CRISPR敲基因的新技術(shù)

CRISPR/Cas9

Whatis

CRISPR？

【CRISPR】clusteredregulatoryinterspacedshortpalindromicrepeat。

成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)。是一種基因組編輯工具，它能夠完成RNA導(dǎo)向的DNA識(shí)別及編輯工具。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas系統(tǒng)最早是在細(xì)菌的天然免疫系統(tǒng)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，其主要功能是對(duì)抗入侵的病毒及外源DNA。1987年大阪大學(xué)（OsakaUniversity）的研究人員在E.coliK12的堿性磷酸酶基因附近發(fā)現(xiàn)了成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat,CRISPR），目前普遍認(rèn)為有40%的細(xì)菌基因組具有這樣的結(jié)構(gòu)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的組成.CRISPR/Cas9系統(tǒng)由CRISPR序列元件與Cas基因家族組成。其中CRISPR由一系列高度保守的重復(fù)序列（repeat）與同樣高度保守的間隔序列（spacer）相間排列組成。而在CRISPR附近區(qū)域還存在著一部分高度保守的CRISPR相關(guān)基因（CRISPR-associatedgene,Casgene）這些基因編碼的蛋白具有核酸酶活性的功能域，可以對(duì)DNA序列進(jìn)行特異性的切割。CRISPR/Cas9系統(tǒng)元件與特征CRISPR的結(jié)構(gòu)（以嗜熱鏈球菌LMD-9基因組CRISPR1/Cas系統(tǒng)的位點(diǎn)為例）。藍(lán)色表示Cas基因，包括廣泛存在的cas1和cas2，II類系統(tǒng)特征基因cas9和csn2。黑色表示重復(fù)間隔物序列（CRISPR）。黑色菱形表示CRISPR的重復(fù)序列（repeat）灰色長(zhǎng)方形表示間隔物序列（spacer）?？s寫：L，前端；T，末端；CRISPR/Cas9系統(tǒng)工作原理CRISPR/Cas作為原核生物中普遍存在的一種系統(tǒng)，最初的功能就是識(shí)別外源性入侵的核酸序列，并對(duì)其進(jìn)行特異性降解，以達(dá)到抗病毒的作用。這一過程分兩步進(jìn)行——crRNA的合成及在crRNA引導(dǎo)下的RNA結(jié)合與剪切，包含crRNA的生物學(xué)合成和RNA的結(jié)合與剪切兩大步驟。CRISPR/Cas9系統(tǒng)工作原理step1CRISPR區(qū)域第一個(gè)重復(fù)序列上游有一段CRISPR的前導(dǎo)序列（Leadersequence），該序列作為啟動(dòng)子來啟動(dòng)后續(xù)CRISPR序列的轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄生成的RNA被命名為CRISPRRNA（簡(jiǎn)稱crRNA）。step2CRISPR/Cas系統(tǒng)中crRNA與tracrRNA（反式激活的crRNA）形成嵌合RNA分子，即單向?qū)NA（SingleguideRNA,sgRNA）。sgRNA可以介導(dǎo)Cas9蛋白在特定序列處進(jìn)行切割，形成DNA雙鏈斷裂（Double-StrandedBreak,DSB），從而完成基因定向剪切編輯等各類操作。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的分類CRISPR/Cas系統(tǒng)可以分為I類系統(tǒng)、II類系統(tǒng)和III類系統(tǒng)。這三類系統(tǒng)又可以根據(jù)其編碼Cas蛋白的基因不同而分為更多的亞類。不同類型CRISPR/Cas系統(tǒng)完成干擾的步驟也有所不同。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的分類CRISPR/Cas9系統(tǒng)的分類在I類系統(tǒng)中，入侵的DNA有Cascade:crRNA復(fù)合體識(shí)別，PAM模塊則能促進(jìn)外源性DNA的識(shí)別，隨后核酸酶Cas3被募集并將目標(biāo)DNA降解。在II類系統(tǒng)中，只需要單獨(dú)的Cas9蛋白即可完成干擾，并不依賴一個(gè)多蛋白復(fù)合體，Cas9和反式激活的crRNA（tracrRNA）、前crRNA（pre-crRNA）形成復(fù)合體，該復(fù)合體促使RNA酶III將前crRNA加工為成熟的crRNA。在III類系統(tǒng)中，一個(gè)多蛋白復(fù)合體（Csm或Cmr）或Cas6促進(jìn)前crRNA轉(zhuǎn)化為成熟的crRNA，最終導(dǎo)致目標(biāo)DNA的降解II類CRISPR/Cas9系統(tǒng)它是利用一段小向?qū)NA（sgRNA）Cas9復(fù)合體系統(tǒng)靶向基因組編輯的步驟。將編碼密碼子優(yōu)化的Cas9（紅色）序列、一段核定位序列（NLS）和一段包括目標(biāo)靶序列的小向?qū)NA（sgRNA，黃色）序列同時(shí)構(gòu)建在一個(gè)質(zhì)粒中，再將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)目標(biāo)細(xì)胞。一個(gè)有功能的sgRNA:Cas9干擾復(fù)合體會(huì)在細(xì)胞內(nèi)完成組裝，該復(fù)合體會(huì)在PAM結(jié)構(gòu)的上游目標(biāo)DNA序列上誘導(dǎo)產(chǎn)生一個(gè)雙鏈斷裂（DSB），而DSB則能被宿主細(xì)胞的DNA修復(fù)系統(tǒng)、同源重組系統(tǒng)（HR）和非同源末端連接途徑（NHEJ）修復(fù)。HR系統(tǒng)以宿主的等位基因?yàn)槟０鍙?fù)原野生型序列，將序列恢復(fù)為斷裂前的狀態(tài)；而容易出錯(cuò)的NHEJ系統(tǒng)則會(huì)在目標(biāo)位點(diǎn)（灰色）引入插入和刪失。使用一段合成的供體DNA模板與Cas系統(tǒng)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，可以誘導(dǎo)HR（藍(lán)色），提高編輯效率。II類CRISPR/Cas9系統(tǒng)CRISPR技術(shù)的應(yīng)用近年來，由于基因工程技術(shù)的突飛猛進(jìn)，CRISPR/Cas儼然已經(jīng)成為科學(xué)界最炙手可熱的熱點(diǎn)之一被廣泛應(yīng)用于各類體內(nèi)和體外體系的遺傳學(xué)改造、轉(zhuǎn)基因模式動(dòng)物的構(gòu)建，甚至基因治療領(lǐng)域，在結(jié)合誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS）技術(shù)，人們可以將通過基因編輯修復(fù)的iPS細(xì)胞重新發(fā)育為正常組織和器官來供病人使用。CRISPR/Cas9存在的問題CRISPR的基因打靶系統(tǒng)，可讓我們編輯基因組中特定靶位點(diǎn)的遺傳信息。這種新方法揭示的系統(tǒng)，有可能會(huì)結(jié)合意想不到的位點(diǎn)，導(dǎo)致其中一些位點(diǎn)發(fā)生基因突變，這些突變可能對(duì)藥物療法的研究與開發(fā)，產(chǎn)生嚴(yán)重的后果。CRISPR/Cas9存在的問題同其他基因工程的方法手段一樣，CRISPR/Cas9技術(shù)手段的產(chǎn)物同樣也會(huì)存在并引起一些轉(zhuǎn)基因方面的爭(zhēng)議。CRISPR技術(shù)與其他基因技術(shù)對(duì)比

THREEONETWOCRISPRZNF

TALENCRISPR技術(shù)與其他基因技術(shù)對(duì)比不論是TALEN技術(shù)還是ZFN技術(shù)，其定向打靶都依賴于DNA序列特異性結(jié)合蛋白模塊的合成，這一步驟非常繁瑣費(fèi)時(shí)。而CRISPR/Cas技術(shù)作為一種最新涌現(xiàn)的基因組編輯工具，能夠完成RNA導(dǎo)向的DNA識(shí)別及編輯。CRISPR/Cas技術(shù)使用一段序列特異性向?qū)NA分子（sequence-specificguideRNA）引導(dǎo)核酸內(nèi)切酶到靶點(diǎn)處，從而完成基因組的編輯。CRISPR/Cas系統(tǒng)的開發(fā)為構(gòu)建更高效的基因定點(diǎn)修飾技術(shù)提供了全新的平臺(tái)。CRISPR技術(shù)相關(guān)專利科學(xué)家雜志4月15日?qǐng)?bào)道，著名的Broad研究院宣布，他們獲得了第一份熱門基因組編輯技術(shù)：CRIS