酶工程理論課蛋白質(zhì)

酶（蛋白質(zhì)）工程云南大學生命科學學院林潔主講

第一章

緒論第一節(jié)生物技術(shù)與酶工程第二節(jié)酶與酶工程研究的重要意義第三節(jié)酶學研究簡史第四節(jié)酶工程簡介第五節(jié)酶工程與蛋白質(zhì)工程第六節(jié)課程的學習目標第七節(jié)課程的教學安排第八節(jié)教材和參考書目第一節(jié)

生物技術(shù)與酶工程美國國會科技評議處在1995年將生物技術(shù)(biotechnology)定義為「利用生物體或來自生物體的物質(zhì)去制造或修飾某個產(chǎn)品，改良動、植物或開發(fā)微生物以做為特定之用途?！笲ios=life；Teuchos=tool；Logos=studyoforessenceof.Biotechnology=thestudyoftoolsfromlivingthings.

一、

生物技術(shù)的定義生物技術(shù)（biotechnology）就是指人們以現(xiàn)代生命科學為基礎(chǔ)，結(jié)合其他基礎(chǔ)學科的科學原理，采用先進的工程技術(shù)手段，按照預先的設(shè)計改造生物體或加工生物原料，為人類生產(chǎn)出所需要的產(chǎn)品或達到某種目的技術(shù)原理與過程。有時也稱為生物工程（bioengineering）。改造生物體是指獲得優(yōu)良品質(zhì)的動物、植物和微生物品系。加工的生物原料是指生物的某一部分或生長過程中產(chǎn)生的能利用的物質(zhì)，如淀粉、多糖、纖維素等有機物。生產(chǎn)出所需要的產(chǎn)品包括：糧食、醫(yī)藥、食品、化工原料、能源等。達到某種目的則包括：疾病的預防、診斷與治療和食品的檢測以及環(huán)境污染的檢測和治理等。二、生物技術(shù)的四大支柱生物技術(shù)（生物工程）基因工程細胞工程酶工程發(fā)酵工程蛋白質(zhì)工程酶工程(enzymeengineering)酶工程則是從應用的目的出發(fā)，研究酶，生產(chǎn)酶，改造酶，并利用酶的催化功能借助生物反應器和工藝過程來生產(chǎn)人類所需產(chǎn)品或?qū)崿F(xiàn)人類需求的技術(shù)過程。是酶學、微生物學的基本原理與化學工程有機結(jié)合而產(chǎn)生的交叉學科。酶工程與各生物技術(shù)細胞工程基因工程蛋白質(zhì)工程產(chǎn)品酶工程生化工程發(fā)酵工程轉(zhuǎn)基因生物反應器及分離工程動植物細胞培養(yǎng)酶制劑應用或生產(chǎn)第二節(jié)酶與酶工程研究的重要意義酶（enzyme，在酵母中）是由活細胞產(chǎn)生的具有催化能力的蛋白質(zhì)，它是促進一切代謝反應的物質(zhì)，沒有酶，代謝就會停止，生命也即停止。酶的發(fā)現(xiàn)及其催化作用的闡明是現(xiàn)代生物化學的起點！酶的作用機制的研究是生命科學和現(xiàn)代醫(yī)藥學的重要理論基礎(chǔ)！酶的催化功能的應用是生物技術(shù)的開端！是工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學、環(huán)境保護和能源開發(fā)的福音！

“什么樣的化學物質(zhì)使細胞和生物能夠發(fā)揮其功能、生長并且繁殖？既不是碳水化合物——植物中的淀粉——和動物體內(nèi)的糖原，也不是儲存的脂肪；既不是構(gòu)成肌肉、結(jié)締組織和骨骼組織的結(jié)構(gòu)蛋白，亦非遺傳物質(zhì)DNA。盡管DNA威風八面，它也只是指導構(gòu)建細胞蛋白質(zhì)的藍圖。DNA本身是無生命的，它的語言冰冷而威嚴。真正賦予細胞生命和個性的是酶。它們控制著整個機體，哪怕僅僅一個酶功能異常都可能致命。對我們的生命而言，自然界中找不到象酶眼些重要的任何其他物質(zhì)，然而，人們對它的了解如此之少，只有少數(shù)科學家才真正欣賞它們。”

——阿瑟﹒科恩伯格第三節(jié)酶學研究的簡史酶的發(fā)現(xiàn)起源于發(fā)酵——這一史前時代的廚房工作：酵母、面團、面包公元前2000年之前，古埃及、儲存碾碎的棗從美味到變酸公元前1500年，葡萄汁與葡萄酒、大麥浸泡液與啤酒史前就已經(jīng)存在的動物類食品的保存方法——風干、熏干、腌、鹽漬等。古埃及，木乃伊的脫水制作。這些古老的工藝已經(jīng)應用了超過6000年，但其中的化學機制直到19世紀仍保持著神秘。亞里士多德：發(fā)酵是一個不斷成熟的過程，“精神”作用。煉金術(shù)士：“第五元素”——元氣，發(fā)酵與酵素第三節(jié)酶學研究的簡史后來，酵母菌在釀造葡萄酒和啤酒中的作用成為了生物學中耗時最長，也最為激烈的爭論。蓋-呂薩克與李比希都認為發(fā)酵是與加熱有關(guān)的化學反應。1830年前阿斯迪爾德觀點：“空氣是所有細菌的傳播媒介和酵素的來源，酵素通過消耗糖來維持自身的生存和繁殖，從而導致組成糖的基本元素單位之間平衡的破壞”被化學流行的社會所忽視。列文虎克使用顯微鏡在發(fā)酵沉淀中見到了酵母，使很多人相信發(fā)酵的決定力是活有機體。1837年施旺用實驗證明發(fā)酵與加熱無關(guān)，指出發(fā)酵的過程的誘發(fā)要素必須是一種由過程中本身產(chǎn)生并增加的物質(zhì)，此現(xiàn)象只適用于活的有機體。以李比希、維勒和伯齊厄斯為代表的化學家對此加以譏諷。第三節(jié)酶學研究的簡史1896年，畢希納兄弟報道了以下發(fā)現(xiàn)：在含有不同糖成分（包括蔗糖、葡萄糖、果糖和麥芽糖）的水溶液中，一種從啤酒酵母制備的無細胞榨出汁能導致二氧化碳和乙醇的形成。畢希納兄弟的實驗結(jié)論：發(fā)酵過程的啟動并不需要以活細胞為代表的那樣復雜的“裝置”，酵母榨出汁中導致發(fā)酵作用發(fā)生的只涉及一種溶解了的物質(zhì)，它無疑是一種蛋白質(zhì)。我們用“釀酶”這個名詞來標示這種蛋白。關(guān)于發(fā)酵這個古老沖突結(jié)束了：發(fā)酵是一個生物體的化學過程?，F(xiàn)代生化化學誕生了！酶學研究正式開始！第三節(jié)酶學研究的簡史20世紀，酶學得到了迅速地發(fā)展：發(fā)現(xiàn)了更多的酶，注意到了輔酶1902年，Henri提出了中間產(chǎn)物學說；Michaelis和Menten，根據(jù)中間產(chǎn)物學說提出了酶促動力學原理——米氏方程Sumner從刀豆中得到了脲酶結(jié)晶，提出酶的蛋白質(zhì)本質(zhì)1950s，Kosland提出了“誘導契合”理論，解釋了酶的催化理論和專一性1956年，ArthurKornberg證明了DNA的復制并分離了復制所需要的DNA合成酶1961年，Monod提出“變構(gòu)模型”，提供了酶調(diào)控作用的基礎(chǔ)1970s，限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)推動了重組DNA技術(shù)的產(chǎn)生DNA重組技術(shù)用定點突變法研究酶的作用機制，并為涉及特定需要的酶奠定了基礎(chǔ)。1984年，Cech小組發(fā)現(xiàn)了核酶，提出了酶的RNA本質(zhì)的存在。1986年，Schultz小組用單克隆抗體技術(shù)制備了抗體酶。1989年，耐熱Taq酶的發(fā)現(xiàn)，為PCR技術(shù)的應用奠定了基礎(chǔ)。第四節(jié)酶工程的簡介1.酶工程的定義2.酶工程的研究概況3.酶工程的研究內(nèi)容4.酶工程的發(fā)展前景1.酶工程的定義酶工程（enzymeengineering）是從應用的目的出發(fā)，研究酶，生產(chǎn)酶，改造酶，并利用酶的催化功能借助生物反應器和工藝工程來生產(chǎn)人類所需產(chǎn)品或?qū)崿F(xiàn)人類需求的技術(shù)過程。是酶學、微生物學的基本原理與化學工程有機結(jié)合而產(chǎn)生的交叉學科，是現(xiàn)代生物技術(shù)的重要組成部分。酶能在常溫、常壓、中性pH等溫和條件下高度專一有效地催化底物發(fā)生反應，所以以酶的開發(fā)和應用為目的的酶工程已成為當代和未來新技術(shù)革命中的一個重要課題。

2.酶工程的發(fā)展概況1894高峰讓吉（日本）從米曲霉中獲得高峰淀粉酶，用作消化劑1908羅姆（Rohm，德國）從動物胰臟中提取分離制得胰酶，用于皮革的軟化1911華勒斯坦（Wallerstein）從木瓜中分離獲得木瓜蛋白酶，用于啤酒的澄清通過分離純化法從動、植物或微生物中獲得越來越多的酶，并應用于實際生產(chǎn)。由于受到原料來源和分離純化技術(shù)的限制，難于進行大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)，“如何提高酶的產(chǎn)量”成為酶工程研究的方向。

2.酶工程的發(fā)展概況1949微生物液體深層培養(yǎng)技術(shù)被成功應用于細菌α-淀粉酶的發(fā)酵生產(chǎn)，揭開了現(xiàn)代酶制劑工業(yè)的序幕。1960雅各和莫諾德提出操縱子學說（闡明了酶生物合成的調(diào)節(jié)機制），依據(jù)該學說，在酶的發(fā)酵過程中，進行適當?shù)恼{(diào)節(jié)和控制，使酶的產(chǎn)率得到限制的提高。1970限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)，開創(chuàng)的DNA重組技術(shù)，使酶得以大規(guī)模重組表達和生產(chǎn)。1980s動、植物細胞培養(yǎng)技術(shù)的迅速發(fā)展，為酶的生產(chǎn)提供了一條新的突進，獲得了許多來源于動、質(zhì)細胞的酶制劑。酶的生產(chǎn)技術(shù)得以極大的發(fā)展，酶的產(chǎn)量越來越大，酶的應用也越來越廣泛。但是同時酶在應用方面的不足之處，也日趨凸現(xiàn)?！叭绾紊a(chǎn)高效率的酶制劑”成為酶工程的研究趨勢。

2.酶工程的發(fā)展概況1916奈爾森和格里芬（美國）證明了吸附在骨炭上制成的水不溶性狀態(tài)的固定化酶仍然具有催化活性1969千鈿一郎（日本）用固定化氨基?；高M行DL-氨基酸拆分而生產(chǎn)L-氨基酸1978鈴木等（日本）用固定化細胞生產(chǎn)α-淀粉酶研究成功1986郭勇（中國）采用固定化原生質(zhì)體生產(chǎn)堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、谷氨酸脫氫酶等的研究相繼取得成功1984克利巴諾夫脂肪酶在有機介質(zhì)中不但具有催化活性，而且熱穩(wěn)定性有限制提高。提出了酶非水相催化的理論。1980s利用多樣的化學修飾劑通過化學反應修飾酶分子化學工程技術(shù)應用于酶工程，提高了酶制劑改造的效率，但未能完全解決酶在實際應用中的不足，特別是酶的化學修飾法在一定程度上影響了酶的活力

2.酶工程的發(fā)展概況1980s之后基因工程、蛋白質(zhì)工程、細胞工程等現(xiàn)代生物學技術(shù)的發(fā)展，促進了酶工程的快速進步，用基因工程技術(shù)大量生產(chǎn)酶（克隆酶），通過基因定點突變技術(shù)修飾酶基因產(chǎn)生出遺傳修飾酶（突變酶），酶的定向進化技術(shù)，另外設(shè)計新的酶基因以及雜交瘤技術(shù)的應用產(chǎn)生了許多自然界本沒有的酶（抗體酶）。生物技術(shù)的發(fā)展，大大推動了酶工程的產(chǎn)生，出現(xiàn)了更多更好的酶的改造方法，同時大量高效、新穎的酶制劑騰空出世3.酶工程的研究內(nèi)容化學酶工程天然酶、化學修飾酶、固定化酶及化學人工酶的研究和應用分子酶工程克隆酶突變酶新基因酶多功能酶抗體酶3.酶工程的研究內(nèi)容酶的生產(chǎn)通過各種方法選育得到優(yōu)良的微生物、動物或植物細胞，在人工控制條件的生物反應器中進行生產(chǎn)，而獲得各種所需要的酶酶的改性通過各種方法使酶的催化特性得以改進的技術(shù)過程，經(jīng)過改性，酶可以提高活力、增加穩(wěn)定性、降低抗原性，改變選擇性，更有利于酶的利用酶的應用根據(jù)酶的催化特性和酶反應動力學的理論，將酶應用于醫(yī)藥、食品、工業(yè)、農(nóng)業(yè)、環(huán)保、能源和生物技術(shù)等各個領(lǐng)域。4.酶工程的發(fā)展趨勢今后將會出現(xiàn)一大批基因工程表達的酶制劑會出現(xiàn)應用經(jīng)分子改造與修飾的酶制劑的熱潮異體酶的抗原性將會得到解決酶活性的控制方面將會有較大突破，其中酶抑制劑和激活劑仍將受到極大重視，并在臨床及工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用化學合成工業(yè)中，酶法生產(chǎn)將有更重大的貢獻模擬酶、酶的人工設(shè)計合成、抗體酶、雜交酶將成為活躍的研究領(lǐng)域。非水系統(tǒng)酶反應技術(shù)仍將是研究熱點之一。二、酶的應用領(lǐng)域和現(xiàn)狀1.酶在醫(yī)藥方面的應用利用酶的催化特性進行基本診斷藥物的研制和疾病的治療2.酶在食品方面的應用食品保鮮食品加工生產(chǎn)改善食品的品質(zhì)和風味3.酶在工業(yè)方面的應用進行原料處理生產(chǎn)各種工業(yè)產(chǎn)品加酶增強產(chǎn)品的使用效果4.酶在農(nóng)業(yè)方面的應用農(nóng)產(chǎn)品保鮮農(nóng)產(chǎn)品加工農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量控制飼料加工5.酶在環(huán)保能源方面的應用用酶進行環(huán)境監(jiān)測用酶進行廢水處理生產(chǎn)各種可生物降解材料生產(chǎn)各種新能源產(chǎn)品6.酶在生物技術(shù)（工程）方面的應用核酸的合成、切割和拼接（基因工程）胰酶消化（細胞工程）細胞破壁、酶（蛋白質(zhì)）分子的改造（發(fā)酵工程、酶工程、蛋白質(zhì)工程）核酸雜交檢測技術(shù)、免疫檢測技術(shù)（分析檢測）藥用酶的應用治療消化不良蛋白酶：胰蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶α-淀粉酶：麥芽淀粉酶、米曲霉淀粉酶脂肪酶糖化酶：特別是嬰兒飲奶后出現(xiàn)腹脹、腹瀉等治療各種炎癥蛋白酶：使炎癥部位的壞死組織溶解、增加組織通透性溶菌酶：作用于細菌的細胞壁，使病原菌、腐敗性細菌等溶解死亡治療輻射損傷超氧氧化歧化酶（SOD）：抗氧化、抗衰老、抗輻射藥用酶的應用治療血栓性疾?。ㄈ苎ǎ┠蚣っ福║K）：激活纖溶酶原成為有溶解血纖維蛋白活性的纖溶酶納豆激酶：可以催化血纖維蛋白水解，同時可以激活纖溶酶原成為纖溶酶組織型纖溶酶原激活劑（t-PA）：溶纖功效強，特異性好治療出血性疾病凝血酶：催化血纖維蛋白原水解，生成不溶性的血纖維蛋白，促進凝血抑肽酶：抑制人體的胰蛋白酶、纖溶酶、血漿及組織中血管舒緩素治療癌癥（腫瘤）L-天門冬酰胺酶：分解L-天冬氨酸，抑制癌細胞蛋白質(zhì)合成免疫檢測技術(shù)的基本原理：抗原免疫動物能夠獲得特異的抗體特異的抗體能與抗原在體內(nèi)或體外發(fā)生反應，形成抗原-抗體復合物ELISA與疾病的診斷抗原的種類：病原體：細菌、病毒、寄生蟲、衣原體……細胞蛋白質(zhì)：單純蛋白、脂蛋白、糖蛋白、核酸蛋白等小分子化合物：半抗原，與載體蛋白偶聯(lián)成為完全抗原利用抗原-抗體的特異性反應可以檢測檢測樣本中是否存在某種抗原檢測樣本中是否存在某種抗體酶聯(lián)免疫吸附檢測（Enzyme-LinkedImmuno-SorbentAssay,ELISA）的基本原理：抗原與相應抗體的特異性反應大多數(shù)塑料能夠吸附蛋白質(zhì)（抗原或抗體多為蛋白質(zhì)成分）有些酶的催化反應能夠成為顯色反應，易于觀察和檢測加入基質(zhì)ELISAPlate酶標板抗原專一性抗體酶聯(lián)二抗連結(jié)酶酶呈色不相關(guān)抗體2E1969年，日本田邊制藥公司將從米曲霉中分離得到的氨基?；?，用DEAE-葡聚糖凝膠為載體通過離子鍵結(jié)合制成固定化酶，將L-乙酰氨基酸水解成L-氨基酸，用來拆分DL-乙酰氨基酸，連續(xù)生成L-氨基酸剩余的D-乙酰氨基酸經(jīng)過消旋化，生成DL-乙酰氨基酸，再進行拆分生產(chǎn)成本僅為用游離酶生產(chǎn)成本的60%左右L-乙酰氨基酸L-氨基酸＋＋基因操作過程中的常規(guī)試驗消化前消化后

細胞貼壁培養(yǎng)中的胰酶消化過程第五節(jié)酶工程與蛋白質(zhì)工程新酶的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)、酶的改造和酶的高效應用是當今酶工程發(fā)展的主攻方向和前沿陣地。蛋白質(zhì)工程，又被稱為是第二代基因工程，它是在基因工程的基礎(chǔ)上，結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)晶學、計算機輔助設(shè)計和蛋白質(zhì)化學等多學科的基礎(chǔ)知識，通過對基因的人工定向改造等手段，從而達到對蛋白質(zhì)進行修飾、改造、評價以產(chǎn)生能滿足人類需要的新型蛋白質(zhì)的技術(shù)。酶是具有生物催化功能的蛋白質(zhì)和核酸，絕大多數(shù)的酶具有蛋白質(zhì)本質(zhì)。因此，蛋白質(zhì)工程的研究方法促進了現(xiàn)代酶工程的發(fā)展，特別是在酶的改造方面扮演了重要的角色，是現(xiàn)代分子酶工程的重要構(gòu)成元素。第六節(jié)課程的學習目標課程名稱：《酶（蛋白質(zhì)）工程》以酶工程原理和技術(shù)為學習主線，掌握酶的生產(chǎn)與應用的基本理論、基本技術(shù)以及酶的改造技術(shù)的研究和應用，進一步了解酶在各行各業(yè)中實際應用的最新發(fā)展和發(fā)展趨勢。在以后的畢業(yè)環(huán)節(jié)和工作