第五章細(xì)胞工程及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用

第五章細(xì)胞工程及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用

細(xì)胞工程(cellengineering)是以細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)為基礎(chǔ)理論，采用原生質(zhì)體、細(xì)胞或組織培養(yǎng)等試驗(yàn)方法或技術(shù)，在細(xì)胞水平上研究改造生物遺傳特性，以獲得具有新的性狀的細(xì)胞系或生物體以及生物的次生代謝產(chǎn)物，并發(fā)展有關(guān)理論和技術(shù)方法的學(xué)科。細(xì)胞工程的核心技術(shù)：細(xì)胞培養(yǎng)與繁殖目的：獲得新性狀、新個(gè)體、新物質(zhì)一細(xì)胞工程的定義第一節(jié)、細(xì)胞工程的概念與研究范疇

二細(xì)胞工程的研究范疇細(xì)胞融合細(xì)胞拆分動物細(xì)胞與組織培養(yǎng)植物細(xì)胞與組織培養(yǎng)細(xì)胞核移植染色體工程胚胎工程干細(xì)胞與組織工程三、細(xì)胞工程的發(fā)展1動物細(xì)胞工程的發(fā)展2植物細(xì)胞工程的發(fā)展細(xì)胞學(xué)說的建立胚胎學(xué)的發(fā)展分子生物學(xué)的發(fā)展四、細(xì)胞工程的理論基礎(chǔ)五、細(xì)胞工程的基本技術(shù)

植物細(xì)胞工程

植物細(xì)胞工程的基本技術(shù)和理論基礎(chǔ)

植物細(xì)胞工程的理論基礎(chǔ)是：

植物細(xì)胞的全能性植物細(xì)胞工程常用的技術(shù)是植物組織培養(yǎng)植物體細(xì)胞雜交概念：細(xì)胞的全能性是指生物體的細(xì)胞具有使后代細(xì)胞形成完整個(gè)體的潛能。原因：是生物體的每一個(gè)細(xì)胞都含有該物種所特有的全套遺傳物質(zhì)及發(fā)育為完整個(gè)體所必需的全部基因。細(xì)胞的全能性

當(dāng)植物細(xì)胞脫離了原來所在植物體的器官或組織而處于離體狀態(tài)時(shí)，在一定的營養(yǎng)物質(zhì)、激素和其他外界條件的作用下，就可能表現(xiàn)出全能性，發(fā)育成完整的植株。在生物的個(gè)體發(fā)育中，由于基因在特定時(shí)間和空間下選擇性地表達(dá)而形成不同器官，因此，要實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的全能性，首先必須使生物體的細(xì)胞處于離體狀態(tài)。受精卵的全能性最高；其次是生殖細(xì)胞（尤其是卵細(xì)胞）；體細(xì)胞的全能性比生殖細(xì)胞低得多。

①從健康植株的特定部位或組織，如根、莖、葉、花、果實(shí)、胚珠、花藥和花粉等，選擇用于組織培養(yǎng)的起始材料，稱之為外植體。②用一定的化學(xué)藥劑，最常用的有次氯酸鈉，升汞和酒精等對外植體表面消毒，建立無菌培養(yǎng)體系。嚴(yán)格控制無菌條件，這是獲得培養(yǎng)成功的重要一步。②外植體塊在培養(yǎng)基上形成疏松的愈傷組織，由愈傷組織分化出芽并可誘導(dǎo)形成根的小植株。

1）植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)植物組織培養(yǎng)的過程離體的植物器官、組織或細(xì)胞脫分化（又叫去分化）愈傷組織（排列疏松而無規(guī)則，高度液泡化的呈無定形狀態(tài)的薄壁細(xì)胞）再分化根或芽等器官植物體植物組織培養(yǎng)的條件：適宜的養(yǎng)料和激素，適宜的溫度和無菌條件離體的植物器官、組織或細(xì)胞愈傷組織根芽植物體脫分化再分化脫分化由高度分化的植物器官、組織或細(xì)胞產(chǎn)生愈傷組織的過程，稱為植物細(xì)胞的脫分化。再分化脫分化產(chǎn)生的愈傷組織繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)又可以重新分化成根或芽等器官，這一過程稱為植物細(xì)胞的再分化。二、植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)過程相關(guān)問題1、在植物組培過程中，為什么要進(jìn)行一系列的消毒，滅菌，并且要求無菌操作？2、為什么切取胡蘿卜根的形成層，其他部分也能培養(yǎng)成小植株嗎？植物體細(xì)胞雜交的概念將不同種植物的體細(xì)胞，在一定條件下融合成雜種細(xì)胞，并把雜種細(xì)胞培育成新的植物體的技術(shù)。（不同種生物之間存在著生殖隔離，所以用傳統(tǒng)的有性雜交方法是不可能做到這一點(diǎn)的）相關(guān)問題（1）要想讓兩個(gè)來自不同植物的體細(xì)胞融合在一起，遇到的第一個(gè)障礙是什么？（2）有沒有一種溫和的去細(xì)胞壁的方法？（3）為什么兩個(gè)原生質(zhì)體能發(fā)生融合，這與細(xì)胞膜的什么特性有關(guān)？（4）如果兩個(gè)來源不同的原生質(zhì)體發(fā)生融合形成了雜種細(xì)胞，下一步該對此細(xì)胞做何種處理？（5）如何將雜種細(xì)胞培育成雜種植株？植物體細(xì)胞雜交過程植物細(xì)胞A植物細(xì)胞B去掉細(xì)胞壁去掉細(xì)胞壁原生質(zhì)體A原生質(zhì)體B原生質(zhì)體融合雜合的原生質(zhì)體再生出細(xì)胞壁雜種細(xì)胞細(xì)胞分裂分化發(fā)育愈傷組織雜種植株植物體細(xì)胞雜交過程原生質(zhì)體制備（酶解法去細(xì)胞壁）原生質(zhì)體融合（人工誘導(dǎo)）

雜種細(xì)胞的篩選和培養(yǎng)（形成愈傷組織）雜種植株的再生與鑒定物理法：離心、振動、電刺激等化學(xué)法：聚乙二醇等試劑纖維素酶、果膠酶等問題為什么“番茄—馬鈴薯”超級雜種植株沒有如科學(xué)家所想像的那樣，地上長番茄、地下結(jié)馬鈴薯？主要原因是：生物基因的表達(dá)不是孤立的，它們之間是相互調(diào)控、相互影響的，所以馬鈴薯—番茄雜交植株的細(xì)胞中雖然具備兩個(gè)物種的遺傳物質(zhì)，但這些遺傳物質(zhì)的表達(dá)受到相互干擾，不能再像馬鈴薯或番茄植株中的遺傳物質(zhì)一樣有序表達(dá)，雜交植株不能地上長番茄、地下結(jié)馬鈴薯就是很自然的了。問題自然界中有一種含有葉綠體的原生動物──眼蟲，說明植物的細(xì)胞器同樣可以在某些動物細(xì)胞中存活，請?zhí)接懀簞游锛?xì)胞與植物細(xì)胞之間可以實(shí)現(xiàn)雜交嗎？如果理論上可行，請?jiān)O(shè)計(jì)出具體實(shí)驗(yàn)方案。異想天開植物細(xì)胞工程的實(shí)際應(yīng)用繁殖植物的新途徑微型育種作物脫毒人工種子育種新方法單倍體育種誘導(dǎo)突變體細(xì)胞產(chǎn)物的工廠化生產(chǎn)概念：應(yīng)用組織培養(yǎng)技術(shù)，快速繁殖植物（也叫快速繁殖技術(shù)）原理：植物細(xì)胞的全能性優(yōu)點(diǎn)：繁殖率高，可大批量生產(chǎn)取材少培養(yǎng)周期短保持優(yōu)良性狀微型繁殖作物脫毒病毒在作物體內(nèi)逐年積累，會導(dǎo)致作物產(chǎn)量降低，品質(zhì)變差分生區(qū)附近（莖尖、根尖）的病毒極少，甚至沒有采用莖尖進(jìn)行組織培養(yǎng)人工種子結(jié)構(gòu)：人工薄膜+胚狀體（不定芽、頂芽、腋芽）優(yōu)點(diǎn)：不受氣候、季節(jié)、地域的限制保留優(yōu)良性狀時(shí)間短，占地少技術(shù)：組織培養(yǎng)原理：細(xì)胞全能性養(yǎng)分、無機(jī)鹽、有機(jī)碳源、農(nóng)藥、抗生素、有益菌生長調(diào)節(jié)劑單倍體育種方法：花藥離體培養(yǎng)技術(shù)：組織培養(yǎng)獲得單倍體秋水素處理單倍體的幼苗，使染色體加倍優(yōu)點(diǎn)：明顯縮短了育種年限后代穩(wěn)定遺傳突變體的利用利用組織培養(yǎng)時(shí)，分裂狀態(tài)的細(xì)胞易受培養(yǎng)條件和外界壓力（如射線，化學(xué)物質(zhì)等）的影響而產(chǎn)生突變的原理，誘導(dǎo)并篩選出對人類有用的突變體。細(xì)胞產(chǎn)物的工廠化生產(chǎn)紅豆杉與紫杉醇人參皂甘的生產(chǎn)

植物細(xì)胞培養(yǎng)是指在離體條件下將愈傷組織或其他易分散的組織置于液體培養(yǎng)基中，將組織振蕩分散成游離的懸浮細(xì)胞，通過繼代培養(yǎng)使細(xì)胞增殖來獲得大量細(xì)胞群體的方法。

植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)(PCTC)目前，植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品、化妝品、香料等領(lǐng)域廣泛用于大規(guī)模生產(chǎn)有價(jià)值的產(chǎn)品。小規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)通常在培養(yǎng)瓶中完成，而大規(guī)模的培養(yǎng)可在發(fā)酵罐中進(jìn)行。

植物細(xì)胞培養(yǎng)基通常包括無機(jī)鹽、碳源、維生素、生長調(diào)節(jié)素和有機(jī)添加劑等。無機(jī)鹽類包括：無機(jī)鹽濃度一般為多少？微量元素主要包括碘、硼、錳、鋅、鉬、銅、鈷、鐵等。

碳源和能源維生素植物細(xì)胞的生長都需要硫胺素。可在植物細(xì)胞培養(yǎng)基中加入煙酸、吡哆醇、泛酸、生物素和葉酸等。原生質(zhì)體培養(yǎng)通常需要大多數(shù)必需維生素。1、植物細(xì)胞培養(yǎng)基的組成

植物生長激素大多數(shù)植物細(xì)胞培養(yǎng)基中都含有天然的或合成的植物生長激素。生長激素包括了植物生長素、細(xì)胞激動素、赤霉素和脫落酸等四大類。有機(jī)氮源通常采用的有機(jī)氮源有蛋白質(zhì)水解物、谷氨酰胺或氨基酸混合物等。

有機(jī)酸加入丙酮酸，或者檸檬酸、蘋果酸和琥珀酸等三羥酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，能夠保證植物細(xì)胞在以銨鹽作為單一氮源的培養(yǎng)基上生長，并且使細(xì)胞對鉀鹽的耐受能力至少提高到10mmol/l。除此之外，這些有機(jī)酸還能提高低密度接種的細(xì)胞和原生質(zhì)體的生長。復(fù)合物質(zhì)在植物細(xì)胞的培養(yǎng)過程中，酶母抽提液、麥芽抽提液、椰子汁和水果汁等復(fù)合物質(zhì)通常可以作為細(xì)胞的生長劑。

類型和方法:懸浮培養(yǎng)和固定培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)方法

要求:材料(疏松易碎的愈傷組織,經(jīng)過破碎的頸部組織)

條件:水平震蕩,合適的氣體組成/pH

特點(diǎn):對剪切力敏感結(jié)團(tuán)生長速度慢多泡沫光照無菌培養(yǎng)

圖12-2大規(guī)模植物細(xì)胞固定化裝置含CaCl2的培養(yǎng)基蓋子空氣出口海藻酸鈉+細(xì)胞懸浮液噴嘴無菌空氣入口

大規(guī)模固定化植物細(xì)胞的大規(guī)模固定化原則上可根據(jù)上述方法進(jìn)行，但是不能再用塑料注射器，而需要采用如圖12-2所示的大規(guī)模細(xì)胞固定化裝置進(jìn)行細(xì)胞的固定化。動物細(xì)胞工程

應(yīng)用動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞融合單克隆抗體技術(shù)核移植動物細(xì)胞工程常用技術(shù)人耳鼠“人耳鼠”再出風(fēng)頭

2001年，一只特別的活老鼠在北京引起轟動——這是有著一對紅眼睛的、尾巴長長的、渾身沒毛的小白鼠。值得一提的是，這只小白鼠的背上，竟長著一只幾乎與身子一般大小的“人耳”。這只老鼠背上的“人耳”是由上海市第九人民醫(yī)院副院長、整復(fù)外科主任曹誼林教授利用組織工程技術(shù)復(fù)制出來的。

在京展出的數(shù)天，盡管門票高達(dá)20元，但還是有將近20萬人，心甘情愿地掏錢一睹“人耳鼠”的風(fēng)采。

人耳鼠的出現(xiàn)，透露了怎樣的信息？

1.發(fā)展歷史:20世紀(jì)初，人們不知道神經(jīng)纖維是由神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)向外突出形成的，還是由神經(jīng)細(xì)胞周圍的其他細(xì)胞融合而成的。生物學(xué)家們就這個(gè)問題展開了激烈的爭論。1907年，美國生物學(xué)家哈里森(Harrison)從蝌蚪的脊索中分離出神經(jīng)組織，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培養(yǎng)。蝌蚪的神經(jīng)組織存活了好幾周，并且從神經(jīng)細(xì)胞中長出了神經(jīng)纖維。哈里森的實(shí)驗(yàn)不僅解決了神經(jīng)纖維的起源問題，而且開創(chuàng)了動物組織培養(yǎng)的先河。此后，在許多科學(xué)家的不懈努力下，動物組織培養(yǎng)不斷改進(jìn)并逐漸發(fā)展成為動物細(xì)胞培養(yǎng)。動物細(xì)胞培養(yǎng)2、動物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用和概念：動物細(xì)胞培養(yǎng)就是從動物有機(jī)體中取出相關(guān)的組織,將它分散成單個(gè)細(xì)胞,然后,放在適宜的培養(yǎng)基中,讓這些細(xì)胞生長和增殖.動物細(xì)胞的培養(yǎng)過程

幼齡動物取動物器官和組織剪碎組織胰蛋白酶處理細(xì)胞培養(yǎng)單個(gè)細(xì)胞動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是其他動物細(xì)胞工程技術(shù)的基礎(chǔ)剪碎組織的目的？胰蛋白酶處理的目的？3、動物細(xì)胞培養(yǎng)過程：動物胚胎或幼齡動物的組織、器官細(xì)胞懸浮液胰蛋白酶10代細(xì)胞原代培養(yǎng)50代細(xì)胞傳代培養(yǎng)細(xì)胞株無限傳代細(xì)胞系單個(gè)細(xì)胞加培養(yǎng)液遺傳物質(zhì)未改變遺傳物質(zhì)已改變動物組織細(xì)胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質(zhì)，將細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)起來形成具有一定彈性和韌性的組織和器官。（分解彈性纖維）有關(guān)概念原代培養(yǎng)：從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞為原代細(xì)胞。（分裝前的細(xì)胞培養(yǎng)）傳代培養(yǎng)：將原代細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中取出，配制成細(xì)胞懸浮液，分裝到兩個(gè)或兩個(gè)以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。有關(guān)概念

細(xì)胞株：傳代培養(yǎng)的細(xì)胞一般傳至10代左右細(xì)胞生長停滯，大部分細(xì)胞衰老死亡，少數(shù)細(xì)胞存活到40~50代，這種傳代細(xì)胞為細(xì)胞株。

細(xì)胞系：細(xì)胞株傳代至50代后又出現(xiàn)細(xì)胞生長停滯狀態(tài)，只有部分細(xì)胞由于遺傳物質(zhì)的改變，使其在培養(yǎng)條件下可以無限制傳代，這種傳代細(xì)胞為細(xì)胞系。

細(xì)胞株和細(xì)胞系的區(qū)別：細(xì)胞系的遺傳物質(zhì)改變，具有癌細(xì)胞的特點(diǎn)，失去接觸抑制，容易傳代培養(yǎng)。動物組織細(xì)胞培養(yǎng)要求一體外培養(yǎng)特點(diǎn):

大多數(shù)動物細(xì)胞要附在物體上表面生長，動物細(xì)胞培養(yǎng)對營養(yǎng)要求更嚴(yán)格，除氨基酸、維生素、鹽類、葡萄糖外，還需要血清。對環(huán)境適應(yīng)性差，對環(huán)境敏感，包括：PH、溶解氧、溫度、剪切力等比微生物要求更高。二培養(yǎng)工具:培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)管、多孔培養(yǎng)板等。細(xì)胞培養(yǎng)以玻璃器皿為主。器皿應(yīng)選擇透明度好、無毒、中性硬度玻璃制品。根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞種類要求不同培養(yǎng)瓶的形態(tài)各異，用于細(xì)胞傳代培養(yǎng)的細(xì)胞要求瓶壁厚簿均勻，便于細(xì)胞貼壁生長和觀察，瓶口要大小一致，口徑一般不小于1cm，允許吸管伸入瓶內(nèi)任何部位。

三、培養(yǎng)條件

細(xì)胞在體外培養(yǎng)中所需的條件

與體內(nèi)細(xì)胞基本相同。

【討論】多細(xì)胞動物和人體的細(xì)胞都生活在內(nèi)環(huán)境中，討論以下問題：1.體外培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)需要提供哪些物質(zhì)？提示：充足的營養(yǎng)供給、適宜的溫度、適宜的pH和氣體環(huán)境。2.體外培養(yǎng)的細(xì)胞需要什么樣的環(huán)境條件？提示：無菌、無毒的環(huán)境。1）恒定的溫度:37℃，

維持培養(yǎng)細(xì)胞旺盛生長，必須有恒定適宜的溫度。人體細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)溫度為36.5℃±0.5℃，偏離這一溫度范圍，細(xì)胞的正常代謝會受到影響，甚至死亡。培養(yǎng)細(xì)胞對低溫的耐受力較對高溫強(qiáng)，溫度上升不超過39℃時(shí)，細(xì)胞代謝與溫度成正比；人體細(xì)胞在39-40℃1小時(shí)，即能受到一定損傷，但仍有可能恢復(fù)；在40-41℃1小時(shí)，細(xì)胞會普遍受到損傷，僅小半數(shù)有可能恢復(fù)；41-42℃1小時(shí)，細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷，大部分細(xì)胞死亡，個(gè)別細(xì)胞仍有恢復(fù)可能；當(dāng)溫度在43℃以上1小時(shí)，細(xì)胞全部死亡。低溫下會使細(xì)胞代謝速率降低2）PH：7.2-7.４當(dāng)PH低于6或高于7.6時(shí)的生長會受到影響，甚至死亡。用來檢測PH的變化：紅色--pH7.4，橙色--pH7.0，黃色--pH6.5，藍(lán)紅色--pH7.6，紫色--pH7.8。3)氣體：ＣＯ２有調(diào)節(jié)PH的作用。氣體是人體細(xì)胞培養(yǎng)生存必需條件之一，所需氣體主要有氧氣和二氧化碳。氧氣參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生供給細(xì)胞生長增殖的能量和合成細(xì)胞生長所需用的各種成分。開放培養(yǎng)時(shí)一般把細(xì)胞置于95%空氣加5%二氧化碳混合氣體環(huán)境中。

4）營養(yǎng)—培養(yǎng)基：在保證細(xì)胞滲透壓的情況下，培養(yǎng)液里的成分要滿足細(xì)胞進(jìn)行代謝所需要的各種營養(yǎng)，如包括十幾種必需氨基酸及其他多種非必需氨基酸、維生素、碳水化合物及無機(jī)鹽類等。只有滿足了這些基本條件，細(xì)胞才能在體外正常存活、生長。動物細(xì)胞的培養(yǎng)基一般分為天然、合成、無血清培養(yǎng)基幾種，此外細(xì)胞培養(yǎng)還需要一些常用的溶液。合成培養(yǎng)基

1951年厄爾開發(fā)了供動物細(xì)胞體外生長的人工合成培養(yǎng)基(MEM)。合成培養(yǎng)基的種類相當(dāng)多。合成培養(yǎng)基成分已知，便于對實(shí)驗(yàn)條件的控制。但與天然培養(yǎng)基相比，有些天然的未知成分尚無法用已知的化學(xué)成分所替代，因此，細(xì)胞培養(yǎng)中使用的基礎(chǔ)合成培養(yǎng)基還必須加入一定量的天然培養(yǎng)基成分，以克服合成培養(yǎng)基的不足。最普遍的作法是加入小牛血清。人工合成培養(yǎng)基，如109培養(yǎng)液、DMEM、199、RPMI-1640，IMEM，MEM培養(yǎng)液等。天然培養(yǎng)基直接采用取自動物體液或從組織中提取的成分作培養(yǎng)液，主要有血清、組織提取液、雞胚汁等。血清是天然培養(yǎng)基中最有效和最常用的培養(yǎng)成分。它含有許多維持細(xì)胞生長繁殖和保持細(xì)胞生物學(xué)性狀不可缺少的未知成分。

使用最普遍的天然培養(yǎng)基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多種細(xì)胞生長因子、促貼附因子及其多活性物質(zhì)。與合成培養(yǎng)基合用，能使細(xì)胞碩利增殖生長。常用的動物血清主要有牛血清和馬血清。牛血清分為胎牛血清和犢牛血清，前者來源少，價(jià)格高；后者要求剛產(chǎn)下尚未哺乳的小牛，因?yàn)椴溉楹蟮男∨Ｑ逯锌赡芎懈鼜?fù)雜的成分。血清中已知的成分主要有蛋白質(zhì)、氨基酸、葡萄糖、激素等。蛋白質(zhì)主要是白蛋白和球蛋白。氨基酸是細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的基本成分，氨基酸中有12種是細(xì)胞本身不合成的，必須由培養(yǎng)液提供。激素有胰島素、生長激素和多種生長因子如表皮生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、增殖刺激因子(MSA)、類胰島素生長因子(IGFl、IGF2)等。

水解乳蛋白、膠原是另外兩種較好的天然培養(yǎng)基成分。水解乳蛋白是乳白蛋白的水解產(chǎn)物，呈蛋黃色粉末狀，富含氨基酸。一般配制成0．5％溶液，微酸性。膠原是從動物真皮中提取的，具改善細(xì)胞表面特性促使其附著生長的作用。無血清培養(yǎng)基動物血清成分復(fù)雜，各種生物大小分子混合在一起，有些成分至今尚未搞清楚。血清對細(xì)胞生長很有效，但后期對培養(yǎng)產(chǎn)物的分離、提純以及檢測造會成一定困難。另外高質(zhì)量的動物血清來源有限，成本高，限制了它的大量使用。無血清培養(yǎng)基不加動物血清，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入細(xì)胞生長有效因子，激素等。5)細(xì)胞培養(yǎng)溶液平衡鹽水（BSS）：

Hanks液和Earle液是常用的BSS基礎(chǔ)溶液。PH調(diào)整液：

NaHCO3溶液、HEPES溶液（二羥乙基哌嗪乙烷磺酸）細(xì)胞消化液:

胰蛋白酶溶液．EDTA溶液．膠原酶溶液抗生素溶液：1)青、鏈霉素:每毫升培養(yǎng)液含100U青霉素和100ug鏈霉素.2)卡那霉素：終濃度為50ug/ml培養(yǎng)液。3）制霉菌素：濃度25U/ml，小瓶分裝，每瓶一次用完。6)、無污染環(huán)境

培養(yǎng)環(huán)境無毒和無菌是保證細(xì)胞生存的首要條件。當(dāng)細(xì)胞放置于體外培養(yǎng)時(shí)，與體內(nèi)相比細(xì)胞丟失了對微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代謝物質(zhì)積累等，可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此在進(jìn)行培養(yǎng)中，保持細(xì)胞生存環(huán)境無污染、代謝物及時(shí)清除等，是維持細(xì)胞生存的基本條件。

四細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)施

1、實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)

細(xì)胞培養(yǎng)是一種無菌操作技術(shù)，要求工作環(huán)境和條件必須保證無微生物污染和不受其它有害因素的影響。細(xì)胞培養(yǎng)室和設(shè)計(jì)原則是防止微生物污染和有害因素影響，要求工作環(huán)境清潔、空氣清新，干燥和無煙塵。細(xì)胞培養(yǎng)室的設(shè)計(jì)實(shí)施原則一般是無菌操作區(qū)設(shè)在室內(nèi)較少走動的內(nèi)側(cè)，常規(guī)操作和封閉培養(yǎng)于一室，而洗刷消毒在另一室。

細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室1.準(zhǔn)備室2.緩沖室

準(zhǔn)備室風(fēng)淋3.培養(yǎng)室培養(yǎng)室

專用于組織細(xì)胞培養(yǎng)的空間，應(yīng)包括更衣間、緩沖間、操作間。內(nèi)設(shè)超凈工作臺、培養(yǎng)箱等細(xì)胞培養(yǎng)的必要設(shè)備，應(yīng)具備紫外消毒、通風(fēng)及溫控設(shè)施。操作間放置凈化工作臺及二氧化碳培養(yǎng)箱、離心機(jī)及倒置顯微鏡等。緩沖間可放置電冰箱、冷藏器及毒好的無菌物品等

風(fēng)淋室：

風(fēng)淋室是生物潔凈室的理想配套設(shè)備，它不僅可以清除人體和物品表面附著的塵埃，減少帶入潔凈室的灰塵量，而且兼有氣閘室的功能，可防止非潔凈空氣的侵入。風(fēng)淋室的板壁采用輕質(zhì)隔熱夾芯鋼板，吹淋板采用進(jìn)口不銹鋼制作，吹淋口方向可調(diào)，風(fēng)淋時(shí)間可在30-99秒間的調(diào)整。風(fēng)淋室可以配合加熱器，冬天可以加熱，溫度可調(diào)，一般控制溫度在30-35℃較為適宜。

超凈工作臺

也稱凈化工作臺，分為側(cè)流式、直流式和外流式三大類。CO2培養(yǎng)箱

哺乳動物離體細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)細(xì)胞一樣,需要在恒足溫度下才能生存,溫差變化一般不應(yīng)超過0.5度，因此培養(yǎng)箱對溫度應(yīng)具有較高靈敏度。

CO2培養(yǎng)箱的優(yōu)點(diǎn)在于能恒定地供應(yīng)一定量的CO2,一般5%即可維持培養(yǎng)液PH值穩(wěn)定。

冰箱細(xì)胞培養(yǎng)的冰箱應(yīng)特別注意清潔，

防止污染。水純化裝置細(xì)胞培養(yǎng)對水的質(zhì)量要求較高。一般需要使用重蒸或三蒸水配置各種培養(yǎng)用液。過濾裝置各種培養(yǎng)用液只能用過濾的方法進(jìn)行除菌消毒處理。微化濾膜濾器是目前應(yīng)用最廣泛的過濾裝置。細(xì)胞冷凍貯存器

細(xì)胞冷凍貯存具有經(jīng)濟(jì)、省力和較好保持細(xì)胞生物學(xué)特性的優(yōu)點(diǎn)，目前各實(shí)驗(yàn)室主要使用液氮容器貯存細(xì)胞。培養(yǎng)器皿

培養(yǎng)器皿包括各種規(guī)格的玻璃、塑料培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)皿，吸管，離心管等。洗刷消毒間：烤箱、消毒鍋、蒸餾水處理器及酸缸等。分析間：顯微鏡、計(jì)算機(jī)及打印機(jī)等。

無菌操作的要領(lǐng)

由于體外培養(yǎng)的細(xì)胞缺乏機(jī)體抗感染功能，所以在一切操作中要努力作到最大限度的無菌，防止污染。超凈工作臺消毒

打開紫外線殺菌燈照射消毒20～30分鐘，然后關(guān)閉紫外燈，打開風(fēng)機(jī)，流入的空氣是經(jīng)過除菌板過濾的空氣，工作臺可保持無菌環(huán)境。洗手

操作時(shí)因整個(gè)前臂伸入工作臺內(nèi)，所以洗手一定要刷洗到肘部，然后用0.2%新潔爾滅或75%的酒精棉球擦拭。

火焰消毒

所使用物品均應(yīng)經(jīng)過燒灼，所用瓶口等開啟或封蓋時(shí)均需迅速旋轉(zhuǎn)過火焰進(jìn)行消毒。

注意金屬器械不能在火焰上燒灼時(shí)間過長。

燒過的用具均要待冷卻后再接觸組織細(xì)胞。

吸取營養(yǎng)液后的吸管不能再經(jīng)火焰燒灼,否則會燒焦形成炭膜,再用時(shí)會將有害物質(zhì)帶入培養(yǎng)液。

合理布局

右手使用方便的用品放右側(cè)，左手使用方便的用品放左側(cè)。酒精燈置于中央，打開的培養(yǎng)液、培養(yǎng)瓶等應(yīng)保持斜立或平放（瓶口長時(shí)間開口直立,易增加落菌機(jī)會）。吸取各種用液應(yīng)分別使用吸管，不能混用。

3.動物細(xì)胞培養(yǎng)的條件1.無菌無毒的環(huán)境2.營養(yǎng)3.溫度和pH4.氣體環(huán)境

應(yīng)該加入哪些物質(zhì)？這些物質(zhì)如何調(diào)配？在使用合成培養(yǎng)基時(shí)通常需加入血清、血漿等天然成分，目的是什么？4.動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用蛋白質(zhì)生物制品的生產(chǎn)如病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體健康細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)健康細(xì)胞用于燒傷病人皮膚移植細(xì)胞的生理、藥理、病理研究

用于篩選抗癌藥物

動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)條件要求:工藝方式:分批流加式半連續(xù)式連續(xù)式

培養(yǎng)技術(shù):懸浮培養(yǎng)技術(shù)貼壁培養(yǎng)技術(shù)微載體培養(yǎng)技術(shù)多孔載體培養(yǎng)技術(shù)微囊化培養(yǎng)技術(shù)中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)植物組織培養(yǎng)和動物細(xì)胞培養(yǎng)的比較比較項(xiàng)目植物組織培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)原理培養(yǎng)基性質(zhì)培養(yǎng)基特有成分培養(yǎng)結(jié)果培養(yǎng)目的細(xì)胞的全能性細(xì)胞增殖固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基蔗糖植物激素葡萄糖動物血清植物體細(xì)胞株、細(xì)胞系快速繁殖、培育無病毒植株獲得細(xì)胞或細(xì)胞分泌蛋白思考：2、為什么選用動物胚胎或幼齡個(gè)體的器官或組織做動物細(xì)胞培養(yǎng)材料？1、動物細(xì)胞培養(yǎng)液的主要成分是什么？較植物組培培養(yǎng)基有何獨(dú)特之處？3、為什么培養(yǎng)前要將組織細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞？4、動物細(xì)胞培養(yǎng)能否像綠色植物組織培養(yǎng)那樣最終培養(yǎng)成新個(gè)體？主要成分：葡萄糖、氨基酸、無機(jī)鹽、維生素和動物血清等。獨(dú)特之處有：1、液體培養(yǎng)基2、成分中有動物血清等因?yàn)檫@些組織或器官上的細(xì)胞生命力旺盛，分裂能力強(qiáng)成塊組織不利培養(yǎng)，分散了做成細(xì)胞懸浮液利于培養(yǎng)不能，動物細(xì)胞培養(yǎng)只能使細(xì)胞數(shù)目增多，不能發(fā)育成新的動物個(gè)體

3）細(xì)胞融合技術(shù)（體細(xì)胞雜交技術(shù)）

細(xì)胞融合是正常的生命活動兩個(gè)細(xì)胞正在融合

受精作用動物細(xì)胞融合動物細(xì)胞融合細(xì)胞A細(xì)胞B雜種細(xì)胞滅活的病毒物理法化學(xué)法仙臺病毒皰疹病毒新城雞瘟病毒用滅活的病毒誘導(dǎo)動物細(xì)胞融合過程細(xì)胞核病毒顆粒細(xì)胞核細(xì)胞融合與融合誘導(dǎo)細(xì)胞融合物質(zhì)誘導(dǎo)劑：仙臺病毒聚乙二醇

電融合誘導(dǎo)細(xì)胞融合的仙臺病毒必須滅活。

細(xì)胞融合概述細(xì)胞融合（cellfusion)，又稱體細(xì)胞雜交（somatichybridiazation），是指兩個(gè)或更多個(gè)相同或不同細(xì)胞通過膜融合形成單個(gè)細(xì)胞的過程。細(xì)胞融合的定義Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在無脊椎動中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞合并現(xiàn)象。1958年日本學(xué)者岡田（Okada）發(fā)現(xiàn)仙臺病毒具有觸發(fā)動物細(xì)胞融合的效應(yīng)。1974年華裔加拿大學(xué)者高國楠創(chuàng)立了聚乙二醇（PEG）化學(xué)融合法。1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞而產(chǎn)生能分泌預(yù)定單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。20世紀(jì)80年代出現(xiàn)了電融合技術(shù)。細(xì)胞融合研究進(jìn)展生物種類細(xì)胞來源成功年代煙草兩個(gè)種間苷藍(lán)——青菜大豆——馬唐草矮牽?！埫婊ù篼湣ㄉ篼湣蠖剐←湣珷颗Ｓ筒恕蠖褂衩住蠖勾蠖埂巴愣勾篼湣Q豆大豆——草香木犀酵母菌——雞大豆——煙草大豆——秋水仙人——胡蘿卜番茄——馬鈴薯人——小鼠葉——葉葉——根愈傷組織——葉葉——花瓣種子——種子葉——懸浮細(xì)胞葉——花瓣葉——懸浮細(xì)胞葉——懸浮細(xì)胞懸浮細(xì)胞——懸浮細(xì)胞葉——根懸浮細(xì)胞——葉原生質(zhì)體——血紅細(xì)胞懸浮細(xì)胞——葉懸浮細(xì)胞——葉腹水癌細(xì)胞——原生質(zhì)體葉——根尖纖維肉瘤細(xì)胞——畸胎瘤細(xì)胞197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972幾種細(xì)胞融合成功的例子植物融合細(xì)胞成長狀態(tài)對比,右瓶為地面融合的細(xì)胞，左瓶中為太空微重力環(huán)境下融合的細(xì)胞

動物細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)使用的小白鼠

動植物細(xì)胞的融合過程植物細(xì)胞融合過程人造小鼠培育過程示意圖細(xì)胞融合的意義理論上說任何細(xì)胞，都有可能通過體細(xì)胞雜交而成為新的生物資源。這對于種質(zhì)資源的開發(fā)和利用具有深遠(yuǎn)的意義。融合過程不存在有性雜交過程中的種性隔離機(jī)制的限制，為遠(yuǎn)緣物種間的遺傳物質(zhì)交換提供了有效途徑。體細(xì)胞雜交產(chǎn)生的雜種細(xì)胞含有來自雙親的核外遺傳系統(tǒng)，在雜種的分裂和增殖過程中雙親的葉綠體、線粒體DNA亦可發(fā)生重組，從而產(chǎn)生新的核外遺傳系統(tǒng)。淋巴細(xì)胞雜交瘤和單克隆抗體的制備。細(xì)胞融合的基本原理顯微鏡下細(xì)胞融合過程融合過程中兩個(gè)細(xì)胞膜從彼此接觸到破裂形成細(xì)胞橋的變化過程圖解用滅活的病毒誘導(dǎo)的動物細(xì)胞融合過程示意圖

細(xì)胞融合的常用方法一、仙臺病毒法仙臺病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合經(jīng)四個(gè)階段：①兩種細(xì)胞在一起培養(yǎng)，加入病毒，在4℃條件下病毒附著在細(xì)胞膜上。并使兩細(xì)胞相互凝聚；②在37℃中，病毒與細(xì)胞膜發(fā)生反應(yīng)，細(xì)胞膜受到破環(huán)，此時(shí)需要Ca2+和Mg2+，最適PH為8.0一8.2；②細(xì)胞膜連接部穿通，周邊連接部修復(fù)，此時(shí)需Ca2+和ATP；④融合成巨大細(xì)胞，仍需ATP。病毒促使細(xì)胞融合的主要步驟如下：兩個(gè)原生質(zhì)體或細(xì)胞在病毒黏結(jié)作用下彼此靠近；通過病毒與原生質(zhì)體或細(xì)胞膜的作用使兩個(gè)細(xì)胞膜間互相滲透，胞質(zhì)互相滲透；兩個(gè)原生質(zhì)體的細(xì)胞核互相融合，兩個(gè)細(xì)胞融為一體；進(jìn)入正常的細(xì)胞分裂途徑，分裂成含有兩種染色體的雜種細(xì)胞。用滅活的病毒誘導(dǎo)的動物細(xì)胞融合過程示意圖

優(yōu)點(diǎn)是易得，用法簡單，融合效果穩(wěn)定。聚乙二醇(PEG)結(jié)構(gòu)為：HOH2C（CH20CH2）nCH2OH，分子量大于200小于6000者均可用作細(xì)胞融合劑。PEG濃度以W/W；如將10克PEG與10mlEagLe氏液混合（假定1ml培養(yǎng)液為1g重)，即成50％PEG溶液。PEG經(jīng)高壓滅菌后，與溫?zé)岬腅ngle氏液混合。通常用分子量低于1000的PEG作融合劑最好，50％PEG溶液能產(chǎn)生最多雜交細(xì)胞。PEG溶液在pH6.0時(shí)細(xì)胞融合率最高。二、聚乙二醇（PEG）法聚乙二醇（PEG）法細(xì)胞融合過程PEG的作用機(jī)理：Kao等認(rèn)為，由于PEG分子具有輕微的負(fù)極性，故可以與具有正極性基團(tuán)的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成H鍵，從而在在質(zhì)膜之間形成分子橋，其結(jié)果是使細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生粘連進(jìn)而促使質(zhì)膜的融合；另外，PEG能增加類脂膜的流動性，也使細(xì)胞的核、細(xì)胞器發(fā)生融合成為可能。

PEG誘導(dǎo)融合的特點(diǎn)：其優(yōu)點(diǎn)是融合成本低，勿需特殊設(shè)備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過程不受物種限制。其缺點(diǎn)是融合過程繁瑣，PEG可能對細(xì)胞有毒害。

聚乙二醇（PEG）法細(xì)胞融合步驟（1）將兩種不同親本細(xì)胞各5×l06混勻；（2）離心沉淀，吸去上清液；（3）加1ml50％PEG溶液，用吸管吹打，使之與細(xì)胞接觸1分鐘；（4）加9ml培養(yǎng)液，離心沉淀，吸去上清液；（5）加5ml培養(yǎng)液，分別接種5個(gè)直徑60mm平皿，每個(gè)平皿加培養(yǎng)液至5ml，37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（6）6—24小時(shí)后，換成選擇培養(yǎng)液篩選雜交細(xì)胞。三、電融合法電融合法是80年代出現(xiàn)的細(xì)胞融合技術(shù)，在直流電脈沖的誘導(dǎo)下，細(xì)胞膜表面的氧化還原電位發(fā)生改變，使異種細(xì)胞粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進(jìn)而質(zhì)膜開始連接，直到閉和成完整的膜，形成融合體。電融合法的優(yōu)點(diǎn)：融合率高、重復(fù)性強(qiáng)、對細(xì)胞傷害??；裝置精巧、方法簡單、可在顯微鏡下觀察或錄像觀察融合過程；免去PEG誘導(dǎo)后的洗滌過程、誘導(dǎo)過程可控性強(qiáng)。電融合的基本過程：細(xì)胞膜的接觸：當(dāng)原生質(zhì)體置于電導(dǎo)率很低的溶液中時(shí)，電場通電后，電流即通過原生質(zhì)體而不是通過溶液，其結(jié)果是原生質(zhì)體在電場作用下極化而產(chǎn)生偶極子，從而使原生質(zhì)體緊密接觸排列成串；膜的擊穿：原生質(zhì)體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖就可以使原生質(zhì)膜擊穿，從而導(dǎo)致兩個(gè)緊密接觸的細(xì)胞融合在一起。

電融合誘導(dǎo)法原理示意圖雜種細(xì)胞的篩選雜種細(xì)胞的篩選原理：兩種親本細(xì)胞融合的混合物中可能有多種類型細(xì)胞，篩選的目的是獲得優(yōu)良的雜種細(xì)胞。1）親本

2）同核體：同源原生質(zhì)體的融合體3）異核體：非同源的原生質(zhì)體的融合體4）多核體：含有雙親不同比例核物質(zhì)的融合體5）異胞質(zhì)體：具有不同胞質(zhì)來源的雜合細(xì)胞。6）核質(zhì)體：有細(xì)胞核而帶有少量細(xì)胞質(zhì)的亞原生質(zhì)體基于酶缺陷型細(xì)胞和藥物抗性所建立的雜種篩選基于營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞所建立的雜種篩選由溫度敏感型細(xì)胞組成的雜種細(xì)胞的篩選具有所需性狀雜種細(xì)胞的篩選常用的雜種細(xì)胞篩選方法植物細(xì)胞篩選方式1）遺傳互補(bǔ)篩選法：利用每一親本貢獻(xiàn)一個(gè)功能正常等位基因，糾正另一親本的缺陷，令雜種細(xì)胞表現(xiàn)正常。如親本1：葉綠體缺陷型親本2：光致死型兩親本在光照下一種死亡，另一種呈白色，融合細(xì)胞長成植株呈綠色，并能成長2）抗性互補(bǔ)篩選法：利用親本細(xì)胞原生質(zhì)體對抗生素、除草劑及其它有毒物質(zhì)抗性差異選擇雜種細(xì)胞。如：親本1：對放線菌素D抗性，但在MS培養(yǎng)基上不能超過50個(gè)世代親本2：對放線菌素D很敏感，但能在MS上生長雜種細(xì)胞能在含有放線菌素的MS培養(yǎng)基上生長，而親本和其它細(xì)胞死亡3）利用物理特性篩選法：根據(jù)親本的原生質(zhì)體大小、顏色、漂浮密度及電泳遷移率、形成的愈傷組織的差異篩選雜種細(xì)胞。親本1：用異硫氰酸熒光素染色原生質(zhì)體親本2：葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體在熒光顯微鏡下，親本1為紅色，親本2為綠色，雜種細(xì)胞可以區(qū)分4）利用生長特性篩選法：利用原生質(zhì)體對培養(yǎng)基成分要求與反應(yīng)的差異選擇雜種細(xì)胞。例如粉蘭煙草與朗氏煙草細(xì)胞原生質(zhì)體均需外源激素才能生長，但其融合細(xì)胞可以產(chǎn)生內(nèi)源激素，在培養(yǎng)基上不需加激素。動物細(xì)胞的篩選方式：1）利用抗藥性篩選系統(tǒng)：利用生物細(xì)胞對藥物敏感性差異篩選雜種細(xì)胞。親本A：對氨芐青霉素敏感，對卡娜霉素不敏感親本B：對卡娜霉素敏感，對氨芐青霉素不敏感雜種細(xì)胞可以在含有兩種抗生素的培養(yǎng)基上生長2）營養(yǎng)互補(bǔ)篩選系統(tǒng)：細(xì)胞在缺乏一種或幾種營養(yǎng)成分時(shí)，不能生長繁殖，即營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞。利用兩種親本細(xì)胞營養(yǎng)互補(bǔ)作用原理可以篩選雜種細(xì)胞。親本A：色氨酸缺陷型親本B：蘇氨酸缺陷型雜種細(xì)胞可以在不含色氨酸和蘇氨酸的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，而親本細(xì)胞均會死亡。3）溫度敏感突變型雜種細(xì)胞的篩選：一般的培養(yǎng)細(xì)胞能在32度到40度的范圍內(nèi)生長，但溫度敏感突變型的細(xì)胞能在高溫或低溫下生長。由此篩選雜種細(xì)胞。親本一：具有卡那霉素抗性但只能在37度左右生長。親本二：高溫敏感突變型，但不能抗卡娜霉素。雜種細(xì)胞能在高溫和含卡娜霉素的培養(yǎng)基上生長。雜種細(xì)胞在植物育種中的應(yīng)用雜種細(xì)胞是一條新的育種途徑，可以產(chǎn)生新經(jīng)濟(jì)性狀的良種?？茖W(xué)家已經(jīng)在禾本科、茄科、豆科、十字花科等植物中得到了雜種再生植株。一些近親植物、有性不親和的組合，如馬鈴薯×番茄等都得到了再生植株。目標(biāo)：地上和地下部兼用種、固氮禾等具有兩種不同優(yōu)勢性狀的新品種。3、細(xì)胞融合技術(shù)

在食品工業(yè)中的應(yīng)用（1）酵母菌的育種（2）氨基酸生產(chǎn)菌的育種（3）酶制劑生產(chǎn)菌株的育種細(xì)胞雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體一、何謂單克隆抗體？什么是抗體？抗體是機(jī)體受抗原刺激后產(chǎn)生的、并能與該抗原發(fā)生特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白。B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體。B淋巴細(xì)胞與抗體

１．B淋巴細(xì)胞受抗原刺激后，可以產(chǎn)生抗體。２．動物體內(nèi)的B淋巴細(xì)胞可以產(chǎn)生百萬種以上的抗體，每種抗體對特定的抗原具有特異性免疫作用。３．每一個(gè)淋巴細(xì)胞只能產(chǎn)生一種抗體。單克隆抗體由單個(gè)B淋巴細(xì)胞經(jīng)過無性繁殖（克?。?，形成基因型相同的細(xì)胞群，這一細(xì)胞群所產(chǎn)生的化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體稱為單克隆抗體。

特點(diǎn)：

特異性強(qiáng)、靈敏度高

只針對某一抗原決定簇單克隆抗體技術(shù)的核心是用骨髓瘤細(xì)胞(myelomacell)與經(jīng)特定抗源免疫刺激的B淋巴細(xì)胞(antigenstimulatedBlymphoblast)融合得到雜交瘤細(xì)胞(hybridomacell)，雜交瘤細(xì)胞既能象骨髓瘤細(xì)胞那樣在體外無限增殖，又具有B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體的能力。因此，單克隆抗體技術(shù)又稱為雜交瘤技術(shù)(hybridomatechnology

）。NielsK.Jerne

G.Kohler

C.Milstein

如何大量生產(chǎn)單克隆抗體？利用淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的功能利用腫瘤細(xì)胞無限增殖的特性利用細(xì)胞融合的技術(shù)將兩種細(xì)胞融合獲得具有淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞特性的雜交瘤細(xì)胞利用動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞二、雜交瘤技術(shù)的基本原理

單克隆抗體制備過程

注射抗原B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞融合、篩選雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)篩選，繼續(xù)培養(yǎng)足夠數(shù)量的、能產(chǎn)生特定抗體的細(xì)胞群體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔單克隆抗體三、雜交瘤細(xì)胞的制備（一）骨髓瘤細(xì)胞選擇及選擇性培養(yǎng)基骨髓瘤細(xì)胞本身不能分泌抗體選擇次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）HAT培養(yǎng)基次黃嘌呤（hypoxanthine，H）氨基喋呤（aminopterin，A）胸腺嘧啶脫氧核苷（thymidine，T）次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）HAT培養(yǎng)基通過抑制瘤細(xì)胞的核苷酸合成，達(dá)到去除未融合瘤細(xì)胞的目的。細(xì)胞有兩條基本途徑合成嘌呤核苷酸，一條是從磷酸核糖、氨基酸、CO2和NH3等化合物開始，葉酸是重要的輔酶，而氨甲蝶呤是葉酸的拮抗劑，可阻斷瘤細(xì)胞通過這一途徑合成核苷酸。另一條途徑是利用已存在的堿基，經(jīng)特異的磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶催化合成核苷酸，如次黃嘌呤經(jīng)過次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）轉(zhuǎn)變?yōu)猷堰屎塑账帷Ｈ诤纤玫牧黾?xì)胞是選擇出來的HGPRT缺陷細(xì)胞株，因此不能在HAT培養(yǎng)基中生長，而且不合成或不分泌免疫球蛋白。只有融合細(xì)胞具有親代雙方的遺傳性能，可在HAT培養(yǎng)基中長期存活與繁殖并分泌抗體。（二）免疫小鼠

免疫程序是取6—8周齡Balb／C雌鼠，基礎(chǔ)免疫2周，靜脈再加強(qiáng)免疫一次，3—5天后用于融合。免疫時(shí)是否采用佐劑和事先處理抗原，要依抗原性的強(qiáng)弱而定。一般來講可溶性抗原用完全佐劑效果較好?？乖客瑯优c抗原強(qiáng)弱有關(guān)，以IgG為例，第一次為loog，第二次為50g，免疫途徑第一次可經(jīng)腹腔注射。對于細(xì)胞性抗原不用佐劑，每次腹腔注射1×l06一1×107。（三）脾細(xì)胞的制備(1)引頸處死小鼠，用酒精消毒體表；(2)無菌條件下取出脾臟，剃除結(jié)締組織和脂肪，用5ml無血清培養(yǎng)液沖洗一次；(3)把脾臟置于已消毒的90一100目不銹鋼網(wǎng)或尼龍紗網(wǎng)中；(4)在脾中部切開一小口，用注射器芯從一端輕輕壓擠，再用無血清培養(yǎng)液沖洗，令細(xì)胞通過紗網(wǎng)，收集入平皿中，或用注射器向脾臟內(nèi)注入3ml無血清培養(yǎng)液，反復(fù)抽吸數(shù)次方法獲取細(xì)胞，再制成細(xì)胞懸液亦可；(5)把細(xì)胞懸液注入50ml離心管中，加l0一20ml培養(yǎng)液：輕輕吹打數(shù)次，室溫中置5分鐘；(6)離心(800一1000轉(zhuǎn)／分)計(jì)數(shù)、備用。（四）細(xì)胞準(zhǔn)備（1）收集骨髓瘤細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)液洗3次(37℃)，計(jì)數(shù)活力細(xì)胞(不少于90％)；（2）收集小鼠脾細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)液洗3次(37℃)，并計(jì)細(xì)胞數(shù)和測定活力細(xì)胞；（3）按1：5或1：10混合脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞后，離心棄去上清，并以消毒濾紙吸凈多余上清。（五）細(xì)胞融合(1)將1ml40％的PEG液一滴滴加入列細(xì)胞團(tuán)中，在60秒內(nèi)加完，同時(shí)并不斷輕微轉(zhuǎn)動離心管或用手指輕彈離心管；(2)在不斷轉(zhuǎn)動離心管中加1ml無血清培養(yǎng)液，60秒鐘內(nèi)加完；(3)于5分鐘內(nèi)慢慢加完20ml無血清培養(yǎng)液；此時(shí)細(xì)胞對機(jī)械損傷非常敏感，(4)離心(800轉(zhuǎn)／分，8分鐘)，去上清，用完全培養(yǎng)液10ml懸浮，輕輕混勻；(5)取96孔板，每孔加50l；(6)取等體積細(xì)胞懸液，向另一96孔板中加50P1；(7)送入5％CO2，溫箱中37℃培養(yǎng)，24小時(shí)后更換成HAT選擇性培養(yǎng)掖。（六）融合后細(xì)胞培養(yǎng)(1)融合后7—10天用HAT培養(yǎng)液半量換液(留一半舊的加一半新的)后每隔2—3天半量換液一次；(2)兩周后可改用HA培養(yǎng)液半量換液，或仍用HAT培養(yǎng)液；(3)2—3周后出現(xiàn)雜交細(xì)胞集落，細(xì)胞個(gè)大、圓且透明；(4)待集落增殖生長至1／3孔時(shí)，應(yīng)進(jìn)行抗體檢測。思考：1、本過程利用了哪些原理？免疫原理，細(xì)胞融合原理和動物細(xì)胞培養(yǎng)原理2、為什么選用小鼠骨髓瘤細(xì)胞與B細(xì)胞融合？這樣融合成