免疫印跡技術(shù)課稿

免疫印跡技術(shù)課稿

雕版印刷是最早在中國出現(xiàn)的印刷形式，在印刷史上有“活化石”之稱，揚州是中國雕版印刷術(shù)的發(fā)源地，是中國國內(nèi)唯一保存全套古老雕版印刷工藝的城市。雕版印刷術(shù)是一種具有突出價值且民族特征鮮明、傳統(tǒng)技藝高度集中的人類非物質(zhì)文化遺產(chǎn)。它凝聚著中國造紙術(shù)、制墨術(shù)、雕刻術(shù)、摹拓術(shù)等幾種優(yōu)秀的傳統(tǒng)工藝，最終形成了這種獨特文化工藝；它為后來的活字印刷術(shù)開了技術(shù)上的先河，是世界現(xiàn)代印刷術(shù)的最古老的技術(shù)源頭?；緝?nèi)容免疫印跡技術(shù)的原理1基本操作流程2注意事項3免疫印跡技術(shù)的應(yīng)用4課堂小結(jié)5作業(yè)6一、免疫印跡技術(shù)的原理通過SDS區(qū)分不同大小的蛋白組分，并轉(zhuǎn)移至固相支持物（硝酸纖維素膜），通過特異性試劑（抗體）作為探針，與固相支持物上的蛋白質(zhì)（抗原）發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，再通過顯色反應(yīng)對靶物質(zhì)進行檢測。蛋白質(zhì)的Westernblotting技術(shù)結(jié)合了凝膠電泳的高分辨率和固相免疫測定的特異敏感等多種特點，可檢測到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。④③②

①電泳結(jié)果檢查電泳測定蛋白樣品濃度收集或提取蛋白樣品二、基本操作流程1、SDS1、SDS

①收集或提取蛋白樣品可以使用適當?shù)牧呀庖海呀赓N壁細胞、懸浮細胞或組織樣品。對于某些特定的亞細胞組份蛋白，例如細胞核蛋白、細胞漿蛋白、線粒體蛋白等，用SDS上樣緩沖液，裂解能力強，能提取細胞總蛋白。另外，常用的還有非離子去垢劑緩沖液裂解法，低滲緩沖液裂解法?？梢詤⒖枷嚓P(guān)文獻提取這些亞細胞組份蛋白，也可以使用試劑盒進行抽提.

二、基本操作流程1、SDS①收集或提取蛋白樣品

②測定蛋白樣品濃度一般來說有三種方法：第一種是采用定量試劑盒；第二種是采用光學檢測法；第三種直接跑SDS。二、基本操作流程1、SDS①收集或提取蛋白樣品②測定蛋白樣品濃度

③電泳配制SDS凝膠，在收集的蛋白樣品中加入上樣緩沖液，點樣后接通電源開始電泳。利用濃縮效應(yīng)、分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)將不同分子量大小的蛋白質(zhì)分離。二、基本操作流程1、SDS①收集或提取蛋白樣品②測定蛋白樣品濃度③電泳

④電泳結(jié)果檢查考馬斯亮藍使用簡便快速，是最經(jīng)濟通用的蛋白PAGE膠電泳染色方法。銀染操作復(fù)雜一些但分辨率高很多?？墒怯捎诳捡R斯亮藍染色或者銀染經(jīng)過固定不可逆結(jié)合，會干擾后面的WesternBlot實驗，很多人會選擇省略掉這一步。同樣的樣品跑2塊膠，一塊染色一塊轉(zhuǎn)膜，一般也可以說明問題。二、基本操作流程2、抗原轉(zhuǎn)移通常有兩種方法：毛細管印跡法（轉(zhuǎn)移效率較低）和電泳印跡法（常用）。

電泳印跡法用有空的塑料盒有機玻璃板將凝膠和硝酸纖維素膜夾成“三明治”狀，而后浸入兩個平行電極中間的緩沖液中進行電泳，選擇適當?shù)碾娪痉较蚓涂梢允沟鞍踪|(zhì)離開凝膠結(jié)合在硝酸纖維素膜上。二、基本操作流程2、抗原轉(zhuǎn)移2、抗原轉(zhuǎn)移

轉(zhuǎn)移膜的選擇WesternBlot印跡常用的轉(zhuǎn)移膜主要是硝酸纖維素膜（NC）和偏二氟乙烯(PVDF膜），此外也有用尼龍膜、DEAE纖維素膜做蛋白印跡。膜的選擇根據(jù)：a.膜與目的蛋白分子的結(jié)合能力（也就是單位面積的膜能結(jié)合蛋白的載量），以及膜的孔徑（也就是攔截蛋白的大?。?；b.不影響后續(xù)的顯色檢測（也就是適和用于所選的顯色方法，信噪比好）；c.如果后繼實驗有其他要求，比如要做蛋白測序或者質(zhì)譜分析，還要根據(jù)不同目的來挑選不同的轉(zhuǎn)移膜。二、基本操作流程2、抗原轉(zhuǎn)移

NC膜簡介硝酸纖維素膜是蛋白印跡最廣泛使用的轉(zhuǎn)移介質(zhì)，其優(yōu)點是對蛋白有結(jié)合能力強，適用于各種顯色方法（包括同位素，化學發(fā)光、常規(guī)顯色、染色和熒光顯色），背景低，性價比高；使用也很簡便（不需要甲醛預(yù)處理，只須在無離子水面浸潤排出膜內(nèi)氣泡，再在電泳緩沖液中平衡；而且容易封閉，也不需要特別嚴謹?shù)那逑礂l件）。轉(zhuǎn)移到NC膜上的蛋白在合適的條件下可以穩(wěn)定保存很長時間。

二、基本操作流程優(yōu)2、抗原轉(zhuǎn)移

NC膜簡介但是純的硝纖膜在比較脆，容易卷，不適合用于需要多次重復(fù)清洗的用途。選擇硝纖膜時要注意的是選擇合適的孔徑，通常20KD以上的大分子蛋白用孔徑的膜，小于20KD的話建議選擇的，如果小于7KD的話最好選擇的膜。二、基本操作流程缺3、封閉電泳轉(zhuǎn)移后，固相紙膜上還留有無蛋白組分結(jié)合的區(qū)域，在對蛋白質(zhì)進行專一性檢測的時候，由于免疫學檢測試劑中的蛋白質(zhì)（抗體），在與特異性抗原結(jié)合的同時也會非特異的結(jié)合固相上的空白區(qū)域，產(chǎn)生高背景，導致檢測結(jié)果不明顯，因此要對這些空白區(qū)域進行封閉。最常用的封閉劑就是脫脂奶粉。二、基本操作流程各種常見的封閉劑4、免疫檢測把已經(jīng)封閉過的膜放入加入已知抗體的緩沖液中，對特異性的靶抗原進行檢測。這個過程通常會發(fā)生多步反應(yīng)，一般采用間接檢測法，常用的檢測系統(tǒng)有放射性同位素、酶、熒光素等，通過放射自顯影或顯色反應(yīng)檢測抗原-抗體復(fù)合物，從而達到對蛋白質(zhì)進行特異性檢測和鑒別的目的。二、基本操作流程原理流程圖三、注意事項1．免疫印跡技術(shù)所測定的只是目的蛋白的相對含量。因此不能確定一種細胞含有多少目的蛋白，只能確定該蛋白存在與否及其它條件下與其他細胞相比蛋白的含量是高還是低。2．比較一種目的蛋白在不同細胞或者同一細胞不同條件下的相對含量時，各樣品的總蛋白量必須相等。3．選用合適的SDS膠濃度，使目的蛋白可以得到較好的分辨。4．開始電泳和轉(zhuǎn)移膜時，一定要確認電極的正負極接頭是否正確。5．在免疫檢測中，要注意封閉非特異性結(jié)合位點。6．抗體反應(yīng)在封口塑料袋內(nèi)進行，一定要驅(qū)除袋內(nèi)的所有氣泡，否則會導致抗體結(jié)合不均勻。7．操作要輕柔，帶手套，不要再轉(zhuǎn)移膜上造成任何刮痕。在整個操作中，轉(zhuǎn)移膜要始終在液體中，不能干燥。三、注意事項四、Western-blotting的應(yīng)用

（3個例子）目前，Western印跡法主要用于未知蛋白質(zhì)的檢測及抗原組分、抗原決定簇的分子生物學的測定；同時也可用于未知抗體的檢測和單克隆抗體的鑒定等。很多疾病在不同的發(fā)病階段，即使臨床上還沒有明顯的癥狀，在蛋白質(zhì)水平就發(fā)生了變化，這些變化有可能成為臨床早期的診斷指標。免疫印跡可以用于疾病的早期診斷和預(yù)后的跟蹤分析檢測。艾滋病的確診檢測（例1）艾滋病的臨床癥狀持續(xù)發(fā)熱、乏力、腹瀉、食欲不振、體重下降、夜間盜汗、全身淋巴結(jié)腫大、精神抑郁、表情淡漠呈慢性病容，以及由于機體抵抗力低下，出現(xiàn)一些不常見的條件致病菌感染或機會感染性疾病的癥狀。四、Western-blotting的應(yīng)用艾滋病的診斷標準艾滋病病毒抗體陽性，又具有下述任何一項者，可為實驗確診艾滋病病人。1)近期內(nèi)(3—6個月)體重減輕10%以上，且持續(xù)發(fā)熱38℃達1個月以上。2)近期內(nèi)(3—6個月)體重減輕10%以上，且持續(xù)腹瀉(每日3—5次)1個月以上。3)卡氏肺囊蟲肺炎(P.C.P)。4)卡波西肉瘤(K.S.癥狀是胳膊上或者腿上出現(xiàn)紫色斑塊)。5)明顯的霉菌或其它條件致病菌感染。四、Western-blotting的應(yīng)用大鼠出生前后心肌端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶表達的變化（例2）

目的：探討大鼠心肌組織端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)育規(guī)律。方法：免疫組織化學和免疫印跡技術(shù)檢測SD大鼠心肌端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）的表達，圖像分析技術(shù)對心肌組織TERT的表達進行定量分析。結(jié)果：3組大鼠心肌組織中的心肌細胞、平滑肌和內(nèi)皮細胞均有TERT的表達。TERT主要位于細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)。TERT的總表達規(guī)律是20d胎鼠陽性表達強于出生后6d大鼠，出生后12d大鼠心肌表達最低，3組之間TERT的組間比較差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)論：大鼠心肌組織的端粒酶活性隨著日齡增加，其表達逐漸減少。四、Western-blotting的應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測肺癌組織上皮鈣粘蛋白的表達（例3）目的：探討上皮鈣粘蛋白(E-cad)與肺癌及其病理類型之間的相關(guān)性.方法：應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測30例肺癌患者的癌、癌旁和遠癌肺組織及5例肺良性對照標本中E-cad的表達,并對部分表達陰性的標本用免疫組化方法進行驗證.結(jié)果：癌組織、癌旁組織、遠癌組織E-cad的陽性率分別為36.7%、70.O%、96.7%.癌組織陽性率明顯低于癌旁組織，也明顯低于遠癌組織；癌旁組織E-cad陽性率明顯低于遠癌組織。在30例肺癌患者鱗癌、腺癌及腺鱗癌的癌組織中E-cad陽性率分別為33.3%、40.O%、33.3%;鱗癌、腺癌及