環(huán)境生物技術(shù)5(19)-污染物的生物毒性效應(yīng)研究方法(司)

有害物質(zhì)的環(huán)境毒理學(xué)研究方法1第五章第六節(jié)

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5.6有害物質(zhì)的環(huán)境毒理學(xué)

研究方法司萬童內(nèi)蒙古科技大學(xué)E-mail:siwt02@163.com生物分子細(xì)胞器細(xì)胞組織器官器官系統(tǒng)個(gè)體種群群落

生態(tài)系統(tǒng)2生物系統(tǒng)的各級生物學(xué)水平：污染物在生物化學(xué)和分子水平上的影響污染物在細(xì)胞和器官水平上的影響污染物在個(gè)體水平上的影響污染物在種群和群落水平上的影響化學(xué)污染物對生物的聯(lián)合作用3主要內(nèi)容：5.6.1污染物在生物化學(xué)和分子水平上的影響45污染物進(jìn)入機(jī)體后導(dǎo)致的生物化學(xué)變化包括：防護(hù)性生化反應(yīng)和非防護(hù)性生化反應(yīng)。作用類型例子后果防護(hù)性混合功能氧化酶的誘導(dǎo)加快新陳代謝，生成水溶性代謝物，從而加速排泄金屬硫蛋白的生成增加對金屬的束縛速度，從而降低金屬的生物利用率非防護(hù)性乙酰膽堿酯酶的抑制作用50％以上因抑制而產(chǎn)生可見的毒性效應(yīng)DNA加合物的生成若導(dǎo)致突變會發(fā)生損害作用表2－1對污染物的防護(hù)性和非防護(hù)性生化反應(yīng)什么是酶（enzyme）？酶是一種特殊的蛋白質(zhì)，在生物體內(nèi)對代謝活動起催化作用，本身不發(fā)生變化。受酶作用的物質(zhì)稱為基質(zhì)（底物），在酶作用下的反應(yīng)稱為酶促反應(yīng)。酶和污染物的相互作用污染物進(jìn)入機(jī)體后，一方面在酶的催化下，進(jìn)行代謝轉(zhuǎn)化，另一方面也導(dǎo)致體內(nèi)酶活性改變，影響酶的數(shù)量和活性。另外有些環(huán)境污染物對酶有誘導(dǎo)作用。目前已發(fā)現(xiàn)多種環(huán)境污染物能誘導(dǎo)生物體內(nèi)一些酶的活性增加，例如：有機(jī)氯農(nóng)藥、多氯聯(lián)苯、多環(huán)芳烴、表面活性劑、增塑劑和染料中間體等，均可對酶產(chǎn)生誘導(dǎo)作用。6(1)污染物對生物機(jī)體酶的影響污染物對酶輔助因子的影響一些污染物能與酶的輔助因子——金屬離子作用，從而使輔助因子失活，影響到酶的活性。例如：氰化物等能與細(xì)胞色素酶中的鐵離子結(jié)合，形成穩(wěn)定絡(luò)合物，而抑制細(xì)胞色素的酶活性，使其不能傳遞電子，則細(xì)胞內(nèi)的氧化代謝過程中斷，使機(jī)體不能利用氧，出現(xiàn)內(nèi)窒息性缺氧。對酶活性中心的影響污染物還能和酶的其它活性基團(tuán)結(jié)合，如汞和砷與某些酶的活性基團(tuán)結(jié)合就很牢固，從而使酶失去活性。破壞酶的結(jié)構(gòu)有些污染物能夠取代酶分子中的某些成分，從而使酶失去活性。如鈹?shù)亩咀饔脵C(jī)理就是能取代某些酶分子中的鎂和錳，破壞了酶的正常結(jié)構(gòu)，使酶失去活性。7與酶激活劑作用有些酶需要激活劑才能表現(xiàn)活性。酶激活劑往往是金屬離子，凡是能與激活劑作用的污染物都能抑制酶的活性。污染物與基質(zhì)競爭同種酶而抑制酶的作用污染物與底物有相似的結(jié)構(gòu)，也能與酶形成復(fù)合物，從而競相和酶發(fā)生作用。酶的抑制不可逆性抑制非競爭性抑制競爭性抑制8混合功能氧化酶（MFO）MFO是污染物在體內(nèi)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化相I過程中的關(guān)鍵酶系，它們對人工化學(xué)品解毒發(fā)揮了重要作用。MFO引起的生物轉(zhuǎn)化的反應(yīng)特征相同，但底物、產(chǎn)物的化學(xué)特性差別很大，即具有多種催化功能?；旌瞎δ苎趸福∕FO）的作用MFO存在于所有的脊椎動物和大部分的無脊椎動物中，其作用是代謝非極性的親脂性有機(jī)化合物，包括內(nèi)源性化合物和外源性化合物。從解毒作用來看，許多外源性化合物進(jìn)入體內(nèi)，經(jīng)MFO作用后發(fā)生各種變化，大多數(shù)被轉(zhuǎn)化成低毒易溶的代謝產(chǎn)物排出體外。但有的則變成高毒甚至致癌物。9①

混合功能氧化酶（MFO）活性氧（ActivatedOxygen）帶有2~3個(gè)電子的分子氧還原產(chǎn)物，主要有：·OH、O2-、H2O2活性氧的控制和消除由體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧可為抗氧化防御系統(tǒng)控制，消除活性氧對機(jī)體的傷害作用。某些污染物如多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯在生物體內(nèi)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化時(shí)產(chǎn)生大量活性氧。在一定范圍內(nèi)，這些活性氧可被體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)清除，但當(dāng)體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)不能消除這些活性氧時(shí)，它們可使DNA鏈斷裂、脂質(zhì)過氧化、酶蛋白失活等，從而引起機(jī)體氧化應(yīng)激或氧毒性。抗氧化防御系統(tǒng)酶超氧化物歧化酶（SOD）谷胱甘肽氧化酶（GPx）過氧化氫酶（Ct）10②抗氧化防御系統(tǒng)酶污染物對生物大分子的影響主要表現(xiàn)在以下方面：干擾正常的受體——配體的相互作用受體（receptor）是許多組織細(xì)胞膜上的大分子成分，配體（ligand）是生物體內(nèi)的一些具有生物活性的化學(xué)物。正常情況下，受體與配體結(jié)合形成受體－配體復(fù)合物，產(chǎn)生一定的生物學(xué)效應(yīng)。生物膜損傷不少環(huán)境化學(xué)物通過改變膜脂流動性，影響膜的通透性和鑲嵌蛋白質(zhì)的活性，改變其結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，從而產(chǎn)生生物效應(yīng)干擾細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)正常情況下細(xì)胞內(nèi)的鈣濃度較低（10－7～10－8mol/L），細(xì)胞外濃度較高（103mol/L

）。各種細(xì)胞毒物，如硝基酚、過氧化物、汞、鉛等重金屬離子均能干擾細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，引起細(xì)胞損傷和死亡。11（2）

污染物對生物大分子的影響干擾細(xì)胞能量的合成一些環(huán)境污染物可干擾糖類的氧化，使細(xì)胞不能合成能被生物利用的ATP，ATP使細(xì)胞生命活動得不到充足的能量供給脂質(zhì)過氧化(lipidperoxidation)與自由基

脂質(zhì)過氧化是細(xì)胞損傷的一種特殊方式,是由于產(chǎn)生了自由基而引起的,正常情況下,生物體內(nèi)氧化、還原和酶促反應(yīng)過程中，均可產(chǎn)生少量自由基，一般可被體內(nèi)存在的抗氧化物質(zhì)（如維生素C、維生素E）所對抗，對生物危害不大。當(dāng)大量污染物（自由基）進(jìn)入機(jī)體，造成機(jī)體抗氧化作用失衡，即可發(fā)生脂質(zhì)過氧化，對生物體造成危害。與生物大分子共價(jià)結(jié)合共價(jià)結(jié)合可改變生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能，引起一系列生物學(xué)改變，特別是與酶蛋白、脂肪、核酸等重要生物大分子共價(jià)結(jié)合，能改變其化學(xué)結(jié)構(gòu)，影響其生理功能，甚至導(dǎo)致變性和細(xì)胞死亡。12污染物對蛋白質(zhì)的影響主要表現(xiàn)在以下方面：導(dǎo)致蛋白質(zhì)化學(xué)損傷：細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及通透性改變；影響酶的催化功能等誘導(dǎo)生物機(jī)體內(nèi)一些功能蛋白的產(chǎn)生：如應(yīng)激蛋白（StressProteins）和金屬硫蛋白（Metallothionein）的產(chǎn)生，這些蛋白質(zhì)的產(chǎn)生可保護(hù)生物機(jī)體抵抗污染物的損害。注：金屬硫蛋白對二價(jià)金屬離子具有極高的親和力，在細(xì)胞內(nèi)起貯存必需的微量金屬如Zn、Cu和結(jié)合有毒金屬如Cd、Hg的作用，它與必需金屬的結(jié)合起調(diào)節(jié)這些金屬在細(xì)胞內(nèi)濃度的作用，而與有毒金屬結(jié)合則可以保護(hù)細(xì)胞免受金屬毒性影響。13例：污染物對蛋白質(zhì)的影響外源性化合物及其代謝產(chǎn)物能引起DNA損傷，它們與DNA的相互作用過程有以下四個(gè)階段：形成DNA加合物（DNAAddcuts）發(fā)生DNA的二次修飾DNA結(jié)構(gòu)的破壞被固定當(dāng)細(xì)胞分裂時(shí)，外源性化合物造成的危害可導(dǎo)致DNA突變及其基因功能的改變DNA加合物的形成是產(chǎn)生DNA損傷最早期的作用，隨后產(chǎn)生的最重要影響是DNA結(jié)構(gòu)的改變，如堿基置換、堿基丟失、鏈斷裂等。DNA加合物作為一項(xiàng)生物指標(biāo)來評價(jià)環(huán)境中化學(xué)污染物的遺傳毒性的研究日益受到重視。14污染物對DNA的影響對細(xì)胞膜的影響主要表現(xiàn)在以下方面：污染物引起的脂質(zhì)過氧化作用導(dǎo)致的損傷污染物可影響膜的離子通透性污染物與膜上的受體結(jié)合，干擾正常的生理功能155.6.2污染物在細(xì)胞和器官水平上的影響

（1）對細(xì)胞膜的影響在逆境脅迫下，植物體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧自由基。活性氧很容易使植物細(xì)胞內(nèi)膜發(fā)生過氧化作用或脫脂作用，而丙二醛則是細(xì)胞內(nèi)膜脂過氧化或脫脂的產(chǎn)物，會嚴(yán)重地?fù)p傷細(xì)胞的生物膜，降低膜中不飽和脂肪酸的含量，使膜的流動性降低，作為間接衡量植物體內(nèi)氧化損傷程度的指標(biāo)。16鎘-鋅-砷單一及復(fù)合污染對浮萍的毒性效應(yīng)

同一濃度處理水平下，單一重金屬污染對浮萍丙二醛含量影響的大小依次為Cd>Zn>As。與單一污染相比，復(fù)合污染對浮萍丙二醛的生態(tài)毒性效應(yīng)情況則較復(fù)雜，As+Cd對浮萍丙二醛含量的影響是因?yàn)閮烧叱尸F(xiàn)拮抗作用的結(jié)果，對浮萍細(xì)胞膜增透作用較弱。而其他3種復(fù)合污染在低濃度時(shí)對浮萍丙二醛含量影響較大，在高濃度時(shí)影響作用下降。同一濃度處理水平下，單一重金屬污染對浮萍的生態(tài)毒性效應(yīng)表現(xiàn)在對葉綠素的損傷程度為Cd>Zn>As，與單一污染相比，As+Cd和Zn+Cd復(fù)合污染對浮萍毒性增強(qiáng)，表現(xiàn)為協(xié)同作用，加強(qiáng)了對浮萍葉細(xì)胞的傷害；而As+Zn和As+Zn+Cd復(fù)合污染對浮萍的聯(lián)合毒性作用趨向于毒性減少的拮抗作用。17線粒體線粒體是細(xì)胞供能的場所。污染物可引起其結(jié)構(gòu)改變，從而影響線粒體的氧化磷酸化和電子傳遞功能光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是進(jìn)行激素和外源性化合物的代謝場所。糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)：通過附著或解離核糖體控制蛋白質(zhì)的合成例：多種化學(xué)致癌物如黃曲霉毒素能引起核糖體脫落，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成控制的改變。18（2）對細(xì)胞器的影響三個(gè)概念：靶器官、效應(yīng)器官和蓄積器官注1：靶器官不同于效應(yīng)器官，污染物的毒作用可以通過靶器官表現(xiàn)處來，也可由另外的效應(yīng)器官表現(xiàn)出來。注2：靶器官不同于蓄積器官，污染物在蓄積器官內(nèi)的濃度高于其他器官，但對蓄積器官并不一定顯示毒作用。對組織器官的影響對植物，表現(xiàn)為葉面出現(xiàn)點(diǎn)、片傷害斑，造成葉、蕾、花、果實(shí)等的脫落對動物，以重金屬污染為例：鉛可損害造血器官和神經(jīng)系統(tǒng)，鎘可損害肝臟、腎臟，導(dǎo)致骨痛病。19（3）

污染物對組織器官的影響污染物對植物在個(gè)體水平上的影響：主要表現(xiàn)為生長減慢、發(fā)育受阻、失綠黃化、早衰等污染物對動物在個(gè)體水平上的影響：主要表現(xiàn)為死亡、行為改變、繁殖下降、生長和發(fā)育抑制、疾病敏感性增加、代謝率變化205.6.3污染物在個(gè)體水平上的影響衡量致死效應(yīng)的指標(biāo)死亡率：死亡比例的大小，為評價(jià)污染物毒性大小的生物學(xué)指標(biāo)。致死劑量（LethalDose）或致死濃度（LethalConcentration）：能引起動物死亡的污染物的劑量或濃度。半數(shù)致死劑量（LD50）或半數(shù)致死濃度（LC50）：能引起50％的動物死亡的污染物的劑量或濃度。影響致死效應(yīng)的主要因素：污染物的種類及其物理化學(xué)性質(zhì)生物的種類作用時(shí)間、水質(zhì)條件，如溫度、硬度、溶解氧等多種污染物的綜合作用21（1）致死效應(yīng)行為毒性（BehavioralToxicity）的概念指一種污染物或其他因素（如溫度、光照、輻射）使得動物一種行為超過正常變化的范圍。水環(huán)境污染可影響的生物行為：回避行為捕食行為學(xué)習(xí)行為警惕行為社會行為對鳥類行為的影響有機(jī)磷農(nóng)藥可影響鳥的神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致鳥的平衡和協(xié)調(diào)性的損害。受污染的鳥類還可表現(xiàn)出對領(lǐng)地的失控和不能照顧后代。22（2）對行為的影響污染物對繁殖的影響主要表現(xiàn)為：產(chǎn)卵數(shù)、孵化率、幼體存活率下降以及繁殖行為下降等。概念：環(huán)境激素（EnvironmentalEndocrineDisrupters）指具有動物和人體激素的活性，能干擾和破壞野生動物繁殖障礙、誘發(fā)人類重大疾病的天然物質(zhì)或人工合成物質(zhì)。也叫做外源性雌激素或環(huán)境內(nèi)分泌干擾物。環(huán)境激素的種類包括：天然雌激素、合成雌激素、植物雌激素、具有雌激素活性的環(huán)境化學(xué)物質(zhì)。注：具有雌激素活性的環(huán)境化學(xué)物質(zhì)：如殺蟲劑、多氯聯(lián)苯、多環(huán)芳烴、洗滌劑、塑料添加劑、食品添加劑等，工業(yè)廢水和生活污水往往含有上述物質(zhì)。23（3）對繁殖的影響污染物對生長和發(fā)育的影響可通過生長指示器來測定生長指示器（ScopeforGrowth）是反映生物機(jī)體能量獲取利用和代謝的綜合指標(biāo)。

P=A-(R+U)注：P——SFG；A——從食物獲得的能量；R——呼吸作用的能量損失；U——排泄作用的能量損失24（4）對生長和發(fā)育的影響概念：種群（Population）是指在一定時(shí)空中同種個(gè)體的組合。污染物對種群的影響表現(xiàn)為：種群數(shù)量的密度改變結(jié)構(gòu)和性別比例的變化：年齡結(jié)構(gòu)、種群大小、性逆轉(zhuǎn)遺傳結(jié)構(gòu)的改變：在進(jìn)化過程中通過改變基因頻率以適應(yīng)環(huán)境的改變。競爭關(guān)系的改變255.6.4污染物在種群和群落水平上的影響

（1）

對生物種群的影響基本概念群落（Community）優(yōu)勢種（DominantSpecies）優(yōu)勢度？？耐污種敏感種污染物對群落的影響表現(xiàn)在：群落組成和結(jié)構(gòu)改變對物種多樣性（SpeciesDiversity）的影響注：物種多樣性指群落中物種的數(shù)目（豐富度）和各個(gè)物種的相對密度（群落的異質(zhì)性）。26（2）對生物群落的影響聯(lián)合作用(CombinedEffect)的概念指兩種或兩種以上化學(xué)污染物共同作用所產(chǎn)生的綜合生物學(xué)效應(yīng)。聯(lián)合作用的類型：相加作用（AdditiveEffect）：污染物的總作用強(qiáng)度等于其各個(gè)成分單獨(dú)作用強(qiáng)度的總和。協(xié)同作用（SynergisticEffect）：污染物的總作用強(qiáng)度大于其各個(gè)成分單獨(dú)作用強(qiáng)度的總和。獨(dú)立作用（IndependentEffect）各污染物對機(jī)體的侵入途徑、方式、作用部位、產(chǎn)生毒作用的機(jī)理各不相同，因此產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)彼此無關(guān)。拮抗作用（AntagonisticEffect）：污染物的總作用強(qiáng)度小于其中任何一種成分的單獨(dú)作用強(qiáng)度。275.6.5化學(xué)污染物對生物的聯(lián)合作用細(xì)胞色素P450的研究進(jìn)展DNA加合物的形成與診斷研究進(jìn)展28（1）研究進(jìn)展細(xì)胞色素P450（cytochromeP450或CYP450,簡稱CYP450）：一類以還原態(tài)與CO結(jié)合后在波長450nm處有吸收峰的含血紅素的單鏈蛋白質(zhì)。固醇類生物合成、脂肪酸和類固醇激素等內(nèi)源性底物的氧化代謝；大部分藥物和外源物的生物氧化等；它使進(jìn)入機(jī)體的外源物經(jīng)代謝后向兩個(gè)方向發(fā)展：代謝解毒和代謝活化；代謝活化后的產(chǎn)物有較強(qiáng)的毒性,甚至產(chǎn)生致畸、致癌效應(yīng)。29（2）細(xì)胞色素P450參與的生化反應(yīng)與作用30（3）細(xì)胞色素P450的生化背景31（4）細(xì)胞色素P450作用原理32反應(yīng)式據(jù)統(tǒng)計(jì),人類每年合成數(shù)以千計(jì)的新化合物并排放到環(huán)境之中,這些化合物許多具有遺傳毒性。如何對這些化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行監(jiān)測和評價(jià)是一項(xiàng)十分艱難而重要的工作。檢測周圍媒體(大氣、水、土壤等)中化合物含量水平來評價(jià)有毒物和人體健康之間的關(guān)系是不夠的,因?yàn)檫@種外劑量的評價(jià)方法只能給出生物體可能接受的大概劑量,而不能給出一定的信息來說明生物體對毒物的吸收、代謝、生物效應(yīng)等的差異。隨著研究的深入,人們提出應(yīng)用大分子(蛋白質(zhì)、RNA、DNA)加合物來研究和評價(jià)具有遺傳毒性的化學(xué)物質(zhì)致癌風(fēng)險(xiǎn)性。它們不僅能反映化學(xué)物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物在組織或體液中的劑量,而且能夠提供實(shí)際到達(dá)的作用部位或與關(guān)鍵的細(xì)胞大分子反應(yīng)的確切劑量。其中DNA加合物由于意義重大而成為多學(xué)科如環(huán)境科學(xué)、預(yù)防醫(yī)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域當(dāng)前的國際研究熱點(diǎn)。33（5）加合物的研究意義

DNA加合物的形成毒性機(jī)理形成過程

DNA加合物的診斷色譜-質(zhì)譜法

32P-后標(biāo)記法免疫學(xué)法34（6）DNA加合物的形成與診斷研究進(jìn)展DNA加合物就是親電性的化合物或其代謝產(chǎn)物和生物體內(nèi)大分子形成共價(jià)相連的化合物,是DNA化學(xué)損傷的最重要和最普遍的形式。這種加合物一旦逃避自身的修復(fù),就可能成為致突、致畸、致癌的最小因子,因此DNA加合物的形成被認(rèn)為是致腫瘤過程的一個(gè)重要起始階段。研究表明DNA加合物的形成與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展之間存在著因果聯(lián)系和劑量——反應(yīng)關(guān)系。35（7）DNA加合物與腫瘤DNA加合物的形成是遺傳毒性物質(zhì)導(dǎo)致生物體遺傳毒性的前提,含DNA加合物的DNA分子未能被修復(fù)或被細(xì)胞錯(cuò)誤地復(fù)制,將會導(dǎo)致一系列基因突變而產(chǎn)生遺傳毒性。大多數(shù)遺傳毒性化學(xué)物質(zhì)如PAHs在生物體內(nèi)一般首先經(jīng)過存在于許多生物組織中的混合功能細(xì)胞色素氧化酶P450的代謝。它們形成DNA加合物的途徑有2種：1)通過單電子氧化途徑;2)通過混合功能細(xì)胞色素氧化酶P450的激活?；衔镅趸緩交罨⑶疑舌堰始雍衔?大多數(shù)通過單電子氧化途徑形成的DNA加合物具有不穩(wěn)定的糖苷結(jié)構(gòu),能自動地使嘌呤脫落而形成一無嘌呤位點(diǎn),這個(gè)位點(diǎn)被認(rèn)為DNA分子上的一個(gè)致突變損傷,同時(shí)這些無嘌呤位點(diǎn)也有可能是一些化合物致癌的主要原因。36（8）毒性機(jī)理

許多污染物是親電化合物,它們具有低電子密度中心,因此可以與具有高電子密度的分子(如具有親核中心的DNA分子或蛋白質(zhì)分子Y)反應(yīng),形成生物大分子加合物.大多數(shù)親電子劑(RX)的加合物形成機(jī)理是親核替代,親電子基團(tuán)通過親核原子(O、N、S等)的一對不共享的電子(∶或-與之形成一個(gè)新的共價(jià)鍵.如式(1)所示被替代基團(tuán)(X)。根據(jù)反應(yīng)物性質(zhì)的不同或被親核基團(tuán)(Y)中和或帶上了負(fù)電：37（9）形成過程（10）DNA加合物與致癌關(guān)系DNA加合物是化學(xué)致癌過程的一個(gè)早期、可檢測的重要步驟，通過DNA加合物與突變和致癌關(guān)系的研究，人們認(rèn)識到DNA加合物可能是化學(xué)致癌物與癌癥之間的一個(gè)分子橋梁。有可能用于腫瘤防治的早期生物監(jiān)測，對化學(xué)致癌機(jī)理的探討及腫瘤病因的研究具有重要意義，并可最終為腫瘤的預(yù)防和治療服務(wù)。38（11）DNA加合物的形成機(jī)制DNA呈雙鏈超螺旋結(jié)構(gòu)存在于細(xì)胞中,嘌呤和嘧啶堿基重于螺旋內(nèi)側(cè)。在DNA的4個(gè)堿基中,存在著N、O、P、等原子,這些原子都含有孤對電子,容易受到親電試劑的攻擊。研究表明,在DNA分子至少有12個(gè)位點(diǎn)易受到化學(xué)致癌劑的攻擊。對于大多數(shù)致癌物都是經(jīng)過代謝活化后變成親電的代謝物后,再與DNA發(fā)生共價(jià)結(jié)合的,但也有直接結(jié)合的化合物。39

目前最常用的診斷、檢測及定量分析加合物的方法,原理是根據(jù)復(fù)雜樣品中的各組分在流動相和固相間具有不同的分配系數(shù),當(dāng)兩相作相對運(yùn)動時(shí),各組分便在兩相中進(jìn)行溶解、吸附、脫附的多次反復(fù)分配,達(dá)到彼此分離的結(jié)果.這種色譜分離技術(shù)與適當(dāng)?shù)臋z測手段(如電化學(xué)檢測器等)相結(jié)合時(shí),就構(gòu)成了色譜分析法.當(dāng)前最成熟的聯(lián)用儀是色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀。該法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、特異性強(qiáng)、用于檢測極微量加合物的存在及研究其形成機(jī)理。GC-MC和LC-MC在分析蛋白質(zhì)加合物中有重要作用.毛細(xì)管氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)合分析是目前靈敏度最高的技術(shù)之一,目前已研制出毛細(xì)管區(qū)帶電泳分離與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),并被應(yīng)用于加合物的診斷、分離和檢測。40（12）色譜-質(zhì)譜法DNA加合物的診斷高效液相色譜法(HPLC)和氣相色譜法(GC)聯(lián)合其它敏感的檢測法檢測DNA損傷已成為一種趨勢。如HPLC-32P后標(biāo)記方法是非常敏感的方法。氣/質(zhì)聯(lián)用法(GC/MS)雖然靈敏度稍低，但可以提供加合物準(zhǔn)確的結(jié)構(gòu)信息，這一點(diǎn)是其它方法不能比擬的。目前該方法多用于尿中排泄的DNA加合物的檢測，需水解DNA才能測定。其敏感性與熒光法相似。41（13）高效液相色譜法及氣/質(zhì)譜法Gupta于1982年就建立32P后標(biāo)記法(32P-PostlabelingAssay)來診斷、檢測生物體中形成的DNA加合物.一種非常靈敏的診斷方法,靈敏度為1個(gè)DNA加合物/1×109～1×1010核苷酸.該法的基本原理是,與外源性物質(zhì)形成加合物的單核甘酸,可抵制酸酶的降解,并被標(biāo)記上32P,從而通過放射性的定量分析診斷、檢測所形成的DNA加合物.此法的優(yōu)點(diǎn)是檢測能力強(qiáng)所需DNA的樣品量少,非常適合只能提供少量DNA的人體樣本(幾個(gè)微克)的檢測,不需要事先制備加合物標(biāo)樣,用空白對照可以定量計(jì)算加合物含量,既可用于單一加合物的檢測,也可用于復(fù)雜混合物的測定,及未知的內(nèi)源性親電性物質(zhì)所形成的加合物的測定,應(yīng)用范圍廣,可適用于檢測不同類型的化學(xué)污染物,如PAH、芳香胺、烷基化物、不飽和醛類以及活性氧、紫外線輻射等所引發(fā)的DNA加合物,尤其是可用于生態(tài)毒理學(xué)研究中生物樣品的加合物測定以及判斷化合物的生態(tài)毒性.其缺點(diǎn)是特異性較差,步驟比較多,穩(wěn)定性不易掌握,不同的實(shí)驗(yàn)室所測定的結(jié)果差別很大。在定量水平上存在局限性,因此有必要同其它檢測方法結(jié)合起來進(jìn)行應(yīng)用.42（14）32P-后標(biāo)記法

--為國際公認(rèn)的最有發(fā)展前途的方法DNA加合物的診斷Sabtella等于1988年創(chuàng)建了酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA),該方法用生物大分子加合物抗體(單克隆體或多克隆體)來診斷、檢測靶組織中的相應(yīng)加合物及其含量,可以在特異的組織或細(xì)胞中進(jìn)行定位研究。其測定DNA加合物的靈敏度為1個(gè)DNA加合物/1×107～1×108核苷酸。該方法的基本原理為抗原抗體反應(yīng),通常需要結(jié)合其它的富集、分離及檢測加合物的方法來得出最佳測定效果。其優(yōu)點(diǎn)是費(fèi)用低,簡便易行,無須接觸高水平的暴露量,適用于大量人群流行病學(xué)調(diào)查的研究。其缺點(diǎn)為所需樣本量大,抗體間存在交叉反應(yīng),對于非抗原性加合物和未知抗原的加合物不能進(jìn)行檢測。43（15）免疫學(xué)法DNA加合物的診斷基本原理是抗原與抗體的反應(yīng)。已發(fā)展的方法有競爭性放射免疫測定(RIA)；固相競爭或非競爭性酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)；超敏酶促放射免疫測定(USERIA)等。其檢測限一般為1個(gè)加合物/1×107～1×108核苷酸,目前已有20多種單克隆多克隆抗體可供使用。免疫法的優(yōu)點(diǎn)是簡便易行,價(jià)廉,不需要酶解DNA鏈,用免疫沉淀技術(shù)可以將有加合物的DNA鏈和無加合物的DNA鏈分離，適用于大量人群流行病學(xué)調(diào)查的研究。其缺為點(diǎn)是抗體存在交叉反應(yīng),所需DNA量較大(25～60Lg)。另外對于非抗原性加合物和未知抗原加合物的檢測無能為力。44免疫學(xué)法熒光測定法的原理是通過某些化合物的加合物具有熒光特性而進(jìn)行定量,其靈敏度為1個(gè)加合物/106～108核苷酸,所需樣品量為100μg左右.

熒光法的優(yōu)點(diǎn)是不破壞生物大分子鏈,并可區(qū)分出加合物的不同立體異構(gòu)體及大分子鏈不同位點(diǎn)上的加合物.熒光法還可用于研究DNA加合物的形成或修復(fù)與時(shí)間之間的動態(tài)關(guān)系,但不適用于檢測發(fā)光的化合物.45（16）熒光測定法DNA加合物的診斷原理是通過某些化合物(特別是多環(huán)芳烴)的DNA加合物具有熒光的特性來測定,其檢測限為1個(gè)加合物/106-8核苷酸,目前發(fā)展的技術(shù)有同步熒光色譜法,激發(fā)-發(fā)射熒光法,低溫激光法。熒光法的優(yōu)點(diǎn)是不破壞DNA鏈就可以測定,另外可以確定加合物的不同立體異構(gòu)體及DNA鏈上的不同位點(diǎn)上的加合物,