實驗室生物安全防護

實驗室安全與管理衛(wèi)檢第2版第四節(jié)實驗室生物安全防護1第四節(jié)實驗室生物安全防護實驗室生物安全防護類型常用生物安全設備個人安全防護用具生物實驗室技術(shù)規(guī)范生物實驗室的消毒與滅菌2實驗室生物安全防護類型實驗室生物安全防護的內(nèi)容包括安全設備、個體防護裝置和措施（一級屏障）；實驗室的特殊設計和建設（分區(qū)、單向氣流）要求（二級屏障）；嚴格的管理制度和標準化的操作程序及規(guī)程（三級屏障）不同生物安全防護等級的實驗室其具體要求各不相同。3（一）BSL-1實驗室1、針對對象Ⅰ級微生物類別，不引起人或動物疾病的微生物2、基本要求建設選址方面無特殊要求不需要安裝生物安全柜等防護設備應能防止昆蟲和嚙齒動物等進入在可以開啟的窗戶上安置紗窗應配備消毒設備在靠近實驗室出口處設立洗手池地面光滑無縫，臺面耐熱、耐腐蝕、耐水3、操作規(guī)范不需要制訂特殊的安全操作規(guī)程如用于教學的普通微生物實驗室等。檢測大腸桿菌、枯草桿菌41、針對對象Ⅱ級微生物，公共衛(wèi)生、臨床、醫(yī)院的診斷實驗室2、基本要求除滿足BSL-1實驗室的全部要求之外配備高壓蒸汽滅菌器、化學消毒裝置等消毒滅菌設施安裝不低于II級的生物安全柜實驗室的門能自動關(guān)閉實驗室應配備洗眼裝置、噴淋裝置等需制定專門的安全操作規(guī)程（二）BSL-2實驗室

如麻疹病毒、沙門氏菌、乙型肝炎病毒、HIV血清學檢測等

51、針對對象Ⅲ級微生物、新發(fā)傳染病和大容量或高濃度的、具有高度氣溶膠擴散危險的Ⅱ級微生物2、基本要求除滿足BSL-1、2實驗室的要求之外獨立建筑物或者在建筑物中自成隔離區(qū)在主實驗室內(nèi)設置Ⅲ級生物安全柜設置不產(chǎn)生蒸汽的高壓滅菌鍋或其他消毒裝置實驗室應明確劃分為清潔區(qū)、半污染區(qū)和污染區(qū)安裝獨立的通風空調(diào)系統(tǒng)以控制實驗室氣流方向和壓強梯度實驗記錄等資料通過傳真機等發(fā)送至實驗室外不得將任何未經(jīng)消毒滅菌的材料帶出實驗室制定更加嚴格的生物安全操作規(guī)范（三）BSL-3實驗室多集中在北京，上海，2004年建成我國首個移動式P3實驗

結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、鼠疫桿菌、炭疽桿菌、Q熱病原體、HIV(血清學檢測除外)、立克次氏體等61、針對對象Ⅳ級微生物。實驗室隸屬于國家或衛(wèi)生主管機構(gòu)。2、基本要求除滿足BSL-1、2和3級生物安全實驗室的要求之外分安全柜型實驗室和穿著正壓服型實驗室安全柜型實驗室中所有操作均在Ⅲ級生物安全柜中進行正壓服型實驗室中工作人員必須穿著特殊的正壓服式保護服裝設立在獨立建筑物內(nèi)，且該建筑應遠離市區(qū)制定最嚴格的操作規(guī)范（四）BSL-4實驗室魔鬼式、全封閉式實驗室，全球50個，我國僅中科院武漢病毒研究所有1個，中國農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所，在建中

黃病毒、埃博拉病毒、中歐蜱傳腦炎病毒7病源一級屏障二級屏障三級屏障P1BSL—1不會引發(fā)健康成人疾病不要求開放實驗臺、洗手池標準的微生物操作，無特殊操作規(guī)范P2BSL—2人類病源菌，因皮膚傷口、吸入、黏膜曝露而發(fā)生危險1級、2級生物安全柜實驗服、手套、若需要則采取面部保護措施BSL-1外加：高壓滅菌鍋BSL—1操作外加：1、限制進入2、有生物危險警告標志3、“銳器”安全措施4、生物安全手冊，其中規(guī)定廢物消毒和醫(yī)療觀察P3BSL—3內(nèi)源性和外源性病源，可通過氣溶膠傳播，能導致嚴重后果或生命危險1級、2級生物安全柜保護性實驗服、手套、若需要則采取呼吸保護措施BSL-2外加：1、和進入走廊隔開2、雙門進入，門自動關(guān)閉3、排出的空氣不循環(huán)4、實驗室內(nèi)負壓BSL-3BSL-2操作外加：1、控制進入2、所有廢物消毒3、洗滌前，實驗服消毒4、有基礎(chǔ)血清P4BSL—4對生命有高度危險的危險性病源或外源性病源：致命、通過氣溶膠而致實驗室感染：或未知傳播風險的有關(guān)病源3級生物安全柜或1級、2級生物安全柜加全身的、供應空氣的正壓防護服BSL3外加：1、單獨建筑或隔離區(qū)域2、有供氣系統(tǒng)、排氣系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、消毒系統(tǒng)3、其他有關(guān)要BSL3操作外加：1、進入前換衣服2、出實驗室前淋浴3、帶出設施的所有材料消毒8BSL-1BSL-2BSL-3正壓服型實驗室安全柜型實驗室91、ABSL-1適用于飼養(yǎng)大多數(shù)經(jīng)過檢疫的儲備實驗動物(靈長類除外)，以及專門接種了危險度Ⅰ級微生物的動物。要求應用微生物學操作技術(shù)規(guī)范(GMT)。2、ABSL-2適用于專門接種了危險度Ⅱ級微生物的動物。（五）實驗動物設施的生物安全防護實驗室103、ABSL-3適用于接種危險度Ⅲ級微生物的動物，或根據(jù)危險度評估結(jié)果來確定。所有系統(tǒng)、操作和規(guī)程每年都需要重新檢查及認證。4、ABSL-4適用于接種危險度Ⅲ級微生物的動物，或根據(jù)危險度評估結(jié)果來確定。所有系統(tǒng)、操作和規(guī)程每年都需要重新檢查及認證。11動物設施的防護水平的實驗操作和安全設備匯總

危害程度分類防護水平實驗室操作和安全設施第四類ABSL-1限制出入，穿戴防護服和手套。第三類ABSL-2ABSL-1的操作內(nèi)容加上,危險警告標志。可產(chǎn)生氣溶膠的操作應使用Ⅰ級或Ⅱ級BSC。廢棄物和飼養(yǎng)籠具在清洗前先清除污染。第二類ABSL-3ABSL-2的操作內(nèi)容加上,進入限制,所有操作均在BSC內(nèi)進行，并穿著專用特殊防護服。第一類ABSL-4ABSL-3的操作內(nèi)容加上,嚴格限制出入,進入前更衣,配備Ⅲ級BSC或正壓防護服,離開時淋浴,所有廢棄物在清除出設施前需先清除污染。12常用生物安全設備實驗室安全設備主要有生物安全柜高壓滅菌器離心機負壓柔性薄膜隔離裝置洗眼器13（一）原理（二）分類及特點

（三）使用要求（四）維護校驗一、生物安全柜

biologicalsafetycabinet,BSC

（一）原理

利用高效空氣過濾器對空氣中微小粒子的阻留特性，結(jié)合負壓環(huán)境和專門設計的氣體流動模式，實現(xiàn)對危害性生物氣溶膠的屏蔽15

（二）分類及特點BSC有三個級別，即BSC-Ⅰ、BSC-Ⅱ（A1、A2、B1、B2）和BSC-ⅢⅢ級為密閉袖套操作，其余為前開口操作。16BSC-ⅠBSC-Ⅰ級生物安全柜原理圖A前開口B可視窗C排風HEPA過濾器D壓力排風系統(tǒng)特點：為人和環(huán)境提供保護，但進入空氣未過濾，無法有效保護操作的標本和材料。17Al、A2、Bl

和B2型無菌空氣經(jīng)工作臺面，提供個體防護，和臺面物品不受污染?？捎糜诓僮魑ｋU度

Ⅱ

級和Ⅲ級的感染性物質(zhì)在使用正壓防護服的條件下，可用于操作Ⅳ級的感染性物質(zhì)四種類型區(qū)別：排風、氣體循環(huán)、氣流方向等不同A前開口；B可視窗口；C排風HEPA過濾器；D后面的壓力排風系統(tǒng)；E送風HEPA過濾器；F風機BSC-II18BSC-Ⅲ為負壓封閉式操作環(huán)境，由一個外置的專門的排風系統(tǒng)控制氣流操作人員通過固定在安全柜窗口的橡膠手套，進行工作臺面的操作有可滅菌的、裝有HEPA過濾排風裝置的傳遞箱與一個雙開門的高壓滅菌器相連接，并用它來清除進出安全柜的所有物品的污染適用于三級和四級生物安全水平的實驗室。用于操作危險度Ⅲ、Ⅳ級生物因子19201、生物安全柜的安裝要求清潔環(huán)境，遠離人員、物品流動大的地方。

遠離門和窗。側(cè)面留有30cm的間距。預留出30-35cm空間連接管道，外接的排氣口要比樓層高2米。專用電源（三）使用要求212、生物安全柜的使用1.正確安裝，確保安全柜與外部排風系統(tǒng)壓力平衡，保證安全柜處于正常工作狀態(tài)。2.定期維護和檢測，確保安全性。3.注意保潔，每天做完實驗后，清除所有廢棄物，再用75%酒精消毒。4.一般濾膜有5-10年使用壽命，在儀器壓力表顯示壓力為50%時候，需更換濾膜。223、操作規(guī)范1)操作人員:維持生物安全柜開口處氣流的完整性。雙臂應垂直緩慢進出安全柜。進入后等待約1min，再操作。必需的物品提前置于安全柜內(nèi)，減少雙臂進出次數(shù)。2)生物安全柜運行:A1及A2型，不使用時可以關(guān)閉。B1和B2型始終保持空氣流動以維持房間空氣平衡。開始工作前和完成工作后，應運行數(shù)分鐘排出污染空氣。3)物品放置:①生物安全柜前后氣格柵不被阻擋;②安全柜內(nèi)物品應70%酒精表面消毒;③物品應盡可能地放在工作臺后部，可產(chǎn)生氣溶膠的設備靠后部放置;④盛裝生物危害性廢棄物的物品，放在安全柜內(nèi)某一側(cè)，不應放在柜外面;⑤工作臺面上的實驗操作應該按照從清潔區(qū)到污染區(qū)的方向進行。干凈的物品理想的工作臺擺放原則清潔——污染區(qū)在工作臺面上的實驗操作應該按照從清潔區(qū)到污染區(qū)的方向進行

被污染的區(qū)域廢棄物托盤垃圾袋4)紫外燈:每周對紫外燈進行清潔，避免灰塵和污垢影響殺菌效果。定期檢查紫外線的強度，操作時關(guān)閉紫外燈，實驗前、后開啟20-30min。5)明火:避免使用明火對氣流產(chǎn)生影響。用微型燃燒器對接種環(huán)滅菌。6)溢出物處理:發(fā)生感染性物品溢出時，在安全柜工作狀態(tài)下，用有效消毒劑立即進行清理，盡可能減少氣溶膠的生成。所有接觸溢出物品的材料都要進行消毒或高壓滅菌。7)保持潔凈:在實驗結(jié)束時，所有物品清除表面污染后移出安全柜。擦拭生物安全柜的內(nèi)部表面污染。用70%酒精消毒。8)個人防護:在進行一級和二級生物安全水平的操作時，可穿普通實驗服。在進行三級和四級生物安全水平操作時，使用前面加固處理的反背式實驗隔離衣。手套應套在隔離衣的外面，可以戴加有松緊帶的套袖來保護操作人員的手腕。有些操作還需戴口罩和安全眼鏡。9)警報器:生物安全柜采用兩種警報方式，窗式警報器提示滑動窗移到適宜的位置；氣流警報器表明正常氣流模式受到了干擾，立刻停止工作，并通知實驗室主管。

在進行維護、更換過濾器、性能測試、以及氣體消毒以前，應使用消毒劑清除所有內(nèi)部工作表面和暴露內(nèi)表面的污染。評估內(nèi)容：安全柜的完整性、HEPA過濾器的泄漏、向下氣流的速度、正面氣流的速度、負壓/換氣次數(shù)、氣流的煙霧模式以及警報和互鎖系統(tǒng)進行測試。還可選擇進行漏電、光照度、紫外線強度、噪聲水平以及振動性的測試。（四）維護校驗27將工作空間用透明聚氯乙烯(PVC)完全包裹起來懸掛在鋼架上，隔離裝置始終維持負壓。入口處的空氣經(jīng)一個HEPA過濾器過濾，出口處經(jīng)兩個HEPA過濾器過濾，可直接將空氣排到建筑物外無生物安全柜的現(xiàn)場，采用柔性薄膜隔離裝置來進行高危險生物體(危險度Ⅲ級或Ⅳ級)的操作二、負壓柔性薄膜隔離裝置281.實驗服、隔離衣、連體衣、圍裙2.護目鏡、安全眼鏡和面罩3.口罩及防毒面具4.手套5.鞋個人安全防護用具P3P429（一）標本的安全操作1.標本收集容器堅固，防止意外破損。標本不得超過總體積的50%，無泄漏，外部無殘留。粘貼標簽，要求或說明書與標本分開放置，并置于防水袋中。2.標本運輸使用可高壓滅菌或耐受化學消毒劑的二級容器，固定標本容器并保持直立運輸。3.標本處理接收大量標本的實驗室應安排專門的房間或空間。工作人員了解標本的潛在危害和防護方法，掌握破碎或泄漏容器的處理方法。內(nèi)層容器需在生物安全柜內(nèi)打開，并準備好消毒劑。生物實驗室技術(shù)規(guī)范30（二）實驗室儀器和器具操作1.移液管和移液器312.離心機離心桶的裝載、平衡、密封、打開在安全柜中進行。每次使用后要及時清除離心桶、轉(zhuǎn)子和離心機腔的污染323.攪拌器、振蕩器、混勻器和超聲波破碎儀的使用

確認儀器正常運轉(zhuǎn)。建議使用聚四氟乙烯（PTFE）器皿。應有防護裝置，有條件在生物安全柜里，覆蓋塑料罩操作。在操作結(jié)束后，應在生物安全柜里開啟容器。使用超聲波破碎儀時，應有耳部聽力保護裝置。334.冰箱冰箱、低溫冰箱和固體干冰盒要定期除霜和清掃。破裂的安瓿、凍存管等要及時清除，應配戴面部保護裝置并戴手套，清掃后，進行表面消毒處理。冰箱內(nèi)容器有清楚的標簽（內(nèi)容物的科學命名、貯存日期和貯存人），無標簽及過期材料應高壓滅菌后丟棄。對于冰箱內(nèi)的儲存物應有詳細的目錄。除非有防爆措施，嚴禁將易燃液體保存在冰箱里，冰箱的門上應張貼這方面的注意事項。345.玻璃器皿和銳器盡可能用塑料制品代替玻璃制品。用巴斯德塑料吸管代替玻璃吸管減少使用注射器和針頭，必須使用時采用銳器安全裝置。嚴禁給用過的針頭戴護套。35安瓿開啟：首先消毒安瓿的外表面，再用砂輪在安瓿外表面的棉塞或纖維塞中部挫一劃痕，手里墊一塊酒精浸透的棉花再握住安瓿，輕輕地移去安瓿頂部并將其按污染物處理。如果棉塞或纖維塞留在安瓿上，則將其用滅菌鑷子除去。向安瓿內(nèi)緩慢地加入液體以重懸內(nèi)容物，避免產(chǎn)生泡沫。安瓿儲存：不得將裝有感染性物品的安瓿侵入液氮，可將感染性物質(zhì)真空冷凍干燥后超低溫保存。從冷藏處取出安瓿時要進行眼睛和手的防護6.

裝有凍干傳染性物質(zhì)安瓿開啟與儲存36(1)血樣采集:由受過培訓的人員采集，戴手套操作。檢驗申請單放在防水袋或信封內(nèi)，不應打開袋子。(2)血清分離:操作人員經(jīng)過嚴格培訓，操作時戴手套、眼睛和粘膜保護裝置。操作中避免或盡量減少氣溶膠的產(chǎn)生，不得傾倒。廢棄標本管需高壓滅菌。操作前應準備相應的消毒劑，用于及時處理噴濺和溢出的標本。(3)涂片、蓋玻片、組織及組織切片:用于顯微鏡觀察血液、唾液等標本所使用的載玻片、蓋玻片、染色及洗液等廢棄物均經(jīng)消毒液浸泡或高壓滅菌后再丟棄。組織標本應用甲醛或多聚甲醛固定，避免冷凍切片。如果必須進行冷凍切片，應當使用安全罩，戴安全防護面罩。清除污染時，儀器溫度要求升至室溫。7.

感染性物品操作37(4)朊蛋白（prion）相關(guān)組織:朊病毒的抵抗力很強，一旦發(fā)生污染清除困難，故操作的實驗室應使用專用的設備，不能共享。所有的操作都應在生物安全柜里進行。必須穿一次性的實驗室保護服（罩衫和圍裙）和戴手套（病理學操作者要在兩層橡膠手套之間戴鋼網(wǎng)手套）。使用一次性的塑料器皿取代玻璃器皿。不應使用組織處理機，可代之以塑料的廣口瓶和大口杯。使用過的鋼網(wǎng)手套和Kevlar手套在內(nèi)的非一次性器械必須滅菌后方可再次使用。朊蛋白對紫外線不敏感，安全柜用甲醛蒸汽處理高效空氣過濾器（HEPA）在拆除后應用最低達1000℃的溫度焚燒。38（三）個人行為要求個人物品、服裝、食品和飲料只應存放于非實驗室區(qū)域內(nèi)指定的專用處。實驗室內(nèi)禁止吸煙、喝水、吃東西。禁止在工作區(qū)內(nèi)使用化妝品和處理隱形眼鏡。長發(fā)應束在腦后。在工作區(qū)內(nèi)不應配戴戒指、耳環(huán)、腕表、手鐲、項鏈和其他珠寶

39（一）不同設備與物品的消毒方法（二）消毒滅菌操作與效果監(jiān)測（三）實驗室廢棄物處理要點生物實驗室的消毒與滅菌40（一）不同設備與物品的消毒方法1、生物安全柜—實驗完畢，生物安全柜內(nèi)所有物品(包括儀器設備)都應進行消毒，并從生物安全柜內(nèi)取出。—用有效氯2000mg/L的含氯消毒劑溶液擦拭臺面、內(nèi)壁和前后面玻璃，保持完全濕潤30～60分鐘?！_啟紫外線燈照射30～60分鐘?！缓笥们逅c干凈的抹布擦凈，以防消毒液腐蝕。—消毒完畢，逐一關(guān)閉送風和通風設備?！鼡Q過濾器（網(wǎng)）前用甲醛進行熏蒸消毒，然后輕輕取下過濾器（網(wǎng)）裝入專用密閉包裝與容器內(nèi)，容器外表面消毒后由專車運至指定單位焚燒處理。412、儀器設備—局部輕度污染。用有效氯1000-2000mg/L擦拭，保持濕潤30-60分鐘；貴重或精密儀器用2%戊二醛擦拭30-60分鐘（按制造商說明），消毒完畢用清水與干凈的布擦凈；緊急時對非芽孢污染儀器設備用75%乙醇溶液擦拭三遍?！x心管未密閉、試管破裂等液體外溢時。用2%戊二醛擦拭離心機內(nèi)部，保持濕潤至少60分鐘（按制造商說明）。—有內(nèi)腔的或嚴重污染的儀器設備（如受細胞、培養(yǎng)液、體液或血液等污染），整機裝入專用密閉包裝與容器內(nèi)，容器外表面消毒后由專車運至指定單位用環(huán)氧乙烷消毒?！璨僮鞑煌牟≡⑸锴啊⒃O備維修前、出現(xiàn)重大污染或意外暴露事故后，應用甲醛或過氧乙酸熏蒸消毒。

423、感染性材料與器材—使用后丟入專用密閉收集袋與容器內(nèi)，連同包裝與容器一起經(jīng)壓力蒸汽121℃作用20-30分鐘?！蟮娜萜鞅砻嬗糜行?000mg/L含氯消毒液消毒，保持完全濕潤60分鐘；如遇細胞、培養(yǎng)液、體液或血液等污染，有效氯含量加大至5000mg/L作用60分鐘。4、物體表面—用有效氯1000-2000mg/L含氯消毒液擦拭消毒，保持完全濕潤30～60分鐘后用清水去除消毒液殘留；如有細胞、培養(yǎng)液、體液或血液等污染，有效氯含量加大至5000mg/L作用60分鐘。435、防護用品—除防護眼鏡與呼吸器外均使用一次性防護用品?！看螌嶒灲Y(jié)束后離開實驗室前，脫下防護用品進行消毒，有明顯污染時隨時消毒?！淮涡苑雷o用品使用后丟入專用密閉收集袋內(nèi)，經(jīng)壓力蒸汽121℃作用20-30分鐘?！雷o眼鏡在2000mg/L有效氯溶液中浸泡60分鐘?！粑饔铆h(huán)氧乙烷消毒或按制造商提供的方法消毒，消毒后更換呼吸過濾部分。446、檢驗記錄—應通過傳真機、計算機等手段發(fā)送至實驗室外?！廴镜臋z驗原始記錄等送出實驗室前用壓力蒸汽121℃作用20分鐘，快排干燥；大量的檢驗原始記錄等可采用密封包裝后外送專業(yè)單位進行輻照或環(huán)氧乙烷消毒。7、污水消毒—所有實驗污水必須經(jīng)過消毒處理并達到標準后方可排放；—污水排放標準參照國家標準《醫(yī)療機構(gòu)水污染排放標準》（GB18466-2005）執(zhí)行。458、手的消毒—消毒方法。用肥皂流水洗手1～2分鐘，擦干后用75%乙醇、3000-5000mg/L有效碘溶液或經(jīng)衛(wèi)生部批準的手消毒劑消毒手部1～3分鐘，然后用清水沖洗，用自動干手機將手吹干或用消毒紙巾、紗布或毛巾擦干?！⒁馐马?。水龍頭、皂液與手消毒液均應采用非手觸方式。46（二）消毒滅菌操作與效果監(jiān)測1、壓力蒸汽滅菌器物理監(jiān)測：每次消毒用留點溫度計作溫度監(jiān)測并記錄作用時間，代表物理參數(shù)?；瘜W監(jiān)測：

-每包外用化學指示膠帶監(jiān)測，是否經(jīng)過滅菌處理；

-大包或難消毒物品包，中央用包內(nèi)化學指示劑監(jiān)測，根據(jù)顏色變化判斷是否達到滅菌條件。生物監(jiān)測：

每月用生物指示劑監(jiān)測，嗜熱脂肪芽孢桿菌（ATCC7953)生物指示劑，監(jiān)測后應置56℃培養(yǎng)24～48h后觀察。

472、紫外線殺菌燈-

操作方法：*無人條件下用懸吊式或移動式照射，30W，1m處輻照強度70μW/cm2，每m3不少于1.5W，照射時間≥30分鐘。-注意事項：*保持紫外線燈表面清潔，每兩周用酒精棉球擦拭一次*室內(nèi)保持清