第二節(jié)動物細胞培養(yǎng)

第二節(jié)動物細胞培養(yǎng)一、動物細胞特點無細胞壁倍增時間長，生長緩慢需氧量少，對攪拌敏感聚集體形成原代細胞培養(yǎng)50代即開始退化二、生長特性貼附生長型：如人胚肺細胞，Hela細胞，巨噬細胞，神經細胞懸浮生長型細胞：如血液白細胞，淋巴組織細胞等三、體外培養(yǎng)特點營養(yǎng)條件苛刻適應性差,敏感培養(yǎng)時間長，易污染四、體外培養(yǎng)條件溫度，37度pH：7.2-7.4氣體：氧，二氧化碳，氮氣營養(yǎng)條件：需要多種氨基酸，維生素，輔酶，核酸，嘌呤，嘧啶，激素和生長因子，其中多種成分可以由血清提供五、

體外細胞生長增殖過程

原代培養(yǎng)期；

傳代培養(yǎng)期；

衰退期

六、設備、試劑及培養(yǎng)基的選擇和配制

1.設備包括培養(yǎng)箱(特別是二氧化碳培養(yǎng)箱)、無菌室或者超凈工作臺、光學顯微鏡特別是倒置顯微鏡、各種規(guī)格的培養(yǎng)瓶(包括無鉀玻璃的或無毒塑料的、封閉式的或螺口式的等)

2.常用試劑有抗生素、貼壁因子、生長因子，還需要激素、凝集素、脂多糖(LPS)、各種營養(yǎng)劑胰酶、膠原酶、EDTA、各種生物緩沖劑等3.培養(yǎng)基的選擇和配制

培養(yǎng)基由三部分組成：基礎培養(yǎng)基、血清和基質。自行配制或用現成的化學合成培養(yǎng)基，常用的化學合成培養(yǎng)基有Eagle(包括BME、MEM、DME等)、F10、F12、199、RPMI1640、EBSS、HBSS、McCoy‘s5a、Fischer’s、BGjb、Swim‘sS77等；培養(yǎng)基中血清的濃度范圍為5％～20％，以10％濃度最為常用；為維持某些細胞在體外的生機或增殖力，還需要事先在培養(yǎng)基中添加纖黏素、昆布氨酸、白明膠之類的貼壁因子。

一般用無水粉劑配制培養(yǎng)基，過濾和收集；七、培養(yǎng)方法

懸滴；旋轉管；灌注小室；培養(yǎng)瓶；培養(yǎng)板原代細胞培養(yǎng)——以乳鼠腎細胞原代單層靜置培養(yǎng)為例：

1、操作者首先進行手的清洗與消毒，再將實驗用品放在合適的位置

2、配液：（1）細胞營養(yǎng)液的配置：0．5％LH液；犢牛血清；1萬單位/ml青、鏈霉素；7.4%NaHCO3

（2）平衡鹽液－Hank液的調節(jié)；（3）調胰蛋白酶的pH值；

3、處死動物，取腎，剪腎：將洗過的腎塊轉移入無菌的青霉素瓶；將腎剪成1立方毫米大小的塊，組織塊的大小應盡量均勻一致，再用Hank液洗滌2～3次，直到液體澄清為止；

4、消化及分散組織塊，可將分散的細胞懸液經過滅菌的紗布（或不銹鋼網）進行過濾，以除去部分較大的組織碎片。5、計數與釋稀：每ml含細胞30～50萬為宜。6、分裝與培養(yǎng)7、觀察：置于37℃培養(yǎng)的細胞，需逐日進行觀察，主要觀察：

（1）培養(yǎng)物是否污染，如培養(yǎng)液變?yōu)辄S色且混濁，表示已經被污染。（2）細胞生長狀況與培養(yǎng)液顏色的變化，如培養(yǎng)液變?yōu)樽霞t色，一般細胞生長不好?？赡苁瞧咳瓷w緊或營養(yǎng)液pH過高。（3）培養(yǎng)液若變?yōu)榻奂t色，一般顯示細胞生長良好。

※待細胞已基本長成致密單層時，此時即可進行傳代培養(yǎng)。八、組織培養(yǎng)的污染、檢測和排除

1.污染的主要途徑和媒介的發(fā)生

空氣、清洗消毒、操作、血清、組織

2.組織細胞污染的檢測

真菌污染細菌污染支原體污染

3.組織細胞污染的排除

抗生素除菌法、加溫除菌法、動物體內接種除菌法、巨噬細胞吞噬法九、動物細胞培養(yǎng)應用1962年開始，用于生物醫(yī)學研究，生產酶制劑，生長因子，疫苗，單抗等.如：※單克隆抗體技術在現代醫(yī)學中的應用;※胚胎移植和核移植技術在畜牧業(yè)中的應用※動物細胞大量培養(yǎng)生產次生產物※動物克隆技術的應用潛力單克隆抗體

1975年英國科學家Milstein和Kohler將產生抗體的淋巴細胞同腫瘤細胞融合，成功建立了單克隆抗體技術，而獲得1984年諾貝爾醫(yī)學和生理學獎。

每個B淋巴細胞僅專一地產生、分泌一種針對某種抗原決定簇的特異性抗體，而腫瘤細胞可以無限增殖，因此雜交瘤細胞可在體外培養(yǎng)或移植到體內條件下分泌大量單克隆抗體。

單克隆抗體技術的最主要優(yōu)點是可以用不純的抗原分子大量制備純一的單克隆抗體。雜交瘤細胞產生單克隆抗體示意圖第三節(jié)克隆技術及其應用的簡介

一、克隆技術的分類

根據克隆的層次分為基因克隆、細胞克隆、組織克隆、器官克隆及完整的生物體克隆。(1)基因克隆是指通過分子重組技術或是擴增（如PCR擴增）DNA片斷的相同序列的大量拷貝

，它是深入研究基因的結構、轉化、表達、調控及進行基因改造的基礎。(2)細胞克隆、組織克隆和器官克隆是克隆技術在細胞水平、組織水平和器官水平上的應用，可用來生產大量相同的細胞、組織和器官。分為植物克隆和動物克隆等

生物繁殖后代通常是以精、卵細胞結合的有性生殖方式進行。通過營養(yǎng)體細胞繁殖個體的方法稱為無性繁殖?？寺∈侵鸽x體條件下的無性繁殖。1981年Illmenses

率先報告用小鼠幼胚細胞核克隆出正常小鼠。隨后，1984年Willadsen用未成熟羊胚細胞核克隆出一頭羊。

英國PPI生物技術的羅斯林（Roslin）研究所的維爾穆特(Wilmut)博士1997年2月27日在世界著名權威雜志《Nature》宣布的用乳腺細胞的細胞核克隆出一只綿羊“

多莉

(Dolly)”的消息?！岸嗬颉钡恼Q生，既說明了體細胞核的遺傳全能性，也翻開了人類以體細胞核競相克隆哺乳動物的新篇章。此項技術因而榮登美國《Science》周刊評出的1997年十大科學發(fā)現

的榜首。

二、克隆過程

①科學家選取了三只母羊，通過顯微操作先將一只母羊的卵細胞核質分離，使卵失去原有的

遺傳物質，僅余細胞質；②然后將另一只6歲母羊的乳腺細胞的核與之融合，形成一個含有

新遺傳物質的卵細胞；③使核質融合的卵在體外