第九章 吸光光度法

§9吸光光度法《基本要求》1.了解吸光光度法的特點和應用。2.熟悉光的基本性質(zhì)和物質(zhì)對光的吸收情況。3.掌握朗白—比爾定律。4.熟悉吸光光度法儀器和測量原理。5.掌握吸光光度法分析條件的選擇。擬要解決的問題1.光的基本性質(zhì)。2.物質(zhì)對光的選擇性吸收。3.物質(zhì)顏色與光吸收的關系。4.吸收曲線。5.朗白—比爾定律及其應用條件。6.標準曲線。7.分光光度計結(jié)構(gòu)和類型。8.吸光光度法分析條件的選擇。9.吸光光度法應用。吸光光度法(AbsorpionPhotometry)：是基于物質(zhì)對光的選擇性吸收而建立起來的分析方法。是分子光譜分析法的一種，又稱分光光度法,簡稱光度法。吸光光度法主要有以下特點：靈敏度高。用于測定含量在1—10-3%的微量組分，甚至可以測定低至10-4—10-5%的痕量組分。儀器設備簡單，操作簡便、快速。準確度較高。一般吸光光度法的相對誤差為2-5%，若使用精密儀器，誤差可降至1-2%，完全能夠滿足微量組分的測定要求。應用廣泛?？蓽y定絕大多數(shù)無機離子和許多有機物；既能用于定量分析，也可用于有機化合物定性分析，還可以測定某些物理化學常數(shù)及配合物的組成。一、光的基本性質(zhì)光是一種電磁波，具有波粒二象性,不同波長的光具有不同的能量，波長越短，能量越高，反之亦然。通常意義的單色光是指其波長處于某一范圍的光；而復合光則由不同的單色光組成，例如陽光和白熾燈泡發(fā)出的光均為復合光。光按照波長的長短順序范圍排列成譜就得到電磁波譜或波譜，常用的波長范圍為:§9.1物質(zhì)對光的選擇性吸收UVVISIR200～400nm400～750nm760nm～300mm電磁波譜的波長范圍很寬，其中較窄的一段可見光譜在分析化學得到了最為廣泛的應用，其波長范圍在400～750nm。當一束白光通過棱鏡后就色散成紅、橙、黃、綠、青、青藍、藍紫八種顏色的光，它們具有不同的波長范圍。二、物質(zhì)對光的選擇性吸收（一）物質(zhì)對光產(chǎn)生選擇性吸收的原因主要與物質(zhì)的分子內(nèi)部具有一系列的不連續(xù)的特征能級有關：E=

E電子＋E振動＋E轉(zhuǎn)動。當光照射物質(zhì)分子時，分子中的電子會吸收光能hn，由基態(tài)越遷至激發(fā)態(tài)。若光能量hn恰好等于物質(zhì)分子的能級差DE，則光被分子吸收，電子由基態(tài)越遷至激發(fā)態(tài)。DE=E激發(fā)態(tài)-E基態(tài)=hn

由于不同物質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)不同，其分子內(nèi)部的能級差不一樣，導致不同物質(zhì)對不同波長光的吸收具有選擇性。（二）物質(zhì)的顏色與光吸收的關系當物質(zhì)（分子或離子）吸收了相當可見能量的電磁波后，就會表現(xiàn)出被人眼所能觀察到的顏色。物質(zhì)之所以具有不同的顏色，這是它們對不同波長的可見光具有選擇性吸收的結(jié)果。物質(zhì)呈現(xiàn)的顏色與它所吸收的顏色（波長）有一定關系。例如，當白光通過硫酸銅溶液時，銅離子選擇性的吸收了部分黃色光，使透過光中藍色光不能完全互補，所以溶液顯藍色。關系如圖10-1中所示。從下表也可以直觀看出。溶液顏色即為透射光顏色，與吸收光互補。溶液顏色吸收光顏色λ/nm黃綠黃橙紅紫紅紫藍青藍青紫藍青藍青綠黃綠黃橙紅400～450450～480480～490490～500500～560560～580580～600600～650650～750溶液顏色的深淺，取決于溶液吸收光的量，即取決于吸光物質(zhì)的濃度，濃度越大，吸收越多，溶液顏色越深。比色分析：通過目視比較溶液顏色深淺來確定溶液中吸光物質(zhì)含量的方法。光電比色分析：利用儀器代替目視比較溶液顏色深淺來確定溶液中吸光物質(zhì)含量的方法。光度分析：單色器和檢測器改進后的光電比色計。靈敏度和準確度大為提高。（三）吸收曲線（吸收光譜）讓不同波長的單色光依次照射某一吸光物質(zhì)，并測量該物質(zhì)在每一波長處對光吸收程度的大小（A），以波長（l）為橫坐標，以吸光度（A）為縱坐標，即可以得到一條吸光度隨波長變化的曲線，稱之為吸收曲線或吸收光譜，它能夠準確地描述物質(zhì)對各種不同波長吸收情況。吸收曲線中吸光度最大值處稱為最大吸收峰，對應的波長稱為最大吸收波長lmax。吸收曲線的形狀和lmax的位置取決于物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)，不同的物質(zhì)因其分子結(jié)構(gòu)不同而具有各自特征的吸收曲線，據(jù)此可進行定性分析。對于同一物質(zhì)，濃度不同，其吸收曲線的形狀和lmax的位置不變，但在同一波長下，吸光度（A）隨濃度的增大而增大，據(jù)此可進行定量分析。在lmax處測量吸光度的靈敏度最高，在沒有其它干擾的情況下一般選擇為lmax測量波長。因此，吸收曲線是吸光光度法選擇波長的依據(jù)。下圖是KMnO4溶液吸收曲線，它選擇性的吸收了525nm附近的綠青色光，而對綠青色光的互補色光400nm附近的紫色光幾乎不吸收，所以KMnO4溶液顯紫紅色，即KMnO4溶液的lmax為525nm。KMnO4溶液的吸收曲線（CKMnO4：a<b<c<d）一、朗白—比爾定律布格（Bouguer）和朗白（Lambert）先后在1729年和1760年闡明了物質(zhì)對光的吸收程度和吸收層厚度的關系；1852年比爾（Beer）又提出了物質(zhì)對光的吸收程度和吸光物質(zhì)濃度之間也有類似的關系；二者歸一為光吸收基本定律：布格—朗白—比爾定律，簡稱朗白—比爾(Lambert-Beer)定律。

§9.2光吸收的基本定律I0：入射光強度；It：透過光強度；b：吸收層厚度A：吸光度；T：透光度（透射比）；K：吸光系數(shù)透射比T＝It/I0又稱%透光率C：溶液濃度（一）朗白—比爾定律的物理意義當一束平行的單色光垂直通過一均勻的非散射的吸光物質(zhì)時，其吸光度A與吸光物的濃度C及吸收層厚度b成正比—吸光光度法定量分析的理論依據(jù)。朗白—比爾定律是光吸收的基本定律，適用于所有電磁輻射和所有的吸光物質(zhì)（分子、原子）和離子的氣、液、固）。應用前提：入射光為平行單色光且垂直照射。吸光物質(zhì)是均勻非散射體系。吸光物質(zhì)質(zhì)點間無相互作用。輻射與物質(zhì)之間僅為簡單光吸收過程，無熒光和光化學反應發(fā)生。（二）吸收系數(shù)和桑德爾靈敏度吸收系數(shù)朗白—比爾定律A=Kbc中的系數(shù)K因濃度c所取的單位不同，有兩種表示方式。吸收系數(shù)a：物質(zhì)的組成和分子量不知時采用。當b為cm，吸光物質(zhì)C為g·L-1時，K用a表示，單位為L·g-1·cm-1，此時A=Kbc=abc摩爾吸收系數(shù)k（讀卡帕）

當b為cm，吸光物質(zhì)C為mol·L-1時，K用k表示，單位為L·mol-1·cm-1，此時A=Kbc=kbc

摩爾吸光系數(shù)的物理意義:當吸光物質(zhì)的濃度為1mol·L-1時，b為1cm時，吸光物質(zhì)對某波長光的吸光度值。由于濃度單位為mol·L-1故其應用更廣泛。摩爾吸光系數(shù)k值一般通過實驗由k=A/bc求得。摩爾吸光系數(shù)的大小取決于入射光的波長，波長不同，k亦不同。在這些不同的k之中,lmax下的kmax是一個重要的特征參數(shù)，它反應了該吸光物質(zhì)吸光能力可能達到的最高度，所以k常用來衡量光度法靈敏度的高低，kmax越大，靈敏度越高。一般認為kmax>104L·mol-1·cm-1

的方法是較靈敏的。桑德爾（Sandell）靈敏度S定義：當光度儀器的檢測極限為A=0.001時，單位截面積光程內(nèi)所能檢出的吸光物質(zhì)的最低質(zhì)量，單位為g·cm-2。由于此時儀器的信號檢測能力已經(jīng)確定，則S僅與物質(zhì)的吸光能力有關，即僅與k有關：A=0.001=kbc，bc=0.001/kb的單位為cm，C的單位為mol·L-1，即mol/103cm3，故bC的單位為mol/103cm2，若再乘以吸光物質(zhì)的摩爾質(zhì)量M（g/mol），則為103cm2截面積光程中所含物質(zhì)的質(zhì)量（g），所以單位截面積光程中所含物質(zhì)的質(zhì)量（mg）為：所以，k越大，S越小，即該方法的靈敏度越高。對于比較靈敏的顯色反應，S一般在0.01～0.001mg·cm-2之間。有極少數(shù)顯色反應的k值達到了106數(shù)量級。（三）標準曲線的繪制標準曲線即校準曲線，又稱工作曲線。是以吸光度A為縱軸，濃度C為橫軸繪制的一條曲線。首先在一定條件下配制一系列具有不同濃度吸光物質(zhì)的標準溶液，稱為標準系列，然后測得它們相應的吸光度值，作A～C曲線，為工作曲線或標準曲線。在遵循朗白—比爾定律的濃度范圍內(nèi)應為一條直線。同時可知直線的斜率就等于kb，又因為b是定值，故可以求出k值，這樣求得的k值是通過測定多個標準溶液而得到的平均值，所以更可靠。A～C標準曲線及其偏離（A=

kbc）二、引起偏離朗白—比爾定律的因素(一)物理因素非單色光引起的偏離入射光不純。單色光實際是有一定的波長范圍的平行光，假設入射光是由1和2組成，其強度分別為I01和I02，透射光強度分別為It1和It2，摩爾吸光系數(shù)為k1，k2,當通過的吸光物質(zhì)的濃度為C，液層厚度為b時。It1It2I01I0212對于1：A1=lg(I01/It1)=k1bC，故：It1=I01·10-k1bC對于2：A2=lg(I02/It2)=k2bC，故：It2=I02·10-k2bC由于：

I0=I01＋I02，It=It1＋It2；所以：A總=lg[(I01+I02)/(It1+It2)]=lg[(I01+I02)/(I01×10-k1bC+I02×10-k2bC)]若

k1=k2=k，則A總=kbC，服從朗白—比爾定律。即1≈2，則k1≈k2，可近似認為入射光為單色光。若1≠2，則k1≠k2，A，C間不成正比。1，2間相差越大，偏離越嚴重。解決方法：采用性能較好的單色器，以獲得波長范圍窄的入射光。非平行入射光引起的偏離（正偏離）非平行光不能保證入射光垂直入射，將導致光束平均光程b′大于吸收池厚度b，實際測得的吸光度值將大于理論值。介質(zhì)不均勻引起的偏離（正偏離）朗白—比爾定律要求測量溶液是均勻非散射的，若溶液不均勻會有部分光因散射而損失，使測量的吸光度偏高，產(chǎn)生正偏離。(二)化學因素溶液濃度過高引起的偏離溶液濃度過高會使吸光物質(zhì)分子間距離縮短，相互作用加強，導致在高濃度范圍內(nèi)的k不恒定，A與C的線性關系被破壞。因此，朗白—比爾定律只適合于稀溶液?；瘜W反應引起的偏離由于吸光物質(zhì)的離解，締合，新化合物生成或互變異構(gòu)等影響，使測量濃度C與A不再成線性關系?！?.3吸光光度法的儀器目視比色——光電比色計——分光光度計采用了性能更好的單色器和檢測器，使靈敏度和準確度大為提高。一、分光光度計的組成光源單色器樣品池檢測器讀出系統(tǒng)提供單色光光源采用6～12V的低壓鎢絲燈做光源，復合波長約在（360）400～2500nm之間，在UV區(qū)用氫燈或氘燈做光源，波長在185～375之間，配以穩(wěn)壓電源。單色器（分光系統(tǒng)）濾色片(20～50nm)：顏色與被測液互為補色。玻璃棱鏡(360～3600nm)：可見分光光度計。石英棱鏡(200～4000nm)：紫外可見分光光度計。光柵：衍射和干涉原理分光，波長范圍寬，分辨率高，單色光純度高。吸收池（比色皿）厚度(光程):0.5，1，2，3，5…cm

材質(zhì)：玻璃比色皿——可見光區(qū)石英比色皿——可見、紫外光區(qū)檢測系統(tǒng)硒光電池：300～800nm(500～600nm時最靈敏)；連續(xù)照射后易疲勞，使靈敏度降低。光電管和光電倍增管：紅敏（陰極面為銀和氧化銫）625～1000nm；藍敏光電管（陰極面為銻銫）160～700nm.廣泛應用。二極管陣列檢測器：高檔檢測器。信號顯示系統(tǒng)作用是檢測光電流大小，并以一定的方式顯示或記錄下來。過去是指針式讀數(shù)，現(xiàn)在是數(shù)顯。二、吸光度的測量步驟調(diào)節(jié)檢測器零點：T=0（或A=∞）用空白或試劑空白（參比溶液）調(diào)節(jié)T=100%或A=0，工作零點。待測組分吸光度測定。繪制標準（工作）曲線（定量）。內(nèi)插法從工作曲線上求得待測組分含量。三、分光光度計類型根據(jù)波長范圍分為:VIS，VIS—UV，IR（FIR）分光光度計。根據(jù)儀器結(jié)構(gòu)：單光束，雙光束，雙波長三種類型。書中p287有詳細介紹?？梢姽夤舛确治鍪紫仁鞘贡粶y組分變成有色溶液，然后進行吸光度測量。所以分析條件包括顯色和測量兩部分。一、顯色反應及其條件選擇(一)顯色反應和顯色劑顯色反應大多數(shù)顯色反應是利用配位反應顯色（包括無機顯色和有機顯色），少量是利用氧化還原反應（如MnO4-）?！?.4光度法分析條件的選擇顯色反應要求：選擇性要好。最好只與一種被測物發(fā)生顯色反應。靈敏度要高，即k值大（>104

）。有色化合物化學性質(zhì)穩(wěn)定，化學組成恒定。對比度要大。反應和產(chǎn)物有明顯的顏色差別(l>60nm)。顯色反應條件易于控制。顯色劑無機顯色劑：過氧化氫，硫氰酸銨，鉬酸銨，碘化鉀，氨水。有色化合物穩(wěn)定性差，選擇性和靈敏度都不高，應用較少。有機顯色劑：

與金屬離子形成穩(wěn)定的有色螯合物，選擇性和靈敏度都很高，是光度分析應用最廣泛的顯色劑。(二