生物芯片技術(shù)及其進展

生物芯片技術(shù)及其進展侯治富吉林大學白求恩醫(yī)學部中日聯(lián)誼醫(yī)院當前1頁，總共76頁。生物芯片技術(shù)的主要內(nèi)容生物芯片的概念生物芯片的基本原理生物芯片的分類生物芯片的發(fā)展歷程生物芯片的技術(shù)方法生物芯片的應用當前2頁，總共76頁。生物芯片的定義生物芯片（Biochip或Bioarray）是指包被在固相載體上的高密度DNA、抗原、抗體、細胞或組織的微點陣(microarray）。生物芯片的種類：包括DNA芯片、抗原芯片、抗體芯片、細胞芯片、組織芯片等。1998年世界十大科技突破之一。未來十年最具發(fā)展?jié)摿Φ募夹g(shù)。當前3頁，總共76頁。生物芯片的定義Bio：[詞素]生...，生物...;Chip：屑晶片,薄片;[電子]集成電路片;[英漢計算機名詞]芯片Array：陣,列,排列,配置,系,組,級數(shù),芯片當前4頁，總共76頁。當前5頁，總共76頁。生物芯片的概念——集成當前6頁，總共76頁。當前7頁，總共76頁。12345678910111213141516171819202122XYOncogeneTargetsOntheAmpliOnc?IBiochipPDGFBEGFR1PDGFRAMETFGFR2WNT1MYBHER2YES1HRAS1CND1RAF1GLIMYCMDM220q13RELMYCL1FGRFESABLINT2PIK3CANMYCAKT2FGFR1JUNBAKT1KRAS2CDK4AR當前8頁，總共76頁。生物芯片基本原理當前9頁，總共76頁。當前10頁，總共76頁。當前11頁，總共76頁。生物芯片的特點高度并行性：提高實驗進程、利于顯示圖譜的快速對照和閱讀。多樣性：可進行樣品的多方面分析，提高精確性，減少誤差。微型化：減少試劑用量和反應液體積，提高樣品濃度和反應速率。自動化：降低成本，保證質(zhì)量。高通量當前12頁，總共76頁。生物芯片的分類尚未統(tǒng)一。廣義上：矩陣型芯片、處理型芯片固化材料：基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、細胞芯片、組織芯片用途分類……當前13頁，總共76頁。生物芯片研究的歷史1991Affymatrix公司StephenFodor:光刻與光化學技術(shù)、多肽和寡聚核苷酸微陣列。DNAChip概念Stanford大學Brown實驗室：預先合成，機械手陣列1995Schena等：基因表達譜1996Cheeetal：DNA測序1996Croninetal：突變檢測1996Sapolsley&Lipshutz：基因圖克隆1996Shalonetal：復雜DNA樣本分析1996Shoemakeretal：缺省突變定量表型分析當前14頁，總共76頁。當前15頁，總共76頁。2014年化學諾獎得主：埃里克·白茲格，斯特凡·W·赫爾和威廉姆·艾斯科·莫爾納爾。

這三位獲獎理由是表彰他們在超分辨率熒光顯微技術(shù)領(lǐng)域取得的成就。

當前16頁，總共76頁。當前17頁，總共76頁。分類（根據(jù)應用）基因變異檢測芯片疾病檢測(如HIV、P53基因、結(jié)核桿菌)法醫(yī)鑒定(如DNA指紋圖譜)表達譜芯片腫瘤相關(guān)基因(正常與腫瘤組織表達差異)藥物篩選(培養(yǎng)細胞藥物刺激前后表達差異)發(fā)育(同一組織不同發(fā)育時期基因表達差異)組織發(fā)生(不同組織或器官的基因表達差異)當前18頁，總共76頁。分類（根據(jù)工藝和載體）原位合成法：密集程度高，可合成任意序列的寡聚核苷酸，但特異性較差，寡聚核苷酸合成長度有限，且隨長度增加，合成錯誤率增高。成本較高，設(shè)計和制造較煩瑣費時。DNA微矩陣法：成本低，易操作，點樣密度通常能滿足需要。芯片的載體需表面緊質(zhì)、光滑的固體，如硅，陶，玻璃等，DNA微矩陣芯片常用玻片為載體。當前19頁，總共76頁。當前20頁，總共76頁。分類（根據(jù)DNA成分）寡聚核苷酸或DNA片段：約2025個核苷酸堿基，常用于基因類型的分析，如突變、正常變異（多態(tài)性）。全部或部分cDNA：約5005000個核苷酸堿基，通常用于兩種或以上樣本的相關(guān)基因表達分析。當前21頁，總共76頁。ComparisonofDNAChipTechnologies

SensitivityofDNAchipbasedassaysisafunctionof:ProbeandtargetDNA/RNA(Complexity)Chipsurface(autofluorescence&non-spec.bkg)Attachmentchemistry/methodology(hyb.efficiency&crosshyb.)Hybridizationefficiency(lotsoffactors)Detectiontechnology(signaltype,efficiency,noise)

Oligo-Chip cDNA-Chip GenomicChip8nor20n<2,000n>50,000n sequencingexpressionexpressiongenomicanalysis當前22頁，總共76頁。基因芯片的種類ScienceChip：生物分析和診斷。NutriChip：食物分析、轉(zhuǎn)基因、污染檢測。LeukoChip：血液分析、病毒分析、HLA分析。AquaChip：水質(zhì)分析。SecureChip：含DNA的物質(zhì)鑒定。ChromoChip：基因分析和染色體序列。ProkaryoChip：原核生物、獸醫(yī)、環(huán)保等。當前23頁，總共76頁。生物芯片技術(shù)主要環(huán)節(jié)芯片制備：微點陣樣本制備：DNA提純、擴增、標記雜交：樣本與互補模板形成雙鏈檢測：共聚焦掃描，雙色激光數(shù)據(jù)處理：定量軟件，數(shù)據(jù)庫檢索，RNA印跡等。結(jié)果分析……

當前24頁，總共76頁。細胞對mRNA進行標記雜交基因表達資料生物芯片的制作步驟

當前25頁，總共76頁。生物芯片分析1、測定過程應包括五個基本步驟：需解決的生物學問題樣本制備生物化學反應檢測數(shù)據(jù)分析TumorSampleNormalSample當前26頁，總共76頁。2、生物學系統(tǒng)控制必須精確地與檢測目的相匹配。

3、生物學樣本必須精確地與生物學種類相匹配。

4、所有基因分析必須平行處理。

5、基因分析技術(shù)必須適合微型化和自動化。

6、平行格式必須精確的依據(jù)生物學樣本的次序。

7、檢測系統(tǒng)必須能精確地獲得數(shù)據(jù)。

8、檢測系統(tǒng)獲得的數(shù)據(jù)必須能被精確地控制和重復。當前27頁，總共76頁。9、兩種或以上平行數(shù)據(jù)組比較應受到單

個實驗所固有特性的限制。

10、絕對比例關(guān)系只存在于組合實驗的平

行數(shù)據(jù)組內(nèi)。

11、平行格式包括內(nèi)在和外部的整個系統(tǒng)

誤差的分析因素。

12、在每個系統(tǒng)模塊中采集到該系統(tǒng)所有

變量的四維數(shù)據(jù)時，才能稱為完成生

物系統(tǒng)平行基因分析。

當前28頁，總共76頁。生物芯片技術(shù)的12條原則只是一個基本框架。其術(shù)語的詳細定義和有關(guān)理論可參見

當前29頁，總共76頁。芯片制備原位合成法（insitusynthesis):又可分為原位光控合成法和原位標準試劑合成法。適用于寡核苷酸，使用光引導化學原位合成技術(shù)。是目前制造高密度寡核苷酸最為成功的方法。合成后交聯(lián)（post-syntheticattachment):利用手工或自動點樣裝置將預先制備好的寡核苷酸或cDNA樣品點在經(jīng)特殊處理過的玻片或其他材料上。主要用于診斷、檢測病原體及其他特殊要求的中、低密度芯片的制備。當前30頁，總共76頁。當前31頁，總共76頁。兩種制備方法比較原位合成：測序、查明點突變高密度、根據(jù)已知的DNA編制程序制作復雜、價格昂貴、不能測定未知DNA序列合成后交聯(lián)：比較分析制備方式直接和簡單，點樣的樣品可事先純化，交聯(lián)方式多樣，可設(shè)計和制備符合自己需要的芯片。中、低密度，樣品浪費較多且制備前需儲存大量樣品。當前32頁，總共76頁。雜交是芯片技術(shù)中除方陣構(gòu)建外最重要的一步液相中探針與DNA片段按堿基配對規(guī)則形成雙鏈反應。選擇雜交條件時，必須滿足檢測時的靈敏度和特異性。使能檢測到低豐度基因，且能保證每條探針都能與互補模板雜交。合適長度的DNA有利于與探針雜交。溫度、非特異性本底等均會影響雜交結(jié)果。最好在封閉循環(huán)條件下雜交，雜交爐。當前33頁，總共76頁。樣本制備制備高質(zhì)量樣本是困難的但又是極其重要的。制備細胞、組織或整個器官樣本應特別小心。溫度、激素和營養(yǎng)環(huán)境、遺傳背景、組織成分等輕微改變都會使基因表達的結(jié)果發(fā)生明顯變化。用于基因類型分析的樣本是DNA，用于表達研究的樣本是cDNA。樣本制備后應進行標記，通常為酶標記、熒光標記和核素標記。當前34頁，總共76頁。結(jié)果分析

芯片與標記的靶DNA或RNA雜交后，或與標記的靶抗原或抗體結(jié)合后，可采用下列方法分析處理數(shù)據(jù)：共聚焦掃描儀：應用最廣，重復性好但靈敏度較低。質(zhì)譜法：快速、精確，可準確判斷是否存在基因突變和精確判斷突變基因的序列位置。探針合成較復雜。化學發(fā)光、光導纖維、二極管方陣檢測、直接電荷變化檢測等。當前35頁，總共76頁。芯片掃讀裝置根據(jù)采用的光電偶合器件，分為光電倍增管型和CCD型。根據(jù)激光光源，可分為激光型和非激光型。應用最為廣泛的是激光光源的共聚焦掃描裝置，分辨率、靈敏度極高，有良好的定位功能，可定量，應用廣泛。當前36頁，總共76頁。圖象分析復雜的雜交圖譜一般需由圖象分析軟件來完成。分析軟件的功能：鑒定每個點陣、最大限度消除本底熒光的干擾、解析多種顏色圖象、可標記或排除假陽性、識別和分析對照實驗是否成功、可將信號標準化等。圖象處理軟件必須具備提取基因庫和數(shù)據(jù)庫的能力。當前37頁，總共76頁。質(zhì)量控制實驗對照：體外轉(zhuǎn)錄從cDNA合成mRNA，參入標本中作為對照。此mRNA不與點陣的核酸雜交。將不同濃度的不同基因參入標本中，可作為標本間標準化的參照。用兩種不同吸收光譜的熒光素同時分析兩個標本，如果兩種熒光強度一致，可排除標本間變異因素。用單一堿基錯配的寡核苷酸做對照可排除交叉雜交。

當前38頁，總共76頁。結(jié)果有效性的證實在表達矩陣上，有時難于區(qū)分極其相似的序列，如基因族成員，亞類或異類的存在。比較兩種不同DNA序列表達水平時，有些參數(shù)如核苷酸的成分、二級結(jié)構(gòu)的存在和矩陣上DNA的長度都會影響雜交。證實矩陣分析的結(jié)果可用RT-PCR(區(qū)別基因族成員,比較不同DNA種系表達,證實基因變異或突變和精確測定DNA表達水平)、NorthernBlot(證實某一基因的相對表達水平)、WesternBlot(RNA表達是否達到細胞中的蛋白水平)、質(zhì)譜儀(證實矩陣結(jié)果是否在蛋白水平)等。當前39頁，總共76頁。生物芯片技術(shù)的應用基因表達分析：腫瘤基因突變檢測：遺傳性疾病測序、基因圖繪制和多態(tài)性分析：測序微生物菌種鑒定：毒力基因、抗藥基因藥物研究：新藥篩選、指導合理用藥克隆選擇及文庫篩選當前40頁，總共76頁。生物芯片技術(shù)的發(fā)展發(fā)展趨勢微型化：DNA矩陣越來越小。集成化：矩陣上的基因組越來越大。多樣化：測定范圍越來越廣。微量化：測定所需樣本越來越少。全自動化：樣品制備到結(jié)果顯示全部分析過程。定量化：如激光捕獲技術(shù)，顯微解剖技術(shù)等可精確測定一個細胞內(nèi)的一個基因的表達。DNA矩陣數(shù)據(jù)信息庫的完善。當前41頁，總共76頁。生物芯片技術(shù)的發(fā)展技術(shù)毛細管電泳芯片技術(shù)PCR芯片技術(shù)(PCR-Chip)縮微芯片實驗室(lab-on-a-chip)微珠芯片技術(shù)(beadArray)抗體和蛋白質(zhì)陣列技術(shù)(Antibodyandprotein-arraytechnology)自我定制芯片技術(shù)（makeyourownchip)血氣分析芯片當前42頁，總共76頁。毛細管電泳芯片技術(shù)Mathies最早報道毛細管電泳芯片測序結(jié)果，在10分鐘內(nèi)完成了對433個堿基序列的測定。賓夕法尼亞大學Wilding等成功地利用毛細管電泳芯片分離了用于診斷杜鑫-貝克肌萎縮的多條DNA片段。瑞士Ciba-Geigy公司和加拿大Alberta大學合作利用玻璃毛細管電泳芯片完成了對寡核苷酸的分離。當前43頁，總共76頁?？s微芯片實驗室在一張芯片上完成樣品(如血液、組織等)制備、化學反應、檢測和數(shù)據(jù)分析。1998年程京博士首次應用LOC實現(xiàn)了從樣品制備到反應結(jié)果顯示的全部過程，成果地從混有大腸桿菌的血清中分離出了細菌。含有加熱器、微泵微閥、微流量控制器、電子化學和電子發(fā)光探測器的芯片已經(jīng)問世。也已出現(xiàn)樣品制備、化學反應和分析檢測部分結(jié)合的芯片。LOC與衛(wèi)星傳輸和網(wǎng)絡(luò)生物信息學結(jié)合，將實現(xiàn)高通量、一體化和移動性的“未來型掌上實驗室”的構(gòu)想。當前44頁，總共76頁?？贵w和蛋白質(zhì)陣列技術(shù)蛋白質(zhì)組學(protiomics)的興起，促進了抗體和蛋白質(zhì)陣列技術(shù)的發(fā)展。PareickBrown使用特異性抗體微矩陣，測定了細胞和體液樣本中數(shù)千種不同的蛋白質(zhì)。Leuking等采用蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)，測定了10pg的微量蛋白質(zhì)，并證實假陽性極低。當前45頁，總共76頁。乳腺癌基因芯片當前46頁，總共76頁。Stanford乳腺癌微矩陣(Perouetal.1999)每種基因的數(shù)據(jù)以行表示，每個實驗用列表示。顏色強度表示對照和實驗cDNA的比率。比率相同時為1。結(jié)果為紅色表示mRNA增加，綠色表示減少，灰白色表示缺乏。兩種基因的相似性用Pearson相關(guān)公式或Euclidian測距公式計算。當前47頁，總共76頁。DNA微矩陣分析軟組織肉瘤表達

KavineMaillardetal(1999)cDNAs進行DNA表達矩陣，PCR產(chǎn)物包被在經(jīng)賴氨酸處理的玻片上，用Cys3-和Cys5-標記的cDNA進行雜交，洗滌后用Scanarray3000掃描儀測定矩陣，表達數(shù)據(jù)儲存在ACeDB數(shù)據(jù)庫中，根據(jù)數(shù)據(jù)表達類型區(qū)分不同的基因。當前48頁，總共76頁。微矩陣分析DNA和蛋白表達

HolgerEickhoffetal.(1999)根據(jù)已有的序列數(shù)據(jù)，組合800000人類EST序列，已重矩陣了38000克隆用于RNA表達分析，克隆經(jīng)PCR擴增后共價結(jié)合于玻片上，每張玻片固定19200個基因片段，標記人組織RNAs與被選的38000人基因片段的矩陣進行雜交，比較健康與疾病組織的圖象，用軟件分析點識別和點定量。使用寡聚核苷酸鑒定新的cDNA克隆，和進入表達載體，使相應蛋白能直接表達，矩陣后可分析蛋白-蛋白和蛋白-DNA的關(guān)系。當前49頁，總共76頁。生物芯片相關(guān)儀器點陣儀：制備芯片。點樣針分為實心和空心兩種，點樣方式有非接觸噴點和接觸點樣兩種。雜交儀：全自動完成調(diào)節(jié)、加探針、漂洗和熱循環(huán)的雜交過程。掃描儀：激光共聚焦或CCD直接成像分析結(jié)果。當前50頁，總共76頁。當前51頁，總共76頁。當前52頁，總共76頁。當前53頁，總共76頁。當前54頁，總共76頁。QBot超高解析基因篩選暨排列分析儀?；蚓浜Y選(ColonyPicking)：3500/h基因排列打點(Gridding)：100000/h基因復制(Replication)：9696,96384基因重新排列(Re-Arraying)：正確的基因置復制盤基因微矩陣排列(Micro-Arraying)：20000/片全自動液體分注系統(tǒng)(LiquidHandling):96針，注液量1200l，適合PCR產(chǎn)物。分析軟件：分析、質(zhì)控、上網(wǎng)。環(huán)境控制：紫外線照射、空氣濾網(wǎng)、陽極處理鋁板當前55頁，總共76頁。當前56頁，總共76頁。QPix半敞開式基因篩選暨排列分析儀(經(jīng)濟型)基因菌落篩選(ColonyPicking)：3500/h基因排列打點(Gridding)：100000/h基因復制(Replication)：9696,96384基因重新排列(Re-Arraying)：正確的基因置復制盤基因微矩陣排列(Micro-Arraying)：20000/