第八章 生物樣品內(nèi)中藥制劑化學(xué)成分的測定

第八章生物樣品內(nèi)中藥制劑化學(xué)成分簡介藥物分析教研室2/4/20231體內(nèi)藥物分析第一節(jié)概述第二節(jié)

生物樣品的種類、采集、制備與貯存第三節(jié)生物樣品的預(yù)處理與制備

內(nèi)容提要第三章生物樣品與樣品制備2/4/20232體內(nèi)藥物分析第一節(jié)概述一、生物樣品內(nèi)藥物分析的性質(zhì)、意義和任務(wù)（一）生物樣品內(nèi)藥物分析的性質(zhì)生物樣品內(nèi)藥物分析，又稱體液藥物分析、生物藥物分析，是隨著臨床藥學(xué)、臨床藥理學(xué)的發(fā)展和需要而建立起來的一門新興學(xué)科。旨在通過各種分析手段，了解藥物在生物樣品內(nèi)的數(shù)量和質(zhì)量變化，獲得藥物代謝動力學(xué)的各種參數(shù)、藥物在生物樣品內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化、代謝的方式和途徑等信息，從未為藥品生產(chǎn)、臨床醫(yī)療、實驗研究等方面對栓研究的藥物作出估計與評價，對藥物的改進(jìn)與發(fā)展作出貢獻(xiàn)。2/4/20233體內(nèi)藥物分析（二）生物樣品內(nèi)藥物分析的意義1、生物樣品內(nèi)藥物分析在新藥評價和新藥開發(fā)中的意義大量事實證明，如無臨床藥理學(xué)和臨床藥學(xué)研究給新藥以確切的評價，要做到臨床安全、合理、有效地用藥將會遇到許多困難。因此，加強藥物在生物樣品內(nèi)作用機理的研究，以了解和闡明藥物藥物結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、劑型及生產(chǎn)工藝與藥物療效等關(guān)系，已成為評價藥品質(zhì)量的重要內(nèi)容和依據(jù)。2/4/20234體內(nèi)藥物分析2、生物樣品內(nèi)藥物分析在臨床合理用藥中的意義

影響血藥濃度的因素很多，同一種給藥方案難以對每一個病人都達(dá)到理想的治療效果，為達(dá)到用藥安全、合理、有效，必須設(shè)計個體化給藥方案，久需要好對治療藥物監(jiān)測，以血藥濃度為指標(biāo)，達(dá)到個體化用藥。2/4/20235體內(nèi)藥物分析（三）生物樣品內(nèi)藥物分析的任務(wù)1.在藥物濃度監(jiān)測中的應(yīng)用只有具有明確治療范圍，血藥濃度和藥效關(guān)系密切，且具有下列情況者，要求進(jìn)行農(nóng)藥檢測：有效血藥濃度范圍窄，劑量小，毒性大的藥物；藥代動力學(xué)個體差異大、藥理作用強、不易估計給藥后的血藥濃度藥物；藥物的毒性反應(yīng)與該藥治療的疾病癥狀相似，難以判斷是劑量不足還是藥物毒性所致；聯(lián)合用藥時，由于藥物相互作用產(chǎn)生不良反應(yīng)，需要調(diào)整藥物劑量者；在短期內(nèi)難于判斷療效的藥物，預(yù)測藥物能否達(dá)到預(yù)防效果；判斷患者用藥的依從性等要求進(jìn)行藥物濃度檢測。2/4/20236體內(nèi)藥物分析2.在藥代動力學(xué)研究中的應(yīng)用通常涉及藥物在生物樣品內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄等過程，常研究藥濃-時間曲線變化。生物制品內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)的含量，對于疾病的診斷或及早預(yù)防具有重要的意義。3.分析方法學(xué)的研究分析方法學(xué)研究，提供合理的最佳分析條件，估計、評定各種方法達(dá)到的靈敏、專屬、準(zhǔn)確程度、探討各種方法應(yīng)用與生物樣品內(nèi)藥物分析中的規(guī)律性，為臨床藥學(xué)的研究提供準(zhǔn)確、靈敏、快速的分析方法。2/4/20237體內(nèi)藥物分析二、生物樣品內(nèi)藥物分析的對象與特點（一）生物樣品內(nèi)藥物分析的對象凡是生物樣品內(nèi)藥物到達(dá)之處，如體液、器官、組織、排泄物等都是分析的對象，所以生物樣品內(nèi)藥物分析的樣本有血液、尿液、唾液、膽汁、淋巴液、淚液、脊髓液、汗液、乳汁、各種器官以及呼出的氣體等。生物樣品內(nèi)藥物分析的目標(biāo)，不僅是母體藥物也包括代謝產(chǎn)物，因為代謝產(chǎn)物常具有生理活性，弄清它們的種類、結(jié)構(gòu)、數(shù)量及分布情況，可了解藥物在生物體內(nèi)的變化及消除規(guī)律，這對安全用藥和正確評價藥物質(zhì)量也是非常重要的。由于新藥進(jìn)入臨床試驗之前，或者對老藥在某一方面的重新評價，一般要求現(xiàn)在動物體上進(jìn)行實驗，所以生物樣品內(nèi)藥物分析對象不僅是人體，也包括動物體。2/4/20238體內(nèi)藥物分析（二）生物樣品內(nèi)藥物分析的特點與常規(guī)藥物分析相比，生物樣品內(nèi)藥物分析在靈敏度和選擇性等方面有較高的要求。微量藥物存在于大量生物介質(zhì)中，樣品中含內(nèi)源性干擾雜質(zhì)，這些干擾物質(zhì)又隨疾病情況不同而有所不同。很多藥物在生物樣品內(nèi)經(jīng)過代謝可產(chǎn)生一種或多種代謝物，母體藥物和代謝物又能同生物大分子結(jié)合，這一切給藥物分離、分析帶來困難，這就要求分析方法具有更高的選擇性。另外，在生物樣品中，藥物濃度都很低，一般血藥濃度在10-6-10-9g/ml之間，且生物樣品若為血液，采集量又受到一定限制，因此要求分析方法要有較高的靈敏度。1.干擾雜質(zhì)多2.樣品量少3.要求較快提供結(jié)果。2/4/20239體內(nèi)藥物分析一、生物樣品的種類、采集和制備

血液(血漿、血清)—體現(xiàn)藥物濃度和治療作用之間的關(guān)系(聯(lián)接)——最常用的生物樣本

第三章生物樣品與樣品制備第一節(jié)生物樣品的種類采集生物樣品臟器組織體液血液、尿液、唾液、毛發(fā)、乳汁、精液、腦脊液、淚液、膽汁、胃液、胰液、淋巴液、糞便等2/4/202310體內(nèi)藥物分析尿液—用于藥物劑量回收、尿清除率、生物利用度、內(nèi)源性活性物質(zhì)、藥物代謝分型及代謝物等的研究測定第三章生物樣品與樣品制備第一節(jié)生物樣品的種類采集唾液—用于某些S/P較為恒定的藥物的測定一、生物樣品的種類、采集和制備

2/4/202311體內(nèi)藥物分析第三章生物樣品與樣品制備第一節(jié)生物樣品的種類采集肝、胃、腎、肺、腦等臟器組織

—動物試驗研究藥物吸收、分布狀態(tài)及服藥過量中毒死亡

毛發(fā)

—可用于藥物濫用監(jiān)測及微量元素測定一、生物樣品的種類、采集和制備

2/4/202312體內(nèi)藥物分析（一）血液（blood）

因血液中藥物濃度可以較好地體現(xiàn)藥物濃度和治療作用之間的關(guān)系，是最為常用的生物樣品—分為全血、血漿和血清

第三章生物樣品與樣品制備第一節(jié)生物樣品的種類采集2/4/202313體內(nèi)藥物分析1.

血樣的采集第三章生物樣品與樣品制備第一節(jié)生物樣品的種類采集

一般用注射器直接采集靜脈血，每次1~5ml；動物實驗時，采血量不宜超過動物總血量的十分之一2/4/202314體內(nèi)藥物分析

測定血中藥物的濃度，通常是指測定血漿或血清中的藥物濃度，尤其是血漿，并非指全血

第三章生物樣品與樣品制備第一節(jié)生物樣品的種類采集2.

血樣的制備2/4/202315體內(nèi)藥物分析第三章生物樣品與樣品制備第一節(jié)生物樣品的種類采集血漿的制備

采集的靜脈血液置含有抗凝劑的試管中，混合后，以2500~3000r/min離心5~10min使與血球分離，所得淡黃色上清液即為血漿（plasma）

抗凝劑—最常用的是肝素（heparin）其它抗凝劑EDTA、枸櫞酸鹽、草酸鹽等2/4/202316體內(nèi)藥物分析血清的制備

采集的靜脈血液置試管中，于37℃或室溫放置30min~1h。血液凝固后，用細(xì)竹棒或玻璃棒輕輕剝?nèi)ピ嚬鼙谏系难灒僭?500~3000r/min離心5~10min，上層淡黃色液體即為血清（serum）

第三章生物樣品與樣品制備第一節(jié)生物樣品的種類采集2/4/202317體內(nèi)藥物分析第三章生物樣品與樣品制備第一節(jié)生物樣品的種類采集血清比血漿只是少一種纖維蛋白原

C血漿=C血清血漿比血清的分離快，而且制取量約為全血的50%~60%（血清為全血的20%~40%），多數(shù)用血漿進(jìn)行分析。若血漿中含有的抗凝劑對藥物濃度測定有影響時，則應(yīng)使用血清樣品

血漿與血清的區(qū)別2/4/202318體內(nèi)藥物分析

全血的制備第三章生物樣品與樣品制備第一節(jié)生物樣品的種類采集成分血漿有形物質(zhì)紅細(xì)胞白細(xì)胞血小板2/4/202319體內(nèi)藥物分析全血的制備第三章生物樣品與樣品制備第一節(jié)生物樣品的種類采集某些情況血漿內(nèi)藥物濃度波動大，或血漿濃度低，可用全血（全血凈化較血漿和血清麻煩）血漿和紅細(xì)胞中分配比不是常數(shù)，則應(yīng)使用全血樣品例：三環(huán)類降壓藥在個別病人體內(nèi)血漿和紅血球中的分配比不是一個常數(shù)，故宜采用全血樣品進(jìn)行藥物動力學(xué)的研究2/4/202320體內(nèi)藥物分析全血制備

將采集的血液置含有抗凝劑的試管中，但不經(jīng)離心操作，保持血漿和血細(xì)胞均相狀態(tài)，即為“全血”（wholeblood）

第三章生物樣品與樣品制備第一節(jié)生物樣品的種類采集2/4/202321體內(nèi)藥物分析

血樣主要應(yīng)用于：

藥物動力學(xué)

生物利用度

臨床治療藥物濃度監(jiān)測第三章生物樣品與樣品制備第一節(jié)生物樣品的種類采集血樣的應(yīng)用2/4/202322體內(nèi)藥物分析（二）尿液(urine)

尿液用于藥物劑量回收、藥物尿清除率、生物利用度的研究，預(yù)測藥物代謝過程、類型體內(nèi)藥物清除主要是通過尿液排出，藥物以原型、Ⅰ相及Ⅱ相代謝物等多種形式排出

第三章生物樣品與樣品制備第一節(jié)生物樣品的種類采集2/4/202323體內(nèi)藥物分析（二）尿液(urine)

第三章生物樣品與樣品制備第一節(jié)生物樣品的種類采集性狀—淡黃色或黃褐色，相對密度

1.105~1.020，pH4.8~8.0成分—水、含氮化合物、鹽類等微生物—防腐劑2/4/202324體內(nèi)藥物分析尿液的采集

樣本來源—自然排尿，成人一日排尿量為1~5L（隨時尿、晨尿、白天尿、夜間尿及時間尿）

第三章生物樣品與樣品制備第一節(jié)生物樣品的種類采集樣本采集—一般采集時間尿（規(guī)定時間內(nèi)采集尿液體積和排入尿中的藥物總量2/4/202325體內(nèi)藥物分析（三）唾液（saliva）

唾液—無損傷取樣，易收集；一些藥物的唾液藥濃(S)與血漿游離藥濃(P)密切相關(guān)，因此：

—TDM中利用對S的測定代替對P的監(jiān)測

—藥代動力學(xué)的研究

第三章生物樣品與樣品制備第一節(jié)生物樣品的種類采集2/4/202326體內(nèi)藥物分析唾液采集

在潄口后15min，安靜狀態(tài)下采集口腔內(nèi)自然流出的唾液；也可在刺激下快速采樣(需注意干擾)

第三章生物樣品與樣品制備第一節(jié)生物樣品的種類采集2/4/202327體內(nèi)藥物分析唾液采集

第三章生物樣品與樣品制備第一節(jié)生物樣品的種類采集物理法：口嚼石臘片、聚四氟乙烯塊或紗布球等化學(xué)法：將檸檬酸或維生素C等置于舌尖，棄去初始部分后采集化學(xué)法的優(yōu)點：縮短采樣時間減小唾液pH波動（pH≈7.0），S/P個體差異小2/4/202328體內(nèi)藥物分析

唾液樣品采集后，應(yīng)立即測量其除去泡沫部分的體積，以3000rpm離心10min，取上清液直接測定或冷凍保存 第三章生物樣品與樣品制備第一節(jié)生物樣品的種類采集唾液樣品的制備2/4/202329體內(nèi)藥物分析第三章生物樣品與樣品制備第一節(jié)生物樣品的種類采集

非傷害性方法，病人易接受

采集不受時間、地點限制，易收集

靈敏度較高的血藥濃度測定方法可以直接或稍加改進(jìn)使用

一些藥物的唾液藥物濃度(S)與血漿游離藥物濃度(P)密切相關(guān)，可使用唾液樣品唾液樣品的特點2/4/202330體內(nèi)藥物分析

TDM—如苯妥英鈉的Cs/Cp比值恒定、個體差異小，可用于癲癇病人的TDM

藥代動力學(xué)參數(shù)測定—用GC-MS分析測定可卡因，血漿和唾液中的t1/2分別為3.8h和7.9h第三章生物樣品與樣品制備第一節(jié)生物樣品的種類采集唾液樣品的應(yīng)用2/4/202331體內(nèi)藥物分析（四）器官組織（tissue）

第三章生物樣品與樣品制備第一節(jié)生物樣品的種類采集1．勻漿化法

加入一定量的水或緩沖液，在刀片式勻漿機中勻漿，使被測藥物溶解，取上清液供萃取用

—方法簡單、但回收率低組織處理的一般方法有：用于動物試驗藥物動力學(xué)研究臨床服用藥物引起中毒死亡2/4/202332體內(nèi)藥物分析2．沉淀蛋白法

在組織勻漿中加入蛋白沉淀劑，沉淀蛋白質(zhì)后取上清液供萃取用，操作簡單、但回收率低，較為常用.第三章生物樣品與樣品制備第一節(jié)生物樣品的種類采集（四）器官組織（tissue）

2/4/202333體內(nèi)藥物分析第三章生物樣品與樣品制備第一節(jié)生物樣品的種類采集3．酸水解或堿水解

組織勻漿中加入適量的酸或堿，置水浴中加熱，待組織液化后，過濾或離心，取上清液供萃取用適用對熱穩(wěn)定的藥物，應(yīng)用較少。（四）器官組織（tissue）

2/4/202334體內(nèi)藥物分析

組織勻漿中加入適量的酶和緩沖液，置水浴上水解一定時間，待組織液化后，過濾或離心，取上清液供萃取用最常用的酶—枯草菌溶素（一種細(xì)菌性堿性蛋白分解酶，可在pH7.0~11.0較寬的范圍內(nèi)使蛋白的肽鍵降解，在50~60℃具有最大活力）

第三章生物樣品與樣品制備第一節(jié)生物樣品的種類采集返回去除蛋白質(zhì)方法4．酶水解法（四）器官組織（tissue）

2/4/202335體內(nèi)藥物分析

優(yōu)點—酶解法操作簡便

—避免藥物在酸及高溫下降解

—對與蛋白結(jié)合緊密的藥物，可顯著改善回收率

—可用有機溶劑直接萃取酶解液而無乳化現(xiàn)象生成

缺點—不適用于在堿性下易水解的藥物第三章生物樣品與樣品制備第一節(jié)生物樣品的種類采集返回去除蛋白質(zhì)方法4．酶水解法（四）器官組織（tissue）

2/4/202336體內(nèi)藥物分析（五）頭發(fā)（hair）

第三章生物樣品與樣品制備第一節(jié)生物樣品的種類采集應(yīng)用—體內(nèi)微量元素含量測定

—用藥史的估計

—臨床用藥和藥物非法濫用的區(qū)別、毒性藥物檢測2/4/202337體內(nèi)藥物分析（五）頭發(fā)（hair）

優(yōu)點—取樣方便、可重復(fù)采樣

—通過測定某些特定的代謝物將

藥物濫用和臨床用藥相區(qū)別

—能獲數(shù)月~數(shù)年的長期用藥信息缺點—預(yù)處理繁雜、干擾多

—分析對象的含量低、需精密儀器

第三章生物樣品與樣品制備第一節(jié)生物樣品的種類采集2/4/202338體內(nèi)藥物分析1．廣譜性（代謝產(chǎn)物及微量元素排泄器官）2．積累性（長期富集各代謝產(chǎn)物）3．穩(wěn)定性（ 水分含量少）

4．依時性（反應(yīng)某時期藥物的積累）5．相關(guān)性（與人體內(nèi)部器官相關(guān)）6．指紋性（環(huán)境、飲食等）第三章生物樣品與樣品制備第一節(jié)生物樣品的種類采集（五）頭發(fā)檢測的性質(zhì)2/4/202339體內(nèi)藥物分析

采集—代表性和同一性

—采集枕部發(fā)樣

—微量元素在前額部位的頭發(fā)中含量最低，枕部含量最高

洗滌—除去外源性污染物

第三章生物樣品與樣品制備第一節(jié)生物樣品的種類采集（五）頭發(fā)的采集與洗滌2/4/202340體內(nèi)藥物分析

毛發(fā)樣品的制備

1．毛發(fā)中藥物的提取—常用方法：

直接用甲醇提取

酸水解(0.1mol/L鹽酸)

堿水解(1mol/L氫氧化鈉)

酶水解(-葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶)2．有機破壞法

第三章生物樣品與樣品制備第一節(jié)生物樣品的種類采集返回第一節(jié)2/4/202341體內(nèi)藥物分析二、生物樣品的貯存與處理

冷藏—冰箱(4℃)中短期保存(1~2d)

冷凍—冷柜(-20℃)或低溫冷柜(-80℃)

中長期保存

冷藏或冷凍時限經(jīng)穩(wěn)定性考察后確定返回第一節(jié)第三章生物樣品與樣品制備第一節(jié)生物樣品的種類采集2/4/202342體內(nèi)藥物分析生物樣品的貯存

血樣

采集后及時分離血漿和血清（≤2h），分離后再貯存

—若不予先分離，血凝后冰凍保存，則因冰凍有時易引起細(xì)胞溶解，會阻礙血漿或血清的分離

—置硬質(zhì)玻璃試管中完全密塞后保存

第三章生物樣品與樣品制備第一節(jié)生物樣品的種類采集2/4/202343體內(nèi)藥物分析

尿樣

采集后應(yīng)立即測定，若不能立即測定，加入防腐劑后保存 常用防腐劑：甲苯、二甲苯、氯仿、醋酸、濃鹽酸等

甲苯在尿液表面形成薄膜醋酸改變尿液酸堿性抑制細(xì)菌的生長 保存時間為24~36h(4℃)或長期(-20℃)第三章生物樣品與樣品制備第一節(jié)生物樣品的種類采集生物樣品的貯存

2/4/202344體內(nèi)藥物分析

唾液

為阻止酶催化生成粘蛋白，應(yīng)在4℃以下保存

—保存過程中放出二氧化碳而使pH升高，測定唾液pH時應(yīng)在取樣的當(dāng)時為好

—冷凍保存唾液時，解凍后有必要將容器內(nèi)唾液充分?jǐn)噭蚝笤儆?，否則測定結(jié)果會產(chǎn)生誤差

第三章生物樣品與樣品制備第一節(jié)生物樣品的種類采集

第一節(jié)返回第三章生物樣品的貯存

2/4/202345體內(nèi)藥物分析

注意事項：

1．冷凍的樣品測定時，需臨時解凍。解凍后的樣品應(yīng)一次性測定完畢，不應(yīng)反復(fù)凍融

2．如果采集的樣品不能一次性測定，則應(yīng)以小體積分裝貯存，每次按計劃取一定數(shù)量進(jìn)行測定第三章生物樣品與樣品制備第一節(jié)生物樣品的種類采集

第一節(jié)返回第三章生物樣品的貯存

2/4/202346體內(nèi)藥物分析第三節(jié)生物樣品的預(yù)處理與制備

樣品預(yù)處理技術(shù)

分離、純化、富集或化學(xué)衍生化等，為藥物的最終測定創(chuàng)造良好的條件

第三章生物樣品與樣品制備

第一節(jié)返回第三章2/4/202347體內(nèi)藥物分析

樣品的預(yù)處理是體內(nèi)藥物分析中極為重要的環(huán)節(jié)；也是分析中最困難、最繁雜的工作

——對于生物樣品的預(yù)處理很難規(guī)定固定的程序和方式，必須結(jié)合測定實際和要求，采取恰當(dāng)?shù)姆椒ê图夹g(shù)第三章生物樣品與樣品制備

第一節(jié)返回第三章第三節(jié)生物樣品的預(yù)處理與制備2/4/202348體內(nèi)藥物分析本節(jié)內(nèi)容：一、生物樣品預(yù)處理的目的二、樣品制備時應(yīng)考慮的問題

三、生物樣品的預(yù)處理與制備技術(shù)

第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理

第一節(jié)返回第三章2/4/202349體內(nèi)藥物分析一、生物樣品預(yù)處理的目的

使藥物從綴合物及結(jié)合物中釋放

——測定藥物的總濃度

使樣品純化——消除生物基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)的干擾

提高檢測靈敏度——適應(yīng)和符合測定方法要求的靈敏度

防止分析儀器的污染和劣化——提高分析儀器的耐受程度、改善分析結(jié)果第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理2/4/202350體內(nèi)藥物分析（一）使藥物從綴合物及結(jié)合物中釋放

藥物——吸收——蛋白結(jié)合物

Ⅰ相代謝——代謝物

Ⅱ相代謝——綴合物在體內(nèi)存在形式：游離型藥物+代謝物

+藥物或代謝物與蛋白結(jié)合物

+藥物或代謝物Ⅱ相代謝的綴合物預(yù)處理—藥物或代謝物從“結(jié)合物”或綴合物中釋放，測定藥物或代謝物的總濃度第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理2/4/202351體內(nèi)藥物分析（二）使樣品純化

生物樣品的基質(zhì)——組成復(fù)雜、干擾多

血清中含有高分子的蛋白質(zhì)和低分子的糖、脂肪、尿素等有機物，也含有Na+、K+、Cl-等無機物

尿液中含有尿素、肌酸、尿囊素、氨、Na+、K+、Cl-等

藥物組分——藥物含量低，一般為g或

ng水平，經(jīng)預(yù)處理使純化、富集第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理2/4/202352體內(nèi)藥物分析（三）提高檢測靈敏度預(yù)處理—降低背景噪音—提高靈敏度特異性強、靈敏度高的分析方法

—預(yù)處理簡單不具備分離功能的方法(光譜法)

—

預(yù)處理十分重要第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理2/4/202353體內(nèi)藥物分析（四）防止分析儀器的污染和劣化

生物樣品基質(zhì)中脂肪、蛋白質(zhì)、不溶性顆粒污染分析儀器

根據(jù)分析儀器的耐受程度，選擇不同的預(yù)處理方法

第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理返回第二節(jié)2/4/202354體內(nèi)藥物分析

高效液相色譜法—去除血漿（或血清）中的蛋白質(zhì)

第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理返回第二節(jié)（四）防止分析儀器的污染和劣化2/4/202355體內(nèi)藥物分析預(yù)處理—改善分析結(jié)果的準(zhǔn)確度與精密度，延長色譜柱的壽命（除固體雜質(zhì)）

—改善選擇性（排除生物基質(zhì)的干擾）

—改善組分可測性（被測組分的富集）

—改善組分色譜行為（化學(xué)衍生化）2/4/202356體內(nèi)藥物分析二、樣品制備時應(yīng)考慮的問題

1．被測組分的理化性質(zhì)、存在形式、濃度范圍2．測定目的3．生物樣品種類和基質(zhì)的干擾類型

第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理返回第二節(jié)2/4/202357體內(nèi)藥物分析二、樣品制備時應(yīng)考慮的問題

4．樣品的化學(xué)組成5．藥物的蛋白結(jié)合率6．被測組分在預(yù)處理過程中的穩(wěn)定性7．樣品在收集、儲存和預(yù)處理中容器的污染8．保證必要的專屬性、靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度的前提下預(yù)處理過程盡量簡單第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理返回第二節(jié)2/4/202358體內(nèi)藥物分析1.藥物的理化性質(zhì)和存在形式酸堿性(pKa)、溶解性——提取性質(zhì)揮發(fā)性——揮發(fā)損失及氣相色譜法的應(yīng)用光譜特性——分析儀器的選擇官能團(tuán)性質(zhì)——化學(xué)衍生化和檢測器應(yīng)用化學(xué)穩(wěn)定性——處理條件的選擇存在形式及血漿蛋白結(jié)合率——預(yù)處理方法

第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理2/4/202359體內(nèi)藥物分析2.待測藥物的濃度范圍不同藥物在體內(nèi)中濃度相差極為懸殊

——地高辛治療血濃為1~2ng/ml ——水楊酸鹽治療血濃為20~100g/ml

濃度大——預(yù)處理要求稍低 濃度低——樣品制備要求高第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理返回第二節(jié)

二、樣品制備考慮2/4/202360體內(nèi)藥物分析3.藥物測定目的

藥物測定目的不同——樣品預(yù)處理的要求不同：

急性中毒病例

——要求快速鑒定所懷疑的藥物，應(yīng)在盡可能短的時間內(nèi)獲得其濃度的數(shù)據(jù)，對樣品預(yù)處理的要求可以粗放些

第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理返回第二節(jié)

二、樣品制備考慮2/4/202361體內(nèi)藥物分析3.藥物測定目的

測定藥物及代謝物

——要求使代謝物從綴合物中釋放出來并在不同pH介質(zhì)中分離獲得酸性、中性或堿性代謝物，對樣品預(yù)處理的要求全面、細(xì)致第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理返回第二節(jié)

二、樣品制備考慮2/4/202362體內(nèi)藥物分析4.選用的生物樣品類型

待測生物樣品的類型決定樣品預(yù)處理方法：

血漿、血清——常需去除蛋白質(zhì)

唾液——主要采用離心沉淀除去粘蛋白

尿液——常采用酸或酶法使綴合物水解

頭發(fā)——需要將頭發(fā)進(jìn)行有機破壞后測定微量元素第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理返回第二節(jié)

二、樣品制備考慮2/4/202363體內(nèi)藥物分析5.樣品預(yù)處理與分析技術(shù)的關(guān)系

1.分析方法特點(是否專屬、是否具有分離能力) 2.檢測系統(tǒng)對雜質(zhì)污染的耐受程度決定樣品預(yù)處理和需要凈化的程度

第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理返回第二節(jié)

二、樣品制備考慮2/4/202364體內(nèi)藥物分析三、生物樣品的預(yù)處理與制備技術(shù)

生物樣品的預(yù)處理大致分為以下五類

1．有機破壞法

2．去除蛋白法

3．溶劑萃取法

4．綴合物的水解

5．化學(xué)衍生化法第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理返回第二節(jié)2/4/202365體內(nèi)藥物分析（一）有機破壞法

應(yīng)用——微量元素測定

方法

1．濕法破壞

2．干法破壞

3．氧瓶燃燒法返回毛發(fā)樣品的制備

三、預(yù)處理與制備第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理2/4/202366體內(nèi)藥物分析1.

濕法破壞

常用試劑—硝酸或硝酸-高氯酸

特點—破壞能力強、反應(yīng)激烈，無機金屬離子為高價態(tài)

應(yīng)用—適用于血、尿、組織等生物樣品的破壞

缺點—含氮雜環(huán)藥物的破壞不夠完全

注意—切勿蒸干、以免爆炸

樣品用量—金屬元素量10~100g，血樣

10~15ml、尿樣50ml返回毛發(fā)樣品的制備第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理2/4/202367體內(nèi)藥物分析返回毛發(fā)樣品的制備第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理高溫爐高溫破壞應(yīng)用——適合人發(fā)樣品的破壞2.

干法破壞2/4/202368體內(nèi)藥物分析3.氧瓶燃燒（oxygenflaskcombustion）

特點——操作簡單、快速、設(shè)備簡單 儀器裝置——附圖二

返回毛發(fā)樣品的制備第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理2/4/202369體內(nèi)藥物分析應(yīng)用——血漿、人發(fā)中鹵素、硫、硒等血漿：血漿1ml分次點于無灰濾紙上→60℃烘干→按規(guī)定折疊后固定

人發(fā)：洗凈、干燥（60℃~80℃）→剪碎→稱取0.1~0.3g置無灰濾紙中心→按規(guī)定折疊固定2/4/202370體內(nèi)藥物分析（二）去除蛋白質(zhì)

非破壞性生物樣品預(yù)處理的第一步可使結(jié)合型藥物釋放

1.去除蛋白后取上清液直接分析測定

2.去除蛋白后取上清液經(jīng)進(jìn)一步分離純化、濃集后分析測定第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理返回第二節(jié)

三、預(yù)處理與制備2/4/202371體內(nèi)藥物分析

去除蛋白質(zhì)的方法

1.加入與水混溶的有機溶劑—蛋白質(zhì)脫水沉淀2.加入中性鹽—“鹽析”沉淀蛋白質(zhì)3.加入強酸—與蛋白質(zhì)陽離子(銨基)

形成不溶性鹽沉淀

第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理2/4/202372體內(nèi)藥物分析

去除蛋白質(zhì)的方法

4.加入重金屬鹽—與蛋白質(zhì)陰離子

(羧基)形成不溶性鹽沉淀5.超濾法—半透膜濾除可溶性生物大分子物質(zhì)(蛋白質(zhì))6.酶水解法—蛋白分解酶分解蛋白質(zhì)7.加熱法—蛋白質(zhì)變性凝固第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理2/4/202373體內(nèi)藥物分析1.

加入與水相混溶的有機溶劑常用有機溶劑:乙腈、甲醇、丙酮、四氫呋喃血樣與溶劑體積比—1∶(1~3)可除去90%以上蛋白質(zhì)(附圖三)

第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理乙腈—塊狀絮凝物、易于分離；成分損失可能性大，上清液pH為8.5~9.5甲醇—細(xì)小顆粒沉淀、不易分離；成分損失可能性小，上清液pH為8.5~9.5超速離心分離（12000r/min)—離心1~2min2/4/202374體內(nèi)藥物分析2.

加入中性鹽常用中性鹽—飽和硫酸銨、硫酸鈉、鎂鹽、磷酸鹽及枸櫞酸鹽等試劑用量—血清與飽和硫酸銨比例為1∶2時除去90%以上的蛋白質(zhì)(附圖四)

分離—高速(12000r/min)離心 上清液液性——pH7.0~7.7第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理2/4/202375體內(nèi)藥物分析3.加入強酸常用的強酸——10%三氯醋酸、6%高氯酸、

5%偏磷酸等試劑用量——血清與強酸比例為1∶0.6時，除去90%以上的蛋白質(zhì)(附圖四)分離——高速(12000r/min)離心1~2min上清液液性——pH0~4過量三氯醋酸——煮沸分解為氯仿和二氧化碳高氯酸——碳酸鉀、醋酸鉀或氫氧化鈉等中和后加乙醇使產(chǎn)生高氯酸鉀（鈉）沉淀第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理2/4/202376體內(nèi)藥物分析4.

加入含鋅鹽及銅鹽的沉淀劑

當(dāng)溶液pH高于蛋白質(zhì)的等電點時，蛋白質(zhì)分子中帶陰電荷的羧基與金屬陽離子形成不溶性鹽沉淀

常用沉淀劑—CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH

血清與沉淀劑比例—1∶(1~3)，分離—高速(10000r/min)離心 上清液液性—pH分別為5.7~7.3和6.5~7.5第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理2/4/202377體內(nèi)藥物分析5.

超濾法性質(zhì)—以多孔性半透膜(超濾膜)作為分離介質(zhì)的一種膜分離技術(shù)；特點—無需加熱；無需添加化學(xué)試劑；無相變化；無破壞性應(yīng)用—游離藥物首選方法，尤其適合TDM操作—分子量截留值在5萬左右的超濾膜過濾可將分子量大的血漿蛋白以及結(jié)合了的藥物的血漿蛋白分離第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理2/4/202378體內(nèi)藥物分析

6．酶水解法

加入適量的酶和緩沖液，置水浴上水解一定時間，過濾或離心，取上清液供萃取用

最常用的酶—蛋白水解酶中的枯草菌溶素可在較寬的pH范圍(pH7.0~11.0)內(nèi)使蛋白的肽鍵降解，在50~60℃具有最大活力

第三章生物樣品與樣品制備第一節(jié)生物樣品的種類采集返回去除蛋白質(zhì)方法2/4/202379體內(nèi)藥物分析7.

加熱法

測定對熱穩(wěn)定性好的組分時，可采用加熱的方法將一些熱變性蛋白沉淀 加熱溫度視欲測組分的熱穩(wěn)定性而定，通?？杉訜岬?0℃；蛋白沉淀后可用離心或過濾除去

優(yōu)點——方法最簡單

缺點——只能除去熱變性蛋白

第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理2/4/202380體內(nèi)藥物分析（三）分離、純化與濃集

在生物樣品的制備過程中，進(jìn)行選擇性分離、純化與濃集

分離—消除內(nèi)源性物質(zhì)、代謝物或其它共存藥物的干擾

純化與濃集—提高被測藥物的靈敏度

樣品經(jīng)分離、純化與濃集與測定方法相結(jié)合，達(dá)到專屬性強、靈敏度高、準(zhǔn)確性好

第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理返回第二節(jié)

三、預(yù)處理與制備2/4/202381體內(nèi)藥物分析生物樣品的分離、純化方法

——液—液萃取法(傳統(tǒng)的方法) ——固相萃取法(液—固萃取法) ——自動化固相萃取技術(shù)

——固相微萃取

——膜萃取技術(shù)

——微透析技術(shù)

——超臨界流體萃取法第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理2/4/202382體內(nèi)藥物分析1.

液—液萃取法

（liquid-liquidextraction,LLE）大多數(shù)藥物為脂溶性，在有機溶劑中溶解度大于水中

大多數(shù)內(nèi)源性雜質(zhì)是強級性的水溶性物質(zhì)采用有機溶劑萃取法第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理2/4/202383體內(nèi)藥物分析2/4/202384體內(nèi)藥物分析

1.

液—液萃取法

（liquid-liquidextraction,LLE）溶劑選擇—合適的溶劑是成功的主要條件①了解藥物與溶劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其性質(zhì)

—相似相溶的原則②對藥物未電離分子可溶，電離形式分子不溶③沸點低、易揮散，毒性小與水不相混溶④不影響紫外檢測⑤具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性和惰性 第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理2/4/202385體內(nèi)藥物分析液-液萃取法

有機溶劑萃取次數(shù)

—通常為1次，必要時2~3次有機溶劑每次用量

—與水相體積比通常為1:1或2~5:1

通過萃取回收率確定最佳萃取次數(shù)與每次的溶劑用量第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理2/4/202386體內(nèi)藥物分析由藥物的pKa確定堿性藥物最佳pH值：高于pKa值1~2個

pH單位酸性藥物最佳pH值：低于pKa值1~2個

pH單位一般規(guī)則：堿性藥物在堿性pH值、酸性藥物在酸性pH值介質(zhì)中提取

第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理液-液萃取法水相pH值:2/4/202387體內(nèi)藥物分析

生物樣品宜在堿性或近中性提取，生物基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)多為酸性，在堿性下不易萃取 空白血清在pH2、pH7和pH13緩沖液中乙醚提取，提取液用RP-HPLC(UV)測定，堿性藥物在pH13下提取液雜質(zhì)峰少

第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理液-液萃取法水相pH值:2/4/202388體內(nèi)藥物分析空白血清乙醚提取物的HPLC色譜圖第三章附圖五返回液-液萃取(續(xù))pH13pH7pH22/4/202389體內(nèi)藥物分析其他方法

①離子對提取法（ion-pairextraction）②提取烷基化法（extractivealkylation）

——適用于離子化傾向較大，難以用溶劑直接提取的極性藥物第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理2/4/202390體內(nèi)藥物分析離子對提取法

一種有機溶劑提取離子性藥物的方法

原理：在體液(水溶液)中呈離解狀態(tài)的酸性或堿性有機藥物(Q)，與呈相反電荷離子(X)作用形成具有一定脂溶性的離子對(QX)，再用有機溶劑提取

第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理2/4/202391體內(nèi)藥物分析

DQ——分配系數(shù)，表示藥物在有機相和水相中的摩爾濃度比，數(shù)值越大，提取到有機相中的藥物量越多

DQ值的大小——由提取常數(shù)EQX和水相中反離子濃度[X-]aq決定第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理以堿性藥物為例，反應(yīng)式如下：2/4/202392體內(nèi)藥物分析

測定堿性藥物——用烷基磺酸鹽

（RSO3-）作為反離子

如戊~辛烷磺酸鈉、月桂磺酸鈉等測定酸性藥物——用烷基季銨類化合物

（R4N+·X-）作為反離子

如氫氧化四乙基銨、四丁基銨、四辛基銨等

第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理反離子的選擇2/4/202393體內(nèi)藥物分析

選用對離子對溶解度大的溶劑氯仿、二氯甲烷等

有機相與水相比例1：1或2：1第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理常用的提取溶劑2/4/202394體內(nèi)藥物分析

體液中呈陰離子狀態(tài)的藥物主要有磺酸類、羧酸類及代謝物葡萄醛酸苷等體液中能離解成陽離子的藥物主要是有機胺類，尤其是季銨類藥物第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理離子對提取應(yīng)用的藥物2/4/202395體內(nèi)藥物分析

第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理反相離子對提取法應(yīng)用皮質(zhì)酮葡醛酸綴合物的離子對提取因含有羧基藥物呈陰離子狀態(tài)存在反離子——四戊基銨有機相——氯仿2/4/202396體內(nèi)藥物分析

2.

固相萃取法

（Solid-phaseextraction,SPE）

原理

將不同填料作為固定相裝入微型小柱，當(dāng)含有藥物的生物樣品溶液通過時，由于受到吸附、分配、離子交換或其它親和力作用，藥物或雜質(zhì)被保留在固定相上，用適當(dāng)溶劑清洗雜質(zhì)，再用適當(dāng)溶劑洗脫藥物。第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理返回(三)樣品的分離與純化2/4/202397體內(nèi)藥物分析2/4/202398體內(nèi)藥物分析常用洗脫方式①藥物與固定相的親和力比雜質(zhì)強而被保留，用一種對藥物親和力更強的溶劑洗脫②雜質(zhì)與固定相的親和力比藥物強藥物被直接洗脫

第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理返回(三)樣品的分離與純化固相萃取法2/4/202399體內(nèi)藥物分析固相萃取法

固相的選擇原則

固相與被測組分應(yīng)具有相似的極性①親脂型（大孔吸附樹脂、親脂性鍵合相硅膠）②親水型（硅膠、硅藻土、棉纖維）③離子交換型

第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理2/4/2023100體內(nèi)藥物分析固相萃取法實驗步驟第一步：用甲醇潤濕小柱，活化填料第二步：用水或適當(dāng)?shù)木彌_液沖洗小柱

—除去殘留的甲醇第三步：加樣，使樣品經(jīng)過小柱，棄去廢液第四步：用水或適當(dāng)?shù)木彌_液沖洗小柱，去除內(nèi)源性雜質(zhì)第五步：選擇適當(dāng)?shù)南疵撊軇┫疵摫环治鑫铮占疵撘?，揮干溶劑，備用或直接進(jìn)行在線分析第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理2/4/2023101體內(nèi)藥物分析固相萃取法注意：

1.血漿樣品可直接上柱

2.樣品量0.1~2ml3.流速1~2ml/min第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理2/4/2023102體內(nèi)藥物分析固相萃取法方法特點優(yōu)點①引入雜質(zhì)少②完全避免乳化的形成③在優(yōu)化條件下有較高萃取率、重現(xiàn)性較好④使用的溶劑大多可與水混溶，易于自動化

第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理缺點①價格昂貴②技術(shù)要求高③批-批之間有差異2/4/2023103體內(nèi)藥物分析固相萃取法各種方法的比較第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理固體萃取劑萃取機理被萃取物回收率選擇性方便、省時性親脂型親脂性鍵合相硅膠憎水吸附較親脂或具有較大親脂部分結(jié)構(gòu)中中很好大孔吸附樹脂中中好離子交換型離子交換樹脂離子交換及憎水吸附可成為帶電的形式好好差親水型硅膠硅藻土棉纖維填料表面水層與有機溶劑流動相之間的分配（硅膠可能還有吸附作用）較親脂好中中2/4/2023104體內(nèi)藥物分析SPE與LLE及沉淀蛋白法的比較SPE——高提取率及高選擇性，快速、簡單，可自動化，應(yīng)用較多LLE——兩相間分配平衡時間較長萃取回收率及選擇性隨藥物及萃取條件而變化沉淀蛋白法——快速簡便、回收率高；待測物含量低時不適用

第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理2/4/2023105體內(nèi)藥物分析3．自動化SPE技術(shù)

優(yōu)點

①節(jié)約時間，400個/hr，確保了較高的工作效率②減少了操作誤差，提高準(zhǔn)確度和精密度③安全性好，可避免人對有毒樣品的接觸

缺點

①殘留物對測定的影響②在采用連續(xù)測定時，要考慮樣品理化性質(zhì)的穩(wěn)定性對測定的影響第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理返回(三)樣品的分離與純化2/4/2023106體內(nèi)藥物分析4．固相微萃取法

（Solid-phasemicroextraction

SPME

）

SPME裝置簡單，類似于氣相色譜微量注射器，其基本裝置如圖

第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理

1．壓桿2．簡體3．壓桿卡持螺釘4．Z形槽5．簡體視窗6．調(diào)節(jié)針頭長度的定位器7．拉伸彈簧8．密封隔膜9．注射針管10．熔融石英纖維11．熔融石英纖維返回(三)樣品的分離與純化2/4/2023107體內(nèi)藥物分析SPME操作方法

固相微萃取方法分為萃取過程和解吸過程兩步 ①萃取過程—具有吸附涂層的萃取纖維暴露在樣品中進(jìn)行萃取 ②解吸過程—將已完成萃取過程的萃取器針頭插入氣相色譜進(jìn)樣裝置的氣化室內(nèi)，使萃取纖維暴露在高溫載氣中，并使萃取物不斷地被解吸下來，進(jìn)入后序的氣相色譜分析第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理2/4/2023108體內(nèi)藥物分析SPME的特點

①集采樣、萃取、濃集、進(jìn)樣于一體，避免引入多步操作誤差 ②無需萃取溶劑，樣品量小、空白值小 ③萃取選擇性高 ④纖維涂層（萃取頭）可重復(fù)用上百次 ⑤適用于分析揮發(fā)性和非揮發(fā)性物質(zhì) ⑥與GC及HPLC、MS等聯(lián)用，自動化分析

目前SPME使用的固相涂層種類限制了它的應(yīng)用，但該法極具前途第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理2/4/2023109體內(nèi)藥物分析6.

微透析技術(shù)（Microdialysis,MD）

——膜分離技術(shù) 利用膜透析原理，微量地對細(xì)胞液進(jìn)行流動性連續(xù)采樣的新型采樣和色譜樣品制備技術(shù) 微透析技術(shù)可以用來研究生物體在活動時體液組成的一些變化 微透析系統(tǒng)組成