園林植物育種學(xué)-生物技術(shù)在園林植物遺傳改良中的應(yīng)用

本章教學(xué)目的和要求．了解園林植物生物技術(shù)爭論的主要內(nèi)容。．把握植物組織培育、基因工程等技術(shù)在園林植物遺傳育種中的應(yīng)用。本章教學(xué)重點和難點重點：組織培育與基因工程在園林植物遺傳育種中的作用。難點：園林植物生物技術(shù)的原理與操作方法。教學(xué)內(nèi)容：生物技術(shù)〔biotechnology〕是指依據(jù)人們的意愿實行確定的技術(shù)手段，直接或間〔從微生物直至高等動植物〔〕，進展的生產(chǎn)工藝，制造的生物品種或生物制品的一種科學(xué)技術(shù)體系。包括組織培育、細胞工程、基因工程、發(fā)酵工程、蛋白質(zhì)工程等。第一節(jié)植物組織培育一、植物組織培育的相關(guān)概念植物組織培育〔planttissueculture〕：在無菌條件下，將離體的植物材料培育的生物產(chǎn)品的技術(shù)。細胞、胚、胚珠、子房、胚乳等的離體培育。外植體〔explant〕：用于培育的離體材料。繼代培育〔subculture〕：由最初培育增殖的組織，連續(xù)轉(zhuǎn)入的培育基上培育的過程。無性生殖系：由同一外植體反復(fù)進展繼代培育后，所得到的一系列無性生殖后代。單細胞無性系：在細胞培育中，由單細胞形成的無性系。愈傷組織〔callus〕：在培育過程中，從植物各種器官、組織的外植體增殖而形成的一種無特定構(gòu)造和功能的細胞團。胚狀體〔embryoid〕：由外植體或愈傷組織產(chǎn)生的，與正常受精卵發(fā)育方式類似的胚胎構(gòu)造體。二、植物組織培育的根本程序1．培育用具的預(yù)備．培育基的制備根本成分〔大量元素、微量元素、有機成分、鐵鹽〕、碳源〔蔗糖、葡萄糖等〕、凝〔〔〔活性炭、LH、CH、椰乳等〕pH值．外植體的選擇．接種〔無菌操作〕．離體培育初代培育、繼代培育愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽分化〔體胚再生〕、增殖培育、生根培育等培育條件、培育方式．煉苗移栽三、植物組織培育的內(nèi)容1．植株培育．莖尖與分生組織培育．胚培育〔embryoculture〕．離體器官培育〔organculture〕．花藥與花粉培育〔anther&pollen〕6．胚珠和子房培育〔ovule&ovary〕7．胚乳培育〔endospermculture〕．細胞培育〔cellculture〕．離體授粉受精〔invitrofertilization〕四、植物組織培育在園林植物育種中的應(yīng)用快速生殖植物品種、珍稀植物脫除病毒，培育無病毒苗木進展種質(zhì)資源的長期保存和遠距離運輸離體誘發(fā)和篩選突變體離體輻射或化學(xué)誘變；體細胞無性系變異的選擇獲得倍性不同的植株花藥〔粉〕培育獲得單倍體；胚乳培育獲得三倍體抑制種子發(fā)育和萌發(fā)中的障礙蘭花種子萌發(fā)；胚搶救等抑制遠緣雜交困難離體授粉受精供給育種中間材料其次節(jié)植物原生質(zhì)體培育與細胞融合一、概念原生質(zhì)體：被去掉細胞壁的具有生活力的暴露細胞。原生質(zhì)體培育：將去掉了細胞壁的暴露細胞培育成植株的技術(shù)。原生質(zhì)體融合〔細胞融合、體細胞雜交〕：將不同種、甚至屬間細胞人工融合為雜種細胞，并使其再生成植株的技術(shù)。二、原生質(zhì)體培育與細胞融合的方法步驟1．原生質(zhì)體的制備獲得大量有活力的原生質(zhì)體。原生質(zhì)體的分別機械分別法酶解分別法：分別材料的預(yù)備〔離體葉片、懸浮細胞等〕酶解〔果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶等〕〕原生質(zhì)體的收集與純化過濾－離心法〔沉淀法〕漂移法界面法〕原生質(zhì)體的活力測定：形態(tài)、活性染色、熒光染料活性染色等方法影響原生質(zhì)體活力的因素：分別材料的生理狀態(tài)酶解條件：酶質(zhì)量、濃度、酶解溫度、酶解時間、酶溶液的滲透壓分別條件：離心次數(shù)、離心速度、純化方法、分別持續(xù)時間環(huán)境條件：操作環(huán)境的溫度、分別用具的影響2．原生質(zhì)體的培育培育原生質(zhì)體的根本養(yǎng)分同一般組培在培育基中保持確定的滲透壓極為重要。常用的培育基有：MS培育基、N-T培育基、B5培育基等。留意原生質(zhì)的濕度及培育時的溫度和光照。培育方法：固體培育法；淺層液體培育法；雙層培育法3．細胞融合〕原生質(zhì)體融合PEG法、電融合法、高pH－高濃度鈣離子法、NaNO3法等；2〕雜種細胞的篩選突變細胞遺傳互補選擇法養(yǎng)分互補選擇法依據(jù)原生質(zhì)體特性差異的機械選擇法3〕體細胞雜種植株的鑒定形態(tài)學(xué)方法、細胞學(xué)方法，同工酶法，分子標(biāo)記法等。融合體的類型：對稱融合非對稱融合三、原生質(zhì)體操作在育種中的應(yīng)用培育品種制造種質(zhì)抑制遠緣雜交不親和、雜交不育等障礙作為基因工程的良好受體進展突變體篩選的優(yōu)良原始材料第三節(jié)植物基因工程一、植物基因工程的概念及其爭論概況植物基因工程〔plantgeneticengineering〕是指依據(jù)人們的意志，通過確定的程序，將具有遺傳信息的DNA片段，在離體條件下，用工具酶加以剪切、組合和拼接，再將人工重組的基因，引入適當(dāng)?shù)闹参锸荏w中進展復(fù)制和表達的技術(shù)。1972年，構(gòu)建第一個重組DNA分子。1983年，世界上獲得首例轉(zhuǎn)基因植物。1985年，創(chuàng)立葉盤法進展植物的遺傳轉(zhuǎn)化。香石竹、滿天星、月季、百合、唐菖蒲、郁金香、仙客來、石蒜、水仙、花葉芋、吊蘭、長春花、南非菊、風(fēng)鈴草、半邊蓮、六出花、夏堇、草原龍膽、蔓陀羅、長壽花、秋海棠、蝴蝶蘭、石斛、結(jié)縷草、高羊茅、山茶、連翹、杜鵑花、楊樹、桉樹、刺槐、美國楓香、歐洲白樺、挪威云杉、松類等。二、植物基因工程的一般程序與方法1．目的基因的分別與克隆PCR技術(shù)轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)基因組相減技術(shù)cDNA差異顯示技術(shù)等．植物表達載體的構(gòu)建1〕啟動子的選擇組成型啟動子：35S特異性啟動子：組織特異性、誘導(dǎo)特異性2〕終止子3〕選擇標(biāo)記基因：npt-IIhptbar等3．植物的遺傳轉(zhuǎn)化〕農(nóng)桿菌介導(dǎo)法〕基因槍法〕花粉管通道法〕其他方法：PEG法、電激法、顯微注射法、激光法、脂質(zhì)體法、超聲波法、真空浸潤法、碳硅纖維介導(dǎo)法4．轉(zhuǎn)化細胞的篩選及轉(zhuǎn)基因植物的鑒定1〕轉(zhuǎn)化體的篩選抗性篩選：利用選擇標(biāo)記基因利用報告基因：GUS、GFP2〕轉(zhuǎn)化體的鑒定PCR檢測Southern雜交Northern雜交Western雜交5．轉(zhuǎn)基因植物的安全性評價與商業(yè)釋放二、基因工程在園林植物育種中的應(yīng)用．植物基因工程育種的優(yōu)點的性和準(zhǔn)確性；育種的范圍；在很大程度上縮短了育種周期。．基因工程在園林植物遺傳改進中的應(yīng)用修飾花色改進花型增加花香延緩年輕延長花期轉(zhuǎn)變株形制造不育提高抗病蟲力氣改善抗逆性抗除草劑改善生長特性治理環(huán)境污染第四節(jié)分子標(biāo)記及其在育種中的應(yīng)用一、常見DNA分子標(biāo)記技術(shù)基于DNA-DNA雜交的DNA標(biāo)記：RFLP基于PCR技術(shù)的DNA標(biāo)記：RAPD、ISSR；SSR、SCAR基于限制性酶切和PCR的DNA標(biāo)記：AFLP、CAPS基于單個核苷酸多態(tài)性的DNA標(biāo)記：SNP1．RFLP限制性片段長度多態(tài)性〔RestrictionFragmentLengthPolymorphism〕1〕工作原理：由于單堿基的替換、DNA片斷的插入、缺失、易位、倒位等，引起同源DNA序列上限制性內(nèi)切酶的識別位點或位點間的DNA區(qū)段不同，從而導(dǎo)致酶切片段的多態(tài)性?！掣境绦颍好盖小娪竞筠D(zhuǎn)膜→預(yù)雜交/雜交→放射自顯影。〕特點：共顯性標(biāo)記，不受顯隱性、環(huán)境和發(fā)育階段的影響；多態(tài)性豐富，重復(fù)性穩(wěn)定性好。DNA需求量大。目前已較少使用。2．RAPD標(biāo)記隨機擴增多態(tài)性DNA〔RandomAmplifiedPolymorphicDNA〕1〕工作原理：利用一系列不同的隨機引物〔9-10bp〕對所爭論物種的基因組DNA進展擴增，模板DNADNA片段的多態(tài)性。〕根本程序：引物篩選→PCR擴增→瓊脂糖凝膠電泳→譜帶分析?！程攸c：DNA量少。較差。應(yīng)用較多：品種分類、種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性分析等。3．SSR微衛(wèi)星簡潔重復(fù)序列〔MicrosatelliteSimpleSequenceRepeats〕1〕工作原理：以2-6個核苷酸為根本單元的簡潔串聯(lián)重復(fù)序列稱為微衛(wèi)星或簡潔序列重復(fù)；SSR座位兩側(cè)具有保守的單拷貝序列，不同物種或品種，所含SSR各異〔重復(fù)次數(shù)不同〕〕根本程序：設(shè)計特異引物→PCR擴增→聚丙稀酰胺凝膠電泳→多態(tài)性分析。〕特點：操作簡便，穩(wěn)定牢靠；具有大量的等位差異，多態(tài)性格外豐富。依靠SSR的克隆和測序設(shè)計引物，開發(fā)本錢較高。應(yīng)用前景好：遺傳作圖、種質(zhì)鑒定、品種分類4．AFLP限制性擴增片段長度多態(tài)性〔AmplifiedFragmentLengthPolymorphism〕1〕工作原理：通過對基因組DNA酶切片段的選擇性擴增來檢測DNA酶切片段長度的多態(tài)性。PCR與RFLP相結(jié)合的產(chǎn)物。多態(tài)性來自酶切位點和其后的選擇性堿基的變異。〕基本程序：總DNA酶切，寡聚核苷酸連接頭的連接→PCR擴增→聚丙稀酰胺凝膠電泳→檢測?！程攸c：具有RFLP的牢靠性和PCR的高效、靈敏性；一次反響能擴出50～100條