第7章 RNA遺傳 - 副本

分子遺傳學

MolecularGenetics

第7章RNA遺傳

中國醫(yī)科大學

醫(yī)學遺傳學教研室

李福才

2013.3

1第7章RNA遺傳

7.1RNA世界——生命早期的遺傳物質(zhì)

7.2RNA干涉/干擾現(xiàn)象

7.3RNAi對基因表達的作用

7.4RNA編輯RNA遺傳在中心法則中，RNA只是作為一個中間環(huán)節(jié)被描述，真正的遺傳模板是DNA。但是，20世紀70年代發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄酶以后，在Crick修正后的中心法則中，可以看到RNA已不是過去的中間環(huán)節(jié)，而是具有與DNA同等地位的遺傳模板。

然而，RNA編輯、RNA干擾的發(fā)現(xiàn)與研究，更使我們對RNA的遺傳作用刮目相看。

著名的分子生物學家Pennisi指出：“基因占據(jù)生物學的舞臺已經(jīng)數(shù)十年。但最近的工作提出，雖然基因經(jīng)常是掛牌的名角，可它們更像一些木偶。各種蛋白質(zhì)，有時是RNAs，在拉著線，告訴基因在何時何地打開或關(guān)閉”。7.1RNA世界——生命早期的遺傳物質(zhì)

RNA世界假說認為，在生命進化早期沒有蛋白酶，某些RNA序列可以催化RNA的復制。也就是說，RNA是生命早期的唯一遺傳物質(zhì)，它是生命的源頭。

在RNA遺傳的基礎(chǔ)上，才有了后來的DNA與蛋白質(zhì)體系。事實上，RNA的遺傳作用并未在生命的進化中消失，在一定程度，RNA仍在支配著DNA與蛋白質(zhì)的命運。

Johnston等的工作證明，某種RNA分子確實能夠催化RNA復制中的多聚化。

應用NTP及RNA模板的編碼信息，使RNA引物持續(xù)增加14個核苷酸長度，等于RNA螺旋一圈。這種多聚化是RNA模板依賴的，是按照引物的序列、長度，以及RNA模板的信息進行的。證明了引物的3′是在與RNA模板逐一地、嚴格地配對的情況下進行的。結(jié)果，多聚化過程是逼真的；在引物被擴展11個核苷酸的情況下，對此等序列進行了克隆和序列分析，在1100個樣品中有1088個是與模板標準匹配的。如表7.1

Bartel等使用存在于隨機RNA序列的備用池中的RNA-連接酶ribozymes衍生物。某些衍生物能夠使用NTP及RNA模板的部分區(qū)域進行模板指導的引物延伸。這些連接酶衍生物通過與模板的不配對的以特異小段的雜交來識別并催化該引物---模板復合體的RNA復制。從使用的模板的一小段來指導引物延伸來看，這些ribozymes不像復制RNA/DNA的酶的多聚化反應，更類似于末端酶。從上述可知，W.K.Johnston等所描述的RNA復制雖然效率不高，卻是真正的RNA自我復制。因為它不像DNA復制那樣，需要許多蛋白酶來進行加工。而這里的RNA復制，它不需要任何蛋白質(zhì)，完全由RNA酶(ribozymes)及RNA模板完成。

而通常的DNA/RNA病毒的復制以及細胞DNA復制都不是由純粹的DNA或RNA系統(tǒng)完成的。因此，RNA無疑地是一種復制模板。圖7.3RNA復制實驗7.2RNA干涉/擾7.2.1RNAi的分子機制RNA對基因表達的調(diào)控稱為RNA干擾（RNAinterference,RNAi）。

RNAi是一種轉(zhuǎn)錄后的基因沉默現(xiàn)象（post-transcriptionalgenesilencing,PTGS）,是dsRNA觸發(fā)細胞質(zhì)中與其同源的mRNA的降解，或在細胞核中dsRNA誘導同源的DNA的后生修飾（甲基化）而導致轉(zhuǎn)錄水平上的沉默。

RNA沉默是一種阻遏外來序列的有效手段，并在動、植物發(fā)育中有重要作用。

1998年FireA.和MelloC.C在線蟲中發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象。獲得2006年Nobel醫(yī)學和生理學獎。RNAi作用機制：

在不同的生物中，不同來源的雙鏈RNA(dsRNA，約500bp)被DICER（含有螺旋酶，helicase，dsRNA結(jié)合域，及PAZ功能域）裂解為一種具特異序列的有活性中間體---21~23nt的雙鏈siRNA（smallinterferingRNAs或guideRNAs）。

然后，siRNA結(jié)合核酸酶復合物（RISC的蛋白質(zhì)部分）形成RNA誘導復合物（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC）。激活的RISC依靠siRNA中的一條鏈（GuideStrand）去尋找互補的mRNA鏈，然后RISC中的核酸內(nèi)切酶（Augonate2,Ago2）在距離siRNA3＇端12bp的位置切割mRNA。

RNAi的分子遺傳機制

基因mut-7及rde-2如果發(fā)生突變則導致內(nèi)源轉(zhuǎn)座子在生殖細胞中動員，稱之為増變現(xiàn)象。說明RNAi過程是造成轉(zhuǎn)位子抑制的原因。如果基因rde-1和rde-4發(fā)生突變，則對線蟲注射dsRNA后缺乏產(chǎn)生RNAi的響應，在生殖細胞中也不能動員轉(zhuǎn)位子。dsRNA被轉(zhuǎn)換為特異序列中間體（R）,然后引起同源的mRNA降解/沉默。rde-1及rde-4為從dsRNA產(chǎn)生R所需要，mut-7及rde-2則被需要來響應R使靶mRNA沉默。7.2.2siRNA的產(chǎn)生與擴增

在線蟲中，小量的dsRNA能夠作用于大量的靶mRNA。這是因為dsRNA在轉(zhuǎn)變?yōu)閟iRNA的過程中，至少有三種擴增途徑。

1）Dicer酶可以把長的dsRNA截成10~20段，等于擴增10~20倍。2）存在一種催化機制，siRNA常常成倍增加，以用于進一步擴增。3）短的RNAs能作為靶mRNA的引物，在RNA依賴的RNA多聚酶的作用下，啟動一個RNA指導的RNA多聚化反應，隨后產(chǎn)生許多“次級siRNAs，稱為靶指導的擴增。（圖7.7）

首先dsRNA被切成短的siRNA,使dsRNA轉(zhuǎn)換成ssRNA。這些單鏈正常的siRNA如果沒有識別同源的靶mRAN，并與之配對，就會被降解。

一旦反義的siRNA與靶mRNA配對，則靶-指導的siRNA的擴增就會發(fā)生。這時，與靶mRNA配對的siRNA小段將沿mRNA延伸，但只能延伸幾百個堿基左右就停止，并從該區(qū)裂解下來而成為次級siRNA。這種效應稱之為“可遷移效應”。

siRNA與靶mRNA的穩(wěn)定化與“可遷移效應”的結(jié)合就形成了一個“連式反應”，在這個反應中，隨著Dicer的作用，primersiRNA的更新，以及新的一輪擴增，將發(fā)生siRNA的多輪的復制。

應該注意到，這種復制或擴增并不是自我復制/擴增，而是從primerA產(chǎn)生primerB,primerC,primerD,…這是從一個局部延伸為全體，再從全體裂解為若干局部的過程。7.2.3RNAi的遺傳

它們是一些專與某一基因特異結(jié)合的片段，而且在它們應該發(fā)揮作用的特異的時空中，含量相當豐富，暗示著它們也許能夠復制。Grishok等在線蟲中的實驗證明，RNAi性狀是后生的，可遺傳。它不需要通過基因序列的改變-----突變。線蟲（C.elegant）實驗(圖10)：

1）注射dsRNA;

2）把蟲子泡在含有dsRNA溶液中；

3）或者喂以正在表達有義及反義RNA的微生物。將dsRNA注射到線蟲兩性體，在子一代（F1）產(chǎn)生的基因沉默（RNAi）往往在F2消失。但是，在母性生殖系中，由RNAi引起的基因抑制，可以偶爾地遺傳到F2及以后各代中（圖7.8）。

Grishok等證明，如果RNAi在母體啟動，它可以通過F1的精子傳到F2，盡管該精子缺乏RNAi的靶基因。所以，RNAi一旦啟動，即使在缺乏內(nèi)源靶基因的情況下,雄性生殖系細胞能夠傳遞RNAi。

因此，RNAi性狀是后生的，可遺傳的。它并不需要通過基因序列的改變----突變。7.3RNAi對基因表達的作用7.3.1RNAi是對基因組的基因表達的反饋RNAi的發(fā)現(xiàn)使我們對RNA調(diào)控基因認識不斷深入。這種小的RNAs分子根據(jù)它們的來源不同被稱為siRNA（shortinterferingRNAs）miRNA(microRNAs)。它們借助于互補的mRNA的結(jié)合，觸發(fā)mRNA降解或阻止mRNA翻譯成蛋白質(zhì)。近年來研究表明，RNAi的途徑不僅限于作用于基因組或使mRNA沉默。

在裂殖酵母中，RNAi是裝配著絲點和使配對區(qū)異染色質(zhì)化所必需的。并發(fā)現(xiàn)常染色質(zhì)可因RNAi的作用而形成異染色質(zhì)。另外，他們還發(fā)現(xiàn)，在特異的沉默機制下，在有性周期中可使用分散的內(nèi)源DNA重復序列來抑制基因。（7.9）

現(xiàn)在已經(jīng)證明，RNA從基因組上轉(zhuǎn)錄下來后能夠反饋回去修飾基因組。這些修飾作用可以通過細胞分裂遺傳下去并影響發(fā)育過程。7.3.2RNAi引導的同源RNA降解在動物、植物及真菌等各種生物中引起轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS）/RNAi的機制都是大同小異，高度保守的。說明它的古老起源。

基本機制是dsRNA被加工成更小的片段（siRNA），對同源mRNA進行識別與裂解，以及誘導DNA的甲基化而導致PTGS/RNAi現(xiàn)象。dsRNA的產(chǎn)生有多種方式包括：

反向的DNA重復序列的轉(zhuǎn)錄；有義及反義RNA的同時合成；

病毒復制，細胞/病毒的RNA依賴的RNA多聚酶（cRdRP/vRdRP）對單鏈RNA模板的轉(zhuǎn)錄。（圖7.11）PTGS/RNAi產(chǎn)生的機制可分二步：第一步是dsRNA內(nèi)切酶的作用，把sRNA加工成21~25nt的有義和反義的RNA(siRNA)，這些siRNA首先在植物中發(fā)現(xiàn)。在果蠅中，它們是由一種稱為Dicer的RNaseⅢ所產(chǎn)生。Dicer已在線蟲、S.pombe及哺乳動物中發(fā)現(xiàn)，它含有螺旋酶（helicase）,dsRNA結(jié)合域，及PAZ結(jié)構(gòu)域。第二步因Dicer所產(chǎn)生的siRNA引導RISC裂解同源的單鏈mRNAs。RISC恰在反義siRNA與mRNA結(jié)合區(qū)域的中間切割mRNA,使mRNA進一步降解。

雖然RISC的大多數(shù)蛋白成分還不清楚，但已知到它含有內(nèi)切酶、外切酶、螺旋酶及同源搜索活性。RISC的成分是PAZ/Piwi蛋白。通過PAZ域與Dicer作用把siRNA吸收到RISC中。評論：PTGS/RNAi現(xiàn)象的本質(zhì)是不能正確地表達基因產(chǎn)物對基因的反饋調(diào)控。既然該基因已不能表達信息，就應該使其沉默。這種沉默不是DNA本身的突變，而是后生的基因沉默。這種后生的DNA甲基化是遺傳的。這是一種對基因表達環(huán)境的一種可遺傳的適應。7.3.3RNAi引導的同源DNA修飾RNA引導的同源DNA序列的胞嘧啶的從頭甲基化是首次在類病毒感染轉(zhuǎn)基因植物中發(fā)現(xiàn)的。繼之，又在非病原的植物系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)。

RNA指導的DNA甲基化如同降解同源RNA一樣，需要把dsRNA裂解為小RNA。只有與引導RNA互補的DNA序列才能夠被甲基化，說明這是一個RNA-DNA相互作用的過程。

最短30bp的DNA序列可以作為甲基化的靶序列；甲基化可以發(fā)生于所有的胞嘧啶上，包括那些不存在對稱的CpG島；任何DNA序列，包括那些并不轉(zhuǎn)錄的啟動子序列，均可被甲基化。那些含有啟動子序列的dsRNAs自然可以指導同源的啟動子的甲基化及轉(zhuǎn)錄沉默此外，作為PTGS效應而在細胞質(zhì)中產(chǎn)生的RNAs也可以進入細胞核而觸發(fā)同源DNA的甲基化。（圖7.9，7.11）

RNA引導的DNA甲基化的蛋白質(zhì)執(zhí)行機構(gòu)尚不明確，但起碼要有DNA重新甲基化酶（DNMT）以及能打開dsRNA的RNA螺旋酶。RNA引導的DNA甲基化是否需要dsRNA或小的RNA降解物尚不確定。

研究認為小RNA是用于接近部分打開的DNA以形成RNA-DNA雙鏈或DNA單鏈L單鏈Loop。這些結(jié)構(gòu)可以吸引DNMT?；蛘哒f，小RNA可能與DNMT作用，并把該酶引導到同源DNA序列上去。DNMTN可能是色甲基酶?？梢栽O(shè)想，小RNA通過色結(jié)構(gòu)域與色結(jié)構(gòu)酶相作用去指導同源DNA序列的甲基化或維持非CpGs部位的甲基化。（圖7.9，7.11）

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)果蠅組蛋白乙酰酶MOF的色結(jié)構(gòu)域起著RNA相互作用模塊作用。MOF的例子使人們想到，引導RNA不僅能進行RNA指導的DNA甲基化，也能對基因組的特異區(qū)域進行非甲基化的染色質(zhì)修飾。

哺乳類及果蠅的X染色體的劑量補償，某些哺乳類基因組記憶，包括非編碼RNA、重疊及反義RNA等，都可能是染色質(zhì)修飾或甲基化現(xiàn)象。7.4RNA編輯7.4.1RNA編輯是對中心法則的挑戰(zhàn)mRNA的序列與其DNA模板的序列是嚴格的一一對應的，這種序列的共線性是中心法則的基本概念。1977年intron的發(fā)現(xiàn)，中心法則及序列學說受到極大震撼。

現(xiàn)在認為mRNA與其DNA模板序列的嚴格對應已不可能，以從全面對應退而為部分對應。mRNA在成熟過程中被莫名其妙的刪掉非編碼序列---intron,剩下的為編碼序列還是嚴格對應的。顯然Intron不是中心法則所希望的東西。

1985年，在動物線粒體中發(fā)現(xiàn)一些RNA的polyA尾巴中有終止密碼。眾所周知，polyA是在轉(zhuǎn)錄后才加上去的，與DNA模板根本談不上對應關(guān)系，也絕不會有編碼序列。然而出現(xiàn)的這個終止密碼卻偏偏是64個密碼之一，好在這個密碼在polyA之內(nèi)，RNA編碼的格局未被破壞。

在病毒、原生動物、哺乳動物及植物的RNA中都發(fā)現(xiàn)有U，A，C，G的刪除、插入與替換，這種轉(zhuǎn)錄后的修飾過程，稱為RNA編輯（RNAediting）。（表7.2）RNA編輯（RNAediting）早在1986年由Benne等在布氏錐蟲及簇生短膜蟲中發(fā)現(xiàn)。它們的線粒體的coχll基因(細胞色素C氧化酶亞單位Ⅱ)的mRNA5′端含有4個非基因編碼的U殘基，正是由于它們的插入而抑制了原來基因的移碼，形成完整的開放性讀框，產(chǎn)生了有活性的fox。

一萬個1kb小環(huán)，功能不清。T.brucei的mtDNA50個22kb大環(huán)，即大環(huán)基因。錐蟲許多大環(huán)的轉(zhuǎn)錄本（RNA）是無功能的，因為它們?nèi)狈m當?shù)姆g起始密碼，或含有移碼序列。某些錐蟲由于U的插入或缺失在大環(huán)基因的RNA的富嘌呤的小范圍進行。RNA編輯結(jié)果是增強它們的翻譯能力。如果基因移碼框架被消除，建立AUG起始密碼，同時改變了某些氨基酸，而在短膜蟲的MURF-3RNA中則從其讀框中段形成了一個潛在的起始密碼。Benne認為，這表明RNA編輯可能對基因的表達有調(diào)控作用（正/負）。總之，mRNA編輯，尤其是大幅度的編輯涉及到mRNA的密碼子大部分，致使它們從無意義成為有意義的信使，而它們原來的基因，亦即基因組DNA只不過是一串簡略意義的模糊序列。7.4.2模糊基因（crytogenes）Simpson與Shaw把被RNA編輯的基因稱之為模糊基因或叫隱秘基因，在本書中模糊基因。Simpson等將模糊基因分為三類：類型Ⅰ：內(nèi)部編輯的模糊基因,只在其轉(zhuǎn)錄本的蛋白編碼區(qū)內(nèi)部進行編輯。如,coχⅡ,MURF3。類型Ⅱ：5′端編輯的模糊基因,只在其轉(zhuǎn)錄本的5′端蛋白編碼區(qū)內(nèi)進行編輯；如，MURF2,MURF3,coχⅢ等。類型Ⅲ：泛編輯的模糊基因，在其轉(zhuǎn)錄本的全長進行編輯而產(chǎn)生一個全新的蛋白質(zhì)。如，MURF4,MURF3,coχⅢ，編輯的模糊基因7.4.3.1guideRNA(gRNA)模型研究表明，RNA編輯并無即存模板可依。

在錐蟲中發(fā)現(xiàn)有一些短的RNA，以其5′端開始與被編輯的模糊mRNA互補結(jié)合，以其3′提供增刪某核苷酸（U,C,G,等）的信息，被稱為引導RNA（guideRNA,gRNA）。有關(guān)增刪的機制，僅限于一些針對錐蟲gRNA的模型。如：Simpsonmodel,主要是以簡單的酶切機制。（圖7.13）

Cechmodel,以轉(zhuǎn)酯反應為主。（圖7.14）7.4.3RNA編輯模型357.4.3.2高等動物RNA編輯酶Fox發(fā)現(xiàn)，植物線粒體基因某些密碼子與其蛋白產(chǎn)物的氨基酸密碼子并不一致，說明從DNA到蛋白質(zhì)的序列信息逐一精確對應的中心法則并不是普遍的法則。而后發(fā)現(xiàn)這是對線粒體的轉(zhuǎn)錄本進行了RNA編輯。而這種編輯不僅限于植物線粒體，也存在于高等動物基因組的轉(zhuǎn)錄本的加工中。2000年，Wang等描述了細胞核中的RNA編輯酶ADARs（adenosinedeaminasesactingonRNA，ADAR）。這種轉(zhuǎn)錄本的編輯是小鼠、果蠅的胚胎發(fā)育是需要的。

脊椎動物有三個ADAR基因，ADAR1是首先被發(fā)現(xiàn)，它經(jīng)常與

ADAR2在各種組織中表達。ADAR3僅僅在腦中表達，尚不知是否有酶活性。看來，RNA編輯酶及其RNA編輯遠比我們想象的重要和普遍。該過程的關(guān)鍵是把基因中的內(nèi)含子拉入到編碼過程中。（圖7.15）

編輯部位的互補序列（editingsitecomplemetarysequence,ECS）是RNA編輯酶（ADAR