應(yīng)細(xì)胞部分原粒細(xì)胞+~++顆粒細(xì)小，分布稀疏早幼粒細(xì)胞++~++++顆粒狀或彌散狀中性成熟粒細(xì)胞++~+++同上嗜酸性粒細(xì)胞++~++++粗顆粒狀，密集少數(shù)單系細(xì)胞+~++細(xì)小，彌散，較少

部分原粒細(xì)胞嗜堿性粒細(xì)胞大部分單系細(xì)胞淋巴細(xì)胞漿細(xì)胞紅系細(xì)胞POX染色臨床意義

由于POX在淋系細(xì)胞中不顯示，而在粒系和單系中顯示，使其區(qū)分急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)和急性髓細(xì)胞白血病(AML)的分型中具有重要意義。（陽性率>3%即診斷為AML*M0除外）。陰性的結(jié)果見于多種急性白血病（但可能最大的是淋巴細(xì)胞白血?。?。其次觀察成熟中性粒細(xì)胞的POX活性有助于其他疾病的診斷，如有些骨髓異常綜合征、放射病可使中性成熟粒細(xì)胞此酶活性下降。二、過碘酸－雪夫反應(yīng)(PAS)【原理】

過碘酸是強(qiáng)氧化劑，它作用于細(xì)胞內(nèi)含有乙二醇基的多糖類物質(zhì)（如糖原、粘多糖、糖蛋白及糖酯等），使之氧化，形成雙醛基。醛基與雪夫試劑中的無色品紅結(jié)合，使無色的品紅變成紅色或紫紅色化合物，定位于含有多糖類的細(xì)胞中?！緲?biāo)本要求】一般用骨髓片做PAS染色，如外周血中白血病細(xì)胞多的患者也可用血涂片來做。但如果觀察的是幼紅細(xì)胞，只能用骨髓涂片來做，因?yàn)橐话闱闆r下血涂片中幼紅細(xì)胞不多。由于PAS染色是對于多糖類物質(zhì)進(jìn)行的一種半定量分析，所以也可用陳舊的未染色片子。【染色方法】1.新鮮血片或骨髓片用0.95%乙醇固定10分鐘。2.10g/L過碘酸氧化20分鐘。3.水洗3-5分鐘，沖洗掉多余的過碘酸，晾干。4.經(jīng)無色品紅液室溫中染色30-60分鐘。5.SO2液中漂洗3次。6.流水沖5分鐘，再用蒸餾水洗。7.用甲基綠復(fù)染2-10分鐘。8.流水沖洗，干后鏡檢?！菊Ｑ?xì)胞的染色結(jié)果】細(xì)胞中有紅色即為陽性細(xì)胞。再根據(jù)陽性顆粒的有無及多少，可分為（-）、（+）、（++）、（+++）、（++++）。（-）：胞質(zhì)無顆粒（+）：胞質(zhì)內(nèi)有顆粒（++）：有較粗紅色顆粒（+++）：有粗大紅色顆粒（++++）：顆粒粗大并有紅色塊狀PAS染色臨床意義1.紅血病、紅白血病及貧血類型的鑒別：紅血病、紅白血病、重型地貧及缺鐵貧以及MDS時(shí)幼紅細(xì)胞呈強(qiáng)陽性，但極少數(shù)紅白血病可呈陰性；溶貧時(shí)幼紅細(xì)胞呈陰性或弱陽性；再障、巨幼貧時(shí)幼紅細(xì)胞呈陰性。2.白血病類型的鑒別：急粒時(shí)原粒呈陰性或弱陽性，以彌漫性為主；急淋時(shí)原、幼淋多呈塊狀陽性反應(yīng)，少數(shù)呈陰性反應(yīng)；急單時(shí)原、幼單核細(xì)胞呈陽性反應(yīng)，其顆粒細(xì)小，彌散分布。三、酯酶染色不同血細(xì)胞中所含酯酶的成分不同。根據(jù)酯酶特異性高低分為特異性酯酶（SE）和非特異性酯酶（NSE）。特異性酯酶就是指氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色；非特異性酯酶的種類有多種，根據(jù)pH值不同分為酸性、中性和堿性酯酶，包括了酸性非特異性酯酶（即酸性α-醋酸萘酚酯酶）、堿性非特異性酯酶（即α-丁酸萘酚酯酶）和中性非特異性酯酶，后者包括α-醋酸萘酚酯酶、醋酸AS-D萘酚酯酶等。目前顯示血細(xì)胞中酯酶的方法均采用偶氮偶聯(lián)法。

酸性α-醋酸萘酚酯酶（α-NAE）

【原理】

血細(xì)胞內(nèi)的α-NAE在pH中性條件下，水解基質(zhì)液中的α-醋酸萘酚并釋放出α-萘酚，進(jìn)而與基質(zhì)液中的重氮鹽偶聯(lián)形成不溶性有色沉淀，定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)酶所在的部位。本試驗(yàn)常用的重氮鹽為堅(jiān)牢藍(lán)B，形成的有色沉淀為棕黑色或灰黑色。單核細(xì)胞系統(tǒng)的陽性可被氟化鈉抑制，所以做α-NAE染色時(shí)，通常同時(shí)做氟化鈉抑制試驗(yàn)。

【標(biāo)本要求】一般用新鮮的骨髓涂片來做該染色。如外周血中白血病細(xì)胞多而骨髓涂片不夠的情況下，可選擇新鮮的血涂片來做。做此染色時(shí)，通常要同時(shí)做氟化鈉抑制試驗(yàn)，所以至少需要兩張片子。為了保證酶的活性，片子一般在固定后一周內(nèi)完成染色。【染色方法】1.取新鮮骨髓涂片置濃福爾馬林中蒸3分鐘。（2滴）2.放入作用液37℃溫箱30分鐘。作用液配制：取固蘭40mg，1%α-萘酚（以50%丙酮做溶劑）0.8ml，0.05mol/L磷酸鹽緩沖液（PH7.4）40ml混合，過濾后使用。3.用自來水沖洗，晾干。4.用1%沙黃復(fù)染45秒。5.水洗，晾干后鏡檢。注：該染色同時(shí)要做氟化鈉抑制試驗(yàn)，主要步驟如下：將上述作用液分成兩份，其中一份再加入60mgNaF，然后分別將已固定的片子放入其中作用30分鐘，最后復(fù)染，鏡檢，比較兩張染色結(jié)果，判斷NaF抑制情況?！菊Ｑ?xì)胞的染色結(jié)果】1.單核系

分化差的原單呈陰性，分化好的原單呈陽性（常較強(qiáng)），幼單及單核也呈陽性，陽性反應(yīng)能被氟化鈉抑制。所謂抑制是指氟化鈉試驗(yàn)的抑制率大于50%。2.粒系

陰性或陽性，但陽性反應(yīng)不能被氟化鈉抑制。3.淋系

多數(shù)陰性，少數(shù)弱陽性，不能被氟化鈉抑制。4.其他細(xì)胞

巨核細(xì)胞和血小板呈陽性，陽性反應(yīng)不能被氟化鈉抑制；少數(shù)有核紅細(xì)胞呈弱陽性，陽性反應(yīng)不能被氟化鈉抑制；漿細(xì)胞呈陰性。

抑制率的計(jì)算公式：抑制率%=（抑制前陽性率-抑制后陽性率）×100抑制前陽性率

α-NAE臨床意義1.急性單核細(xì)胞白血病單核細(xì)胞多數(shù)陽性較強(qiáng)，且能被NaF抑制。2.急性早幼粒細(xì)胞白血病早幼粒呈強(qiáng)陽性，陽性但不能被NaF抑制。3.急性粒細(xì)胞白血病和急性淋巴細(xì)胞白血病原粒細(xì)胞、淋巴母細(xì)胞、幼淋巴細(xì)胞呈陰性或陽性，陽性不能被NaF抑制。4.急性粒單核細(xì)胞白血病原粒細(xì)胞呈陰性至陽性，但不被NaF抑制；原幼單呈陽性，能被NaF抑制，所以總的說，該白血病NaF抑制試驗(yàn)是部分抑制。四、鐵染色【原理】正常人骨髓中的貯存鐵主要存在于骨髓小粒和幼紅細(xì)胞中。骨髓中的鐵在酸性環(huán)境下與亞鐵氰化鉀作用，形成普魯士藍(lán)色的亞鐵氰化鐵沉淀，定位于含鐵的部位。

鐵染色（ferricstain）化學(xué)反應(yīng)過程如下：

酸性4Fe3++3K4[Fe（CN）6]4[Fe（CN）6]3

+12K+（含鐵物質(zhì)）（亞鐵氰化鉀）（亞鐵氰化鐵）【標(biāo)本要求】要求用新鮮的、含有骨髓小粒的骨髓涂片進(jìn)行染色。陳舊的骨髓涂片鐵污染明顯而容易造成假陽性；如果骨髓涂片中無骨髓小粒，細(xì)胞外鐵就無法觀察；如果片中幼紅細(xì)胞很少或無，細(xì)胞內(nèi)鐵就無法觀察?！救旧椒ā恳?、試劑：2%低鐵氰化鉀液（10g亞鐵氰化鉀+500ml蒸餾水）和1%鹽酸（5mlHCL+495H2O),用時(shí)等量混合。二、染色：1.用新鮮配制的酸性亞鐵氰化鉀液染Z在37℃溫箱中作用30分鐘。2.用自來水沖洗，晾干。3.0.1%沙黃復(fù)染1分鐘。4.用自來水沖洗，晾干，鏡檢?！救旧Y(jié)果】幼紅細(xì)胞核呈鮮紅色，漿呈淡黃紅色，鐵粒呈藍(lán)綠色。細(xì)胞外鐵用低倍鏡觀察涂片，特別是涂片尾部和髓粒附近，注意翠藍(lán)色顆粒的存在，可分五級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。（-）：無顆粒。（+）：有少數(shù)鐵顆?；蚺家婅F小珠(顆粒體積大于嗜酸性粒細(xì)胞的顆粒者稱為鐵珠)。（++）：有較多的鐵顆粒和小珠。（+++）：有很多的鐵顆粒、小珠和少數(shù)小塊狀。（++++）：有極多鐵顆粒、小珠，有很多的小塊，密集成堆。

細(xì)胞內(nèi)鐵用油鏡計(jì)數(shù)100個(gè)中、晚幼紅細(xì)胞，記錄胞漿中含有藍(lán)色鐵粒的紅細(xì)胞(鐵粒幼紅細(xì)胞)的百分率。根據(jù)細(xì)胞內(nèi)鐵顆粒的數(shù)目、大小、染色深淺和顆粒分布的情況，將鐵粒幼紅細(xì)胞分為四型。Ⅰ型（+）：幼紅細(xì)胞內(nèi)含鐵粒1～2個(gè)。Ⅱ型（++）：幼紅細(xì)胞內(nèi)含鐵粒3～5個(gè)。Ⅲ型（+++)：幼紅細(xì)胞內(nèi)含鐵粒6～10個(gè)。Ⅳ型(++++)：幼紅細(xì)胞內(nèi)含鐵粒11個(gè)以上。環(huán)形鐵粒幼紅細(xì)胞

環(huán)形鐵粒幼紅細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)為含鐵粒在6個(gè)以上，圍繞核周1／2以上者。有時(shí)成熟紅細(xì)胞中也出現(xiàn)鐵顆粒稱為鐵粒紅細(xì)胞。鐵染色的臨床意義

1、鑒別缺鐵性貧血、鐵粒幼細(xì)胞性貧血及某些溶血性貧血

缺鐵性貧血時(shí)骨髓細(xì)胞外鐵和內(nèi)鐵顯著減少或消失，經(jīng)鐵劑治療后細(xì)胞外鐵及內(nèi)鐵可迅速增多，此檢查是診斷缺鐵性貧血及指導(dǎo)鐵劑治療的一種輔助方法；非缺鐵性貧血，如溶血性貧血、巨幼紅細(xì)胞性貧血等病人的細(xì)胞外鐵可以增高，因此有助于鑒別缺鐵性貧