第一章基因工程概述

基因工程考核方法

平時成績10%100%實驗成績20%閉卷考試70%考勤，平時作業(yè)考勤、實驗結果、報告待定主要參考資料張惠展。基因工程。高教出版社。王關林等.植物基因工程.科學出版社。吳乃虎等.基因工程原理.科學出版社。T.A.Brown,魏群等基因克隆和DNA分析高教出版社?

生物技術通報?中國生物工程雜志?農業(yè)生物技術學報?生物工程學報?生物技術?遺傳?Moleculargeneticsandgenomics

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Nature《基因工程》第一章基因工程概述第二章DNA重組克隆的單元操作1.基因工程的載體和工具酶2.基因工程的常規(guī)技術第三章基因在大腸桿菌中的表達第四章基因在酵母中的表達第五章轉基因植物第六章轉基因動物第七章第二代基因工程第八章第三代基因工程第一章基因工程概述第一節(jié)基因工程的誕生和發(fā)展第二節(jié)基因工程的研究內容、基本原理、基因工程的成就和前景展望第一節(jié)基因工程的誕生和發(fā)展一、基因順反子階段

摩爾根的基因階段

孟德爾遺傳因子階段

現代基因階段

基因的研究MendelG.J.(1822-1884).1856-1864豌豆雜交實驗。Mendel的遺傳因子階段1866年發(fā)表論文，提出分離規(guī)律和獨立分配規(guī)律1900年Mendel遺傳規(guī)律被重新發(fā)現遺傳學的元年Mendel提出：生物的某種性狀是由遺傳因子負責傳遞的。是顆粒性的，體細胞內成雙存在，生殖細胞內成單存在。遺傳因子是決定性狀的抽象符號。1909年丹麥遺傳學家Johannsen(1859-1927)發(fā)表了“純系學說”首先提出了“基因”的概念，代替了Mendel“遺傳因子”的概念。但沒有提出基因的物質概念。Morgan的基因階段1910年以后，MorganT.H.等提出了基因的連鎖遺傳規(guī)律。說明了基因是在染色體上占有一定空間的實體?；虿辉偈浅橄蠓?，被賦予物質內涵。連鎖遺傳規(guī)律的提出順反子階段1957年，本澤爾（SeymourBenzer）以T4噬菌體為材料，在DNA分子水平上研究基因內部的精細結構，提出了順反子（cistron）概念。順反子是1個遺傳功能單位，1個順反子決定1條多肽鏈?，F代基因階段

1．操縱子

（調節(jié)基因＋操縱基因＋結構基因）現代基因階段2．跳躍基因

指DNA能在有機體的染色體組內從1個地方跳到另一個地方，它們能從1個位點切除，然后插入同一或不同染色體上的另一個位置。3．斷裂基因

1個基因被間隔區(qū)分成不連續(xù)的若干區(qū)段，這種編碼序列不連續(xù)的間斷基因被稱為斷裂基因。4．假基因

不能合成出功能蛋白質的失活基因

。5．重疊基因

不同基因的核苷酸序列有時是可以共用的即重疊的?，F代對基因的定義是DNA分子中含有特定遺傳信息的一段核苷酸序列，是遺傳物質的最小功能單位。

一般認為1973年是基因工程誕生的元年（S.Cohen等獲得了卡那霉素和四環(huán)素雙抗性的轉化子菌落)理論上的三大發(fā)現和技術上的三大發(fā)明對于基因工程的誕生起到了決定性的作用。二、基因工程的誕生1944年，AveryO.T.利用肺炎雙球菌轉化實驗1、DNA是遺傳物質被證實40年代，DNA是遺傳物質被證實1944年，美國洛克菲勒研究所的OswaldAvery等公開發(fā)表了改進的肺炎雙球菌實驗結果。（1）S型菌細胞提取物及其純化的DNA都可使R型菌轉變成S型菌；（2）經DNase處理的S型菌細胞提取物失去了轉化作用。（3）經胰蛋白酶處理的S型菌細胞提取物仍有轉化作用。不僅證實了DNA是遺傳物質，而且證明了DNA可以將一個細菌的性狀轉給另一個細菌，他的工作被稱為是現代生物科學的革命性開端。Watson和Crick2、DNA雙螺旋模型的提出50年代，DNA的雙螺旋模型的提出和DNA復制機理的闡明

DNA是遺傳物質已被證實，但是DNA是怎樣攜帶并傳遞遺傳信息的？在細胞增殖過程中，DNA是怎樣復制的？因此，對于DNA結構的研究成為了當時生物學家研究的熱點。1953年，FrancisCrick和JamesWatson搜集了力所能及的資料，提出了DNA的雙螺旋模型。隨后，DNA的半保留復制和半不連續(xù)復制機理也被闡明，為基因工程的誕生奠定了堅實的理論基礎。Nireberg等為代表的一批科學家3、“中心法則”和“操縱子學說”的提出60年代，確定了遺傳信息的傳遞方式（中心法則）

既然，DNA是遺傳信息的載體，那么它是如何傳遞遺傳信息的呢？遺傳信息又是如何控制生物的表型性狀的呢？以Nireberg等為代表的一批科學家經過艱苦的努力，確定了遺傳信息以密碼方式傳遞，每三個核苷酸組成一個密碼子，代表一個氨基酸，到1966年，全部破譯了64個密碼子，并提出了遺傳信息傳遞的“中心法則”。

原核生物的基因調控操縱子模型1961年，JacquesMonod和FancoisJacob提出了原核基因調控的操縱子模型（operonmodel）。1970年Smith等分離并純化了限制性核酸內切酶HindII，1972年，H.W.Boyer等相繼發(fā)現了ＥcoRI一類重要的限制性內切酶。

4、工具酶的發(fā)現和應用1967年，世界上有五個實驗室?guī)缀跬瑫r發(fā)現DNA連接酶，特別是1970年H.G.Khorana等發(fā)現的T4DNA連接酶具有更高的連接活性。4、工具酶的發(fā)現和應用1970年，Baltimore等和Temin等在RNA腫瘤病毒中各自發(fā)現了反轉錄酶，完善了中心法則，用于構建cDNA文庫。4、工具酶的發(fā)現和應用載體主要是小分子量的復制子如：病毒、噬菌體、質粒。1972年，美國Stanford大學的P.Berg等首次成功地實現了DNA的體外重組；5、載體的發(fā)現及其應用6、重組子導入受體細胞技術1944年，肺炎鏈球菌被成功轉化。1970年，大腸桿菌才被成功轉化，得益于CaCl2的應用

(二)、基因工程誕生的標志1972年，P.Berg等，成功地實現了DNA的體外重組。用限制性核酸內切酶EcoRI，在體外對猿猴病毒SV40的DNA和λ噬菌體的DNA分別進行酶切，然后再用T4DNA連接酶把兩種酶切的DNA片段連接起來，從而獲得第一個體外重組的雜種DNA分子。他們因此獲得1980年諾貝爾化學獎(同Sanger、Gilbert分享)。1973年，S.Cohen等，史上第一次實現重組體轉化成功的實驗。SV40λ噬菌體EcoRIEcoRIT4連接酶第一個重組分子第一個轉化成功

的重組DNA分子(三)、基因工程的成熟1981年，轉基因鼠1983年，KB.Mullis發(fā)明PCR儀，于1993年獲諾貝爾化學獎。

人類基因組計劃（HGP）2001年２月１２日，中、美、日、德、法、英６國科學家和美國塞萊拉公司聯(lián)合公布了人類基因組圖譜及初步分析結果：人類基因組包含了大約３萬到４萬個基因，它們由３２億個堿基對組成。這是人類在探索自身奧秘過程中又向縱深邁進了一大步。預計整個人類基因組的完成圖可于２００３年繪就.(四)、進入第二代基因工程

（蛋白質工程）(五)、進入第三代基因工程

（途徑工程）第二節(jié)基因工程的研究內容一、基因工程的概念(狹義)

在分子水平上，提取或合成不同生物的遺傳物質，在體外進行切割、再和某一載體進行拼接重組，然后再將重組的DNA導入宿主細胞內，最后實現目的基因穩(wěn)定復制和表達的過程。

(廣義)下游產業(yè)化一、基因工程的概念生物工程biologicalengineering遺傳工程geneticengineering基因工程geneengineering分子克隆molecularcloning基因克隆genecloning基因操作genemanipulation重組DNA技術recombinantDNAtechnique二、基因工程研究的基本步驟1、從生物體中分離得到目的基因（或DNA片段）2、在體外，將目的基因插入能自我復制的載體中得到重組DNA分子。3、將重組DNA分子導入受體細胞中，并進行繁殖。4、選擇得到含有重組DNA分子的細胞克隆，并進行大量繁殖，從而使得目的基因得到擴增。5、進一步對獲得的目的基因進行研究和利用。比如，序列分析、表達載體構建、原核表達以及轉基因研究和利用等。三、基因工程的基本流程基因分離酶切載體酶切基因和載體連接導入細菌重組質粒繁殖重組克隆的選擇序列分析和基因表達等研究導入植物細胞基因工程操作流程轉連三大要素載體供體受體基因工程的技術路線合成基因基因組DNA組織、器官、細胞mRNAcDNA合成文庫、基因組文庫、cDNA文庫目的基因克隆目的基因轉化或轉染原核細胞表達真核細胞表達植物中表達動物中表達人體表達構建優(yōu)化載體寡聚核苷酸探針DNA序列篩選基因工程的基本原理1.主要研究內容目的基因的制備和分離；選擇或改造表達載體，將目的基因插入到表達載體上；重組DNA導入宿主細胞；重組體篩選和鑒定；外源基因的在宿主細胞中表達2.提高外源目的基因穩(wěn)定高效表達的策略：尋找最佳培養(yǎng)工程菌的工程和工藝條件，從而年提高工程菌的增殖和代謝速度，達到了外源基因的最佳表達。受體細胞中載體DNA獨立于染色體外而有自主復制特性，提高外源基因在受體細胞中的拷貝數；通過對基因轉錄調控元件如啟動子、增強子等的篩選，突變和重組，然后與外源基因精細拼接，起到強化外源基因的轉錄，并提高表達水平；通過對基因翻譯元件如核糖體結合位點及密碼子等的選擇，突變和重組，使外源蛋白在細胞中大量合成；第三節(jié)基因工程的成就和研究進展成就：在醫(yī)藥領域在農業(yè)領域在工業(yè)領域研究進展：主要講中國的1、基因工程的應用性研究

a、基因工程藥物的研究b、基因診斷和基因治療PCR診斷關鍵是設計合成待鑒定病原菌特異序列的引物。對細菌性疾病的診斷可以防止抗生素的濫用，能檢測出病原菌是否帶有抗藥性基因。利用待測菌不同特異片段，設計多對引物即套式PCR，能夠增大檢測的準確性?；蛑委熋绹鴩⑿l(wèi)生研究院給一名患有先天性重度聯(lián)合免疫缺陷病的4歲女孩實施了首例基因治療。這種疾病因腺苷脫氨酶（ADA）基因變異引起。c、轉基因植物轉基因植物抗除草劑的水稻d、轉基因動物和器官移植器官移植器官再造

艾妮莎．艾亞拉（AnissaAyala）的故事：1988年的春天，艾妮莎還是一名高二的學生時，突然患了骨髓淋巴癌。要徹底治療，必須徹底清除其原有的骨髓干細胞，換以新的相容的骨髓細胞。艾妮莎的父母四處奔走，搜尋骨髓捐贈者，但兩年的努力均告失敗。艾妮莎的45歲的父親與42歲的母親決心與命運一博，再度懷孕，于1990年4月生下了艾妮莎的妹妹瑪瑞莎。14個月以后，妹妹與姐姐做了骨髓移植手術，艾妮莎終于健康地活下來了。動物器官反應器：血液反應器和乳腺反應器意大利醫(yī)生塞維里諾·安蒂諾里3/9/02法國科學家布里吉特·布瓦瑟利耶2002年12月25日通過電話告訴法新社，世界上第一個克隆嬰兒“夏娃”已經降生。03年1月3日她又宣布，第二個克隆人降生?？寺雰嚎寺〉恼嬗绊懺偕祟?，撫平喪子之痛試管嬰兒，不孕者的救星冷凍胚胎，優(yōu)生選擇代理母親，借腹懷胎復制明星，圓追星夢添加基因，創(chuàng)基因貴族基因再造，器官移植試管嬰兒冷凍受精卵，篩選胚胎訂做親愛寶貝---愛麗絲的故事：對冷凍胚胎的身高，體重，外表，生理及身體的特征，天生的性格與智能特征，易患復雜及傳染疾病的先天傾向，單一基因嚴重異常的概率等作一預測與綜合評價，從而決定選擇哪一個受精卵進行胚胎移植。代理孕母到1996年4月為止，美國比佛利山“代理孕母暨捐卵中心”已經安排了456例代理孕母寶寶的誕生；而在肯塔基州，代理孕母協(xié)會也已安排了500多例寶寶出生。美國的代理孕母產業(yè)方興未艾，從Internet網上可找到美國代理孕母中心公司的網址：

上面列有各州代理孕母中介商和全套服務的經紀商。克隆的負面影響社會問題：基因父母，生父母，養(yǎng)父母倫理問題：媽媽還是姐姐或？人的價值問題：買賣的商品而非愛的結晶？個性的發(fā)揮等。人的進化問題e、基因工程其他領域的應用研究：

能源、材料、環(huán)保、酶制劑等。基因工程產品的管理與安全性問題基因工程產品與環(huán)境基因工程產品與遺傳多樣性基因診斷與個人隱私美國NIH<重組DNA分子研究準則>；聯(lián)合國“生物技術管理條例”；中國“基因工程安全管理辦法”重點放在安全生產和安全使用階段第三節(jié)基因工程的成就和研究進展成就：在醫(yī)藥領域在農業(yè)領域在工業(yè)領域研究進展：主要講中國的醫(yī)藥領域1977年，激素抑制素的發(fā)酵生產成功。Itakara等，化學合成的激素抑制素基因和大腸桿菌-半乳糖（苷）激酶基因插入到PBR322中得到重組質粒，并通過大腸桿菌生產出含有激素抑制素的嵌合型蛋白，經溴化氰處理后釋放出了有生物活性的激素抑制素。首次實現了真核基因的原核表達。用價值幾美元的9升培養(yǎng)液生產出50毫克的生物活性物質，這相當于50萬頭羊腦的提取量。1978年，Goeddel等，人胰島素的發(fā)酵生產成功。1979年，Goeddel等，又在大腸桿菌中成功表達了人生長激素基因。1980年，Nagata等，遺傳工程菌生產干擾素獲得成功。1981年，用遺傳工程菌生產的生物制劑包括動物口蹄疫疫苗、乙型肝炎病毒表面抗原及核心抗原、牛生長激素等。1982年，重組DNA技術生產的藥物-人胰島素進入商品化生產。1983年，基因工程生產狂犬病疫苗取得突破型進展?！?3‘84‘85‘86‘87‘88‘89‘90‘91‘92‘93‘94‘95‘96‘97‘98‘99‘00‘01‘02FirsttransgenicPlant（煙草）Delay-ripeningtomatoCommercializedintheUSFirstfieldtestsHerbicideresistant,insectresistantplantscommercializedGMmaizeapprovedbyEU

FirstBtcornplants

RottingresistanttomatoapprovedbyFDA植物基因工程的發(fā)展迅速BT基因即是蘇云金芽胞桿菌基因。蘇云金芽胞桿菌可以分泌一種毒蛋白，對鱗翅目鞘翅目昆蟲（比如小菜蛾）有很強的殺傷作用。人類很早就研究利用BT菌來殺滅害蟲，總共有100多年歷史。隨著分子生物學技術的發(fā)展和基因克隆、DNA操作等技術出現，人類開始從BT菌中克隆其毒蛋白基因到工程菌中，制作生物農藥。不過現在隨著廣泛的應用，害蟲也大量出現抗藥性。Bt的毒素主要為內毒素和外毒素。外毒素指細菌在生命活動過程中排出體外的代謝物，包括α-外毒素、β-外毒素、γ-外毒素、不穩(wěn)定外毒素和水溶性外毒素等。內毒素又稱δ-內毒素、晶體毒素或殺蟲晶體蛋白3伴胞晶體由一種或幾種殺蟲晶體蛋白組成，在Bt對昆蟲的致死過程中起主要作用。Bt的致病機理——殺蟲機理

Bt伴胞晶體被敏感昆蟲攝食后，在中腸蛋白酶的作用下溶解并激活，釋放出毒素核心肽段；而后毒素作用于中腸上皮細胞，引起細胞膨脹和裂解，由此引起昆蟲腸道麻痹和腸道穿孔，消化道細胞的離子和滲透壓平衡遭到破壞，最終導致昆蟲死亡，這在昆蟲致死作用中占主導地位。植物轉基因育種的發(fā)展優(yōu)勢1、擴大了作物育種的基因庫

轉基因育種打破了常規(guī)育種的物種界限，來源于動植物和微生物的有用基因都可以導入作物，培育成具有某些特殊性狀的新型作物品種。2、提高了作物育種的效率

作物轉基因育種不僅大大縮短育種年限，而且可成功地改良某些單一性狀卻不影響改良品種的原有優(yōu)良特性。3、減輕了農業(yè)生產對環(huán)境的污染

轉基因抗蟲棉花的大面積種植和推廣，不僅可以減少化學殺蟲劑對棉農及天敵的傷害，而且可以大幅度降低用于購買農藥和蟲害防治的費用。另外，隨著高效固氮轉基因作物及高效吸收土壤中磷元素等營養(yǎng)元素的轉基因作物不斷問世和推廣，農用化肥的利用率將極大地提高，這對減少農田污染具有重要意義。4、拓寬了作物生產的范疇

各種有價值的蛋白產品都可以利用植物反應器進行高效生產，番茄、馬鈴薯、萵苣和香蕉等作物已被成功用于生產口服疫苗。另外，各種工業(yè)原料，比如纖維素、海藻糖和可降解塑料等也可以用植物來生產。有人甚至預言，除了鋼筋混凝土之外，未來的轉基因作物將可能生產出人類所需要的一切產品。1999年全球不同轉基因作物和應用面積2011年轉基因作物種植面積最大的國家是美國，達到6900萬公頃，主要為玉米(2368,-15.00,-0.63%)、大豆(4414,-19.00,-0.43%)、棉花(22090,-60.00,-0.27%)、油菜等。巴西、阿根廷分列第二和第三位，種植面積分別為3030萬公頃和2370萬公頃。其余名列前位的國家是印度、加拿大、中國、巴拉圭、巴基斯坦、南非和烏拉圭，種植面積均超過百萬公頃。植物基因工程研究植物基因組計劃植物分子育種高產、優(yōu)質、高效和多抗性植物作為反應器香蕉、馬鈴薯、番茄等水稻、玉米、棉花、大豆、高粱和番茄酒精、工業(yè)酶等工業(yè)領域環(huán)保工業(yè)

能降解工業(yè)廢品、農藥殘留等基因工程菌的構建酶制劑工業(yè)耐熱、耐壓、耐鹽、耐溶劑的酶基因轉化構建的工程菌食品工業(yè)改善食品品質的轉基因作物化學與能源工業(yè)生產乙醇、甘油、丙酮等的轉基因生物我國基因工程部分研究進展轉基因抗病蟲植物

我國科學家將抗蟲基因導入棉花，獲得了抗蟲植株，對棉蛉蟲的抗蟲效果十分顯著?？裹S矮病、赤霉病、白粉病轉基因小麥和抗青枯病馬鈴薯也已研究成功，開始田間加代繁殖。中國成轉基因作物主要種植國食品安全性仍是最大爭議ISAAA（國際農業(yè)生物技術應用服務組織）的創(chuàng)始者克萊夫·詹姆士（CliveJames）博士

2月28日再次來到中國《2012年度環(huán)球生物技術/轉基因作物使用情況研究報告》在最新的全球轉基因作物年度報告中，中國排在美國、巴西、阿根廷、加拿大、印度之后，轉基因作物的種植面積位居全球第六，種植的主要作物，包括棉花、木瓜、西紅柿、甜椒等。

到目前為止，全球有59個國家或地區(qū)批準了2497項轉基因申請，涉及25種作物319個轉化體。其中，1129項申請批準用于食品，813項申請用于飼料，555項申請用于種植。轉基因食品項目幾乎占據了全部申請量的一半。統(tǒng)計顯示，自那個保鮮西紅柿上市之后，轉基因食品在美國市場一發(fā)不可收拾?，F在，美國食品和藥品管理局確定的轉基因品種種類繁多，美國由此也成為了轉基因食品最多的國家，超過60%以上的加工食品含有轉基因成分，90%以上的大豆，50%以上的玉米、小麥是轉基因的?；蚬こ桃呙?/p>

乙型肝炎是危害我國人民健康的嚴重疾病，我國乙肝病毒攜帶者1億1千萬人，其中40％左右的慢性肝炎可能發(fā)展成為肝硬化和原發(fā)肝癌。以往乙肝疫苗是從人血清中提取，基因工程乙肝疫苗的研制成功，不僅有巨大的經濟效益，而且有巨大的社會效益?；蚬こ桃腋我呙缡俏覈脚鷾释斗攀袌龅牡谝环N高技術疫苗，在20多項指標上達到國際先進水平，獲國家科技進步一等獎。繼乙肝疫苗之后，我國又研制成功了痢疾、霍亂等數種基因工程疫苗，并經國家批準進入臨床試驗。

基因工程藥物干擾素是一種廣譜的抗病毒和抗腫瘤高技術藥物，對防治病毒性肝炎和惡性腫瘤有重要的作用?，F已有了3個品種的基因工程干擾素獲得國家新藥證書，開始大批量生產.如干擾素α-2a(因特芬)該產品已被國際醫(yī)學界認為是治療慢性乙型肝炎和丙型肝炎的有效藥物，同時也是進入腫瘤臨床治療的抗腫瘤最廣譜的新藥

。除此之外，我國還研制成功了肝癌導向藥物（生物炸彈）、系列惡性腫瘤輔助治療藥物等十余種基因工程藥物，有些已獲試生產文號或進入中試開發(fā)階段。動物克隆和轉基因研究２００３年３月２５日成功地獲得了我國首例轉基因體細胞克隆?！皹吠蕖?，２００３年１０月４日又成功地獲得了世界上第一頭轉有人巖藻糖轉移酶基因的體細胞克隆?！皫r娃”。

體細胞克隆?！皫r娃”，由于成功地轉有3個基因--人巖藻糖轉移酶基因、綠色熒光蛋白基因和新霉素抗性基